催化秦皮甲素酯交換反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞催化劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)、生物催化及生物醫(yī)藥制備領(lǐng)域，涉及催化秦皮甲素酯交換反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞催化劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃酮類化合物是兩個苯環(huán)通過三個碳原子相互連接而形成的一系列重要的多酚類化合物，廣泛存在于幾乎所有的植物，尤其是蔬菜和水果；在醫(yī)藥、食品和化妝品上有很大的應(yīng)用價值。黃酮有多種生物活性包括抗氧化活性，抗炎，抗癌的，抗菌，抗過敏，和抗病毒等，然而，由于其多羥基結(jié)構(gòu)的特點，大部分黃酮生物活性受限于其低脂溶性或水溶性。位于苯環(huán)或配糖體骨架上的羥基對黃酮的生物和化學(xué)活性有重要的影響。黃酮的酯化被認(rèn)為一種很有前景的方法用于提高黃酮的溶解度，從而使黃酮展示出更多的生理活性。已有研宄表明，有選擇地修飾黃酮類化合物結(jié)構(gòu)不僅可以提高物理化學(xué)屬性，例如，熱穩(wěn)定性和光阻系數(shù)；而且增強(qiáng)其生物活性，如抗氧化活性；抗菌活性；細(xì)胞滲透能力；減肥和降血脂功能等。秦皮甲素具有抗炎、抗菌、抗血凝、鎮(zhèn)痛等活性。
[0003]目前黃酮酯類衍生物的合成均采用化學(xué)催化劑或者離體酶催化劑。由于黃酮的苯環(huán)或糖環(huán)上羥基眾多，且反應(yīng)活性相似，采用化學(xué)催化劑時存在的主要問題是反應(yīng)區(qū)域選擇性很低，易產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物及含堿廢液，對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。酶催化劑較之化學(xué)催化劑更為綠色，且區(qū)域選擇性高，反應(yīng)條件溫和，但是由于酶的分離純化過程復(fù)雜且在此過程中酶活性有部分損失，在立體環(huán)境中不穩(wěn)定，易失活等缺點，且酶的價格昂貴，造成酶法反應(yīng)成本較高，這些方面均嚴(yán)重制約了其在工業(yè)化的應(yīng)用。因此，研宄開發(fā)新型綠色催化劑用于黃酮酯的制備具有重大的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有用于秦皮甲素酯合成的催化劑的不足，目的在于提供一種新型的具有催化秦皮甲素酯合成反應(yīng)的細(xì)菌催化劑的制備方法。
[0005]本發(fā)明的一種可催化秦皮甲素酯合成反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞催化劑的制備方法，其制備方法簡單易操作，原材料價廉易購買，不涉及酶的分離純化。所制備的細(xì)菌細(xì)胞催化劑可選擇性催化合成秦皮甲素V -單酯，區(qū)域選擇性高于90%，從而克服了傳統(tǒng)化學(xué)方法的選擇性低導(dǎo)致底物利用率低，產(chǎn)物純度低，易生成副產(chǎn)物等缺點。同為綠色，反應(yīng)條件溫和的生物催化劑，細(xì)胞催化劑較之離體酶催化劑具有穩(wěn)定性高，價廉、易獲取的優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
一種催化秦皮甲素酯合成反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞催化劑的制備方法，包括以下步驟:
1)將細(xì)菌種子液按照接種量為0.5%~25% (v/v)接種至液體培養(yǎng)基中，在25°C -60°C下培養(yǎng)12 h~96 h ；
2)菌體經(jīng)蒸餾水洗滌后真空冷凍干燥收獲菌體干粉，即為細(xì)菌細(xì)胞催化劑。
[0007]上述方法中，細(xì)菌包括施氏假單胞菌stutzeri或銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa ο
[0008]上述方法中，所述液體培養(yǎng)基成分為:0.1-100 g/L產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，0.1-50 g/L有機(jī)氮源，0.1 -10 g/L MgSO4.7Η20, 5 g/L (NH4)2SO4和 I g/L K2HPO40
[0009]上述方法中，所述產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑包括飽和植物油脂、不飽和植物油脂、Tween系列或Span系列中的一種以上；所述Tween系列包括Tween80或Tween60 ;所述Span系列為Span60 或 Span 40。
[0010]上述方法中，所述有機(jī)氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸水解酪蛋白胨或無氨基酵母膏中的一種以上。
[0011]本發(fā)明所用細(xì)菌公眾可以從菌種中心購買或自己篩選得到。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點:
1.細(xì)菌細(xì)胞催化劑為生物催化劑，較之化學(xué)催化劑反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好，區(qū)域選擇性高，選擇性合成秦皮甲素的6’’-單酯，其區(qū)域選擇性在95%以上，從而克服了傳統(tǒng)化學(xué)方法產(chǎn)物純度低，易生成副產(chǎn)物等缺點。
[0013]2.細(xì)菌細(xì)胞催化劑營養(yǎng)要求很低，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方簡單，制備易操作，制備成本低。
【具體實施方式】
[0014]為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明，需要說明的是，這些實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0015]實施例1
將包括銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.￥辨巾子液轉(zhuǎn)接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為25°C，液體培養(yǎng)基成分為:10 g/L大豆油，I g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7.0。培養(yǎng) 60h 后離心收集濕菌體，用蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素與丙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中，6’ ’ -秦皮甲素丙酯為95.3%。
[0016]本發(fā)明方法得到的催化劑的區(qū)域選擇性以秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯區(qū)域選擇性?；磻?yīng)進(jìn)行測定，反應(yīng)條件為在2mL的秦皮甲素酯化反應(yīng)體系中添加40mg的菌體干粉作為催化劑，以131.6 μ L丙酸乙烯酯作為?；w，秦皮甲素用量為20.9mg，反應(yīng)體系為50% ( v/v)吡啶-異辛烷，反應(yīng)溫度為40°C，振蕩速度180rpm，常壓下反應(yīng)。反應(yīng)區(qū)域選擇性表征為:6’ ’ -秦皮甲素丙酯的產(chǎn)量/黃酮酯的總產(chǎn)量。
[0017]實施例2
將包括銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.￥辨巾子液轉(zhuǎn)接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為60°C，液體培養(yǎng)基成分為:10 g/L Tween 80，Ig/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7.0。培養(yǎng) 60h 后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯的?；磻?yīng)中，6’ ’ -秦皮甲素丙酯區(qū)域選擇性為95.4%。
[0018]實施例3
將包括銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.￥辨巾子液轉(zhuǎn)接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為25% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C，液體培養(yǎng)基成分為:10 g/L Tween 80，10g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 6.8。培養(yǎng) 12h 后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯的?；磻?yīng)中，6’’ -秦皮甲素丙酯區(qū)域選擇性為98.1%。
[0019]實施例4
將包括銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.￥辨巾子液轉(zhuǎn)接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為25% (v/v)，培養(yǎng)條件為40°C，液體培養(yǎng)基成分為:10 g/L Tween 80，10g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 6.8。培養(yǎng) 96h 后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯的?；磻?yīng)中，6’ ’ -秦皮甲素丙酯區(qū)域選擇性為98.8%。
[0020]實施例5
將包括施氏假單胞菌stutzeri ^/#2.子液轉(zhuǎn)接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C，液體培養(yǎng)基成分為:100 g/L Tween 80，10g/L 牛肉膏，0.2 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 6.8。培養(yǎng) 60h 后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯的?；磻?yīng)中，6’ ’ -秦皮甲素丙酯區(qū)域選擇性為98.5%。
[0021]實施例6
將包括施氏假單胞菌stutzeri ^/#2.子液轉(zhuǎn)接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C，液體培養(yǎng)基成分為:100 g/L大豆油，I g/L酵母膏，0.2 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 6.8。培養(yǎng) 60h 后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯的?；磻?yīng)中，6’ ’ -秦皮甲素丙酯區(qū)域選擇性為96.4%。
[0022]實施例7
將施氏假單胞菌AewtZofflmas stutzeri ^/#2.刺1子液轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C，液體培養(yǎng)基成分為:0.1 g/L葡萄糖，30 g/L酵母膏，50 g/L 牛肉膏，0.5 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4，pH 為 7.3。培養(yǎng)12h后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯的?；磻?yīng)中，6’’-秦皮甲素丙酯區(qū)域選擇性為97.5%。
[0023]實施例8
將包括施氏假單胞菌stutzeri ^/#2.子液轉(zhuǎn)接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為40°C，液體培養(yǎng)基成分為:0.1 g/L span 60, 10g/L 酵母膏，0.2 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 6.8。培養(yǎng) 48h 后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細(xì)胞催化劑。該細(xì)胞催化劑用于秦皮甲素半水化合物與丙酸乙烯酯的酰化反應(yīng)中，6’ ’ -秦皮甲素丙酯區(qū)域選擇性為97.9%。
[0024]本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種催化秦皮甲素酯交換反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞催化劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將細(xì)菌種子液按照接種量為0.5%~25% (v/v)接種至液體培養(yǎng)基中，在25°C -60°C下培養(yǎng)12 h~96 h ； 2)菌體經(jīng)蒸餾水洗滌后真空冷凍干燥收獲菌體干粉，即為細(xì)菌細(xì)胞催化劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，細(xì)菌包括施氏假單胞菌Pseudotnoimsstutzeri 或?同綠?暖單月包菌 Pseudomonas aeruginosa 0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基成分為:0.1-100 g/L 產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，0.1~50 g/L 有機(jī)氮源，0.1 -10 g/L MgSO4.7Η20, 5 g/L (NH4)2SO4^P I g/LK2HPO40
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑包括飽和植物油脂、不飽和植物油脂、Tween系列或Span系列中的一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸水解酪蛋白胨或無氨基酵母膏中的一種以上。
【專利摘要】本發(fā)明公開了催化秦皮甲素酯交換反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞催化劑的制備方法。該方法是將細(xì)菌種子液按照接種量為0.5%~25%（v/v）接種至液體培養(yǎng)基中，在25℃~60℃下培養(yǎng)12 h~96 h；菌體經(jīng)蒸餾水洗滌后真空冷凍干燥收獲菌體干粉，即為細(xì)菌細(xì)胞催化劑。該催化劑用于高選擇性催化秦皮甲素與?；噭┌l(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。本發(fā)明所獲得的細(xì)菌全細(xì)胞催化劑，與酶制劑相比，避免了昂貴與冗繁的酶分離純化過程；易于制備與回收的特點更加有利于規(guī)?；a(chǎn)；在有機(jī)溶劑中更加穩(wěn)定。
【IPC分類】C12P19-60, C12N1-20, C12R1-38, C12R1-385
【公開號】CN104726375
【申請?zhí)枴緾N201510118639
【發(fā)明人】李曉鳳, 賴學(xué)能, 趙光磊, 吳暉, 余以剛
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月18日