本發(fā)明涉及包括基因的鑒定方法、食品和化妝品中致病菌的檢測方法，特別涉及即食性食品中致病菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
民以食為天，食品安全是社會和諧的基礎(chǔ)支柱之一。在食品和化妝品方面，尤其在即食性食品領(lǐng)域，致病菌檢測是食品安全重要指標(biāo)之一。參考疾控防治數(shù)十年來的經(jīng)驗(yàn)積累，當(dāng)前在各種產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和各級食藥監(jiān)監(jiān)抽細(xì)則中，即食性食品的致病菌檢測項(xiàng)目，大多為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌兩種；主要成分為畜禽產(chǎn)品的增加單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測；主要成分為水產(chǎn)品的增加副溶血性弧菌檢測。
金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)在環(huán)境中普遍存在，對食品的污染幾率較大，人感染后表現(xiàn)為局部化膿感染，也可引起腸炎、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。在我國引發(fā)的食物中毒事件有2001年4月12日無錫市錫山區(qū)所轄小學(xué)和幼兒園因課間加餐飲用了被st.aureus污染的袋裝牛奶飲料導(dǎo)致食物中毒事件等。
腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)為沙門氏菌屬主要種，包括多種常見的致病血清型(sa.entericaserovarcholeraesuis,enteritidis,paratyphi,typhi,andtyphimurium,etc.)，多見于糞便、土壤、食品、水中，存活周期5個(gè)月至2年，人感染后表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛、頭痛、畏寒和腹瀉等癥狀，平均致死率4.1％。由于飲食習(xí)慣差異，沙門氏菌在歐美導(dǎo)致的食物中毒事件較多，2008年6月、2010年8月、2013年10月，在美國均有上百例以上的大規(guī)模疫情，起因有食用生西紅柿、未熟雞蛋、未熟雞肉等。
單核細(xì)胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)在土壤、水體、植物(飼料)中廣泛存在，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓；人感染后表現(xiàn)為輕微流感癥狀、呼吸急促，也可引起嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥直至死亡。1999年底和2011年9月分別在美國密歇根州和科羅拉多州導(dǎo)致了兩起食物中毒事件，均有十余人死亡。
副溶血性弧菌(vibrioparahemolyticus)主要來源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品，感染途徑通常為食用了生鮮、未熟透或腌制的水產(chǎn)品，表現(xiàn)為食源性疾病散發(fā)病例，臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。2017年5月在我國浙江檢驗(yàn)檢疫局就已確診兩例因食用生鮮海鮮導(dǎo)致的感染病例。
在利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定食品和化妝品中致病菌的方法研究中，通過pcr技術(shù)擴(kuò)增并檢測致病菌特異性基因，是近十余年來新興方法之一，在學(xué)術(shù)、檢測和臨床上得到廣泛應(yīng)用。常規(guī)pcr技術(shù)在該領(lǐng)域具有如下幾個(gè)特點(diǎn)：①大多數(shù)待測微生物可以提取到dna；②設(shè)計(jì)合理的引物對可特異性地識別目的致病菌基因；③核心設(shè)備為pcr儀。
常規(guī)pcr為第一代pcr技術(shù)，而第二代pcr技術(shù)為實(shí)時(shí)定量熒光pcr(以下簡稱熒光pcr)。熒光pcr擴(kuò)增時(shí)，在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，每擴(kuò)增一條dna鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步。相對常規(guī)pcr具有如下特點(diǎn)：①特異性探針的加入，進(jìn)一步提升了整個(gè)pcr擴(kuò)增的特異性；②pcr擴(kuò)增過程即檢測過程，反應(yīng)結(jié)束即可獲得檢測結(jié)果，整體檢測時(shí)間更短；③核心設(shè)備為實(shí)時(shí)定量熒光pcr儀。
多重實(shí)時(shí)定量熒光pcr(以下簡稱多重?zé)晒鈖cr)屬于實(shí)時(shí)定量熒光pcr的一種，首先針對多個(gè)目的基因，逐項(xiàng)設(shè)計(jì)特異性的引物對和探針序列；接著在多個(gè)探針上分別標(biāo)記不同波長的熒光基團(tuán)及淬滅基團(tuán)，從而可以對一個(gè)pcr反應(yīng)管內(nèi)的dna模板同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目的基因的熒光pcr擴(kuò)增并發(fā)出不同波長的熒光信號，被多通道實(shí)時(shí)定量熒光pcr儀中的多波長檢測器捕獲，達(dá)到同時(shí)檢測多個(gè)目的基因的要求。相對普通的熒光pcr有如下優(yōu)點(diǎn)：①每增加一套引物對和探針即可將檢測效率提升一倍、并將其他試劑成本降低一倍；②核心設(shè)備為多通道實(shí)時(shí)定量熒光pcr儀。
中國專利數(shù)據(jù)庫中涉及致病菌檢測的pcr技術(shù)的專利申請件已有百余件，但多為普通pcr方法。僅有幾種為多重?zé)晒鈖cr方法，如200410091917.3《多重?zé)晒鈖cr-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法》、200810071105.0《食源性致病菌的檢測方法》、201410057135.1《一種基于多色上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記同時(shí)檢測三種食源性致病菌的方法》等。這些專利類似于學(xué)術(shù)文章，其試劑種類繁多、操作步驟復(fù)雜、對實(shí)驗(yàn)人員技能要求高，更適于科研領(lǐng)域；對于普通檢測單位來說，每年食品中致病菌檢測批次數(shù)以萬計(jì)、檢測人員能力參差不齊，對試劑成本、操作簡便化、方法標(biāo)準(zhǔn)化等方面提出了更高要求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種檢測金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、副溶血性弧菌(vibrioparahemolyticus)4種致病菌的四重?zé)晒鈖cr方法，以解決食品和化妝品，尤其是即食性食品中上述致病菌的檢測問題。
發(fā)明人提供的檢測st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的四重?zé)晒鈖cr方法，具有如下4個(gè)要素，即：樣品dna、一對通用引物和四條探針、熒光pcr預(yù)混液、陽性對照；發(fā)明特點(diǎn)是根據(jù)st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的16srrna基因設(shè)計(jì)引物和探針，僅能對目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增并激發(fā)相應(yīng)的熒光信號，對非目標(biāo)序列無擴(kuò)增和熒光信號；將待測樣品dna進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增的試劑配方和擴(kuò)增條件制成試劑盒；具體的做法包括：
第一步，建立檢測st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的四重?zé)晒鈖cr引物和探針體系；
第二步，建立檢測st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的四重?zé)晒鈖cr試劑盒；
第三步，確定檢測st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的四重?zé)晒鈖cr鑒定方法，即以待測樣品dna為模板，利用所述的四重?zé)晒鈖cr引物體系，在可同時(shí)檢測fam、vic、tarma、cy5熒光激發(fā)基團(tuán)和mgb熒光淬滅基團(tuán)的四通道及以上的多重?zé)晒鈖cr儀上進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。
上述檢測st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的四重?zé)晒鈖cr引物體系見附錄：序列1為st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的通用上游引物，序列2為st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的通用下游引物，序列3為st.aureus特異性探針，序列4為sa.enterica特異性探針，序列5為l.monocytogenes特異性探針，序列6為v.parahemolyticus特異性探針。序列3、4、5、6在5’端分別用fam、vic、tarma、cy5熒光激發(fā)基團(tuán)修飾，3’端均為mgb熒光淬滅基團(tuán)修飾。
上述檢測st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的四重?zé)晒鈖cr試劑盒成分如下所示：
①引物溶液：包括序列1、2所示引物，濃度均為20μmol/l，使用1.5ml無色透明離心管封裝；
②探針溶液：包括序列3、4、5、6所示探針，濃度均為10μmol/l，使用1.5ml棕色不透明離心管封裝；
③熒光pcr試劑：經(jīng)驗(yàn)證可適用于所述的四重?zé)晒鈖cr引物體系的外購的試劑套裝，包括熒光pcr預(yù)混液、rox染料、三蒸水；
④陽性對照：包括含有序列1和序列2所示引物擴(kuò)增目的片段的st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus源性dna，濃度均為105拷貝/μl左右，使用1.5ml無色透明離心管封裝。
上述檢測st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的四重?zé)晒鈖cr鑒定方法中，所述待測樣品dna來源：對于待測食品樣品，可先取樣進(jìn)行增菌，然后對增菌培養(yǎng)物通過裂解法、試劑法、柱膜法、磁珠法等分子生物學(xué)dna提取方法或外購商品化試劑盒，提取樣品dna；所述多重?zé)晒鈖cr儀上進(jìn)行擴(kuò)增和檢測的方法是選擇25μl或50μl體系進(jìn)行反應(yīng)液配制，再設(shè)置反應(yīng)條件，按判定條件進(jìn)行結(jié)果判定；所述判定條件包括：
①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照的fam、vic、tarma、cy5熒光信號有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0；陰性對照和空白對照無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0。
②陽性樣品：當(dāng)①成立時(shí)，fam或/和vic或/和tarma或/和cy5有熒光對數(shù)增長，且ct值≤35.0，表明該樣品檢出st.aureus或/和sa.enterica或/和l.monocytogenes或/和v.parahemolyticus。
③陰性樣品：當(dāng)①成立時(shí)，fam或/和vic或/和tarma或/和cy5無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0，表明該樣品未檢出st.aureus或/和sa.enterica或/和l.monocytogenes或/和v.parahemolyticus。
④疑似樣品：當(dāng)①成立時(shí)，fam或/和vic或/和tarma或/和cy5有熒光對數(shù)增長，且35.0<ct值<40.0，重復(fù)檢測一次。復(fù)檢結(jié)果ct值≥40.0，表明該樣品未檢出st.aureus或/和sa.enterica或/和l.monocytogenes或/和v.parahemolyticus；復(fù)檢結(jié)果ct值<40.0，表明該樣品檢出st.aureus或/和sa.enterica或/和l.monocytogenes或/和v.parahemolyticus。
上述反應(yīng)液配制如表1所示：
表1反應(yīng)液配方
注1：當(dāng)熒光pcr儀需要rox染料校準(zhǔn)時(shí)加入相應(yīng)濃度，否則不應(yīng)添加，具體要求見熒光pcr儀說明書。
注2：陽性對照為所述試劑盒成分“陽性對照”，陰性對照為非st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus源性dna或三蒸水，空白對照為三蒸水。
上述設(shè)置的反應(yīng)條件如表2所示：
表2反應(yīng)條件
注1：生物熱敏抗體為20–120s；化學(xué)熱敏抗體為10–15min。
注2：檢測熒光信號。
本發(fā)明相對多重pcr方法具有標(biāo)準(zhǔn)誤差更小(標(biāo)準(zhǔn)3kbp質(zhì)粒初始濃度為105級時(shí)，定量標(biāo)準(zhǔn)誤差在104級)、檢測時(shí)間更短(上機(jī)1h左右出具檢測結(jié)果)、產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)更少(熒光染料用量為ng/μl級)的優(yōu)點(diǎn)；相對熒光pcr方法具有同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)基因、節(jié)約試劑成本的優(yōu)點(diǎn)；相對普通pcr方法，兼具上述兩種優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的試劑盒在選用適于四重?zé)晒鈖cr引物體系的外購的試劑套裝時(shí)，選擇帶熱敏taq抗體的型號，抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，延長試劑盒保存時(shí)間、允許更多的凍融次數(shù)；外購的試劑套裝中包括rox染料，對于需要rox染料的多重?zé)晒鈖cr儀可提升檢測準(zhǔn)確性。
本發(fā)明方法已應(yīng)用于貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院日常相關(guān)檢測中(檢出限104cfu/ml)，在省內(nèi)同行業(yè)檢測單位也已驗(yàn)證通過，上百批次樣品無漏檢、誤檢情況，與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果相同；實(shí)踐表明，本發(fā)明相對標(biāo)準(zhǔn)方法節(jié)約操作時(shí)間3/4以上、節(jié)約試劑成本3/4以上，具有一定實(shí)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1自制樣品
制樣：在本地大型超市購買奶粉，按其說明書所示，取適量奶粉溶于100ml已滅菌的超純水中制成復(fù)原乳，分別制作3份。
①將第1份作為檢測樣品：對該復(fù)原乳依次接種st.aureus(cicc21648)、sa.enterica(cicc21490)、l.monocytogenes(cicc21633)、v.parahemolyticus(cicc21617)等標(biāo)準(zhǔn)菌株并均質(zhì)。
②將第2份作為陰性對照：對該復(fù)原乳依次接種出血性大腸埃希氏菌o157:h7(enterohemorrhagee.colio157:h7,cicc21530)、宋氏志賀氏菌(shigellasonnei,cicc21535)、阪崎腸桿菌(bntorobatersakazakii,cicc21560)、蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus,cicc10876)、空腸彎曲菌(campylobacterjejuni,cicc33291)等標(biāo)準(zhǔn)菌株并均質(zhì)。
③將第3份作為加標(biāo)對照：對該復(fù)原乳依次接種st.aureus(cicc21648)、sa.enterica(cicc21490)、l.monocytogenes(cicc21633)、v.parahemolyticus(cicc21617)，eheco157:h7(cicc21530)、sh.sonnei(cicc21535)、bn.sakazakii(21560)、ba.cereus(cicc10876)、c.jejuni(cicc33291)等標(biāo)準(zhǔn)菌株并均質(zhì)。
增菌：對上述檢測樣品、陰性對照、加標(biāo)對照進(jìn)行增菌。
①將檢測樣品分取25ml至均為225ml的7.5％氯化鈉肉湯(st.aureus增菌培養(yǎng)基，下同)、緩沖蛋白胨水(sa.enterica增菌培養(yǎng)基，下同)、李氏增菌肉湯lb1(l.monocytogenes增菌培養(yǎng)基，下同)、氯化鈉堿性蛋白胨水(v.parahemolyticus增菌培養(yǎng)基，下同)中，分別于36℃培養(yǎng)18h、36℃培養(yǎng)8h、30℃培養(yǎng)24h、36℃培養(yǎng)8h進(jìn)行增菌，時(shí)間先到者放4℃冰箱暫存，全部培養(yǎng)結(jié)束后將4種增菌液混合均質(zhì)。
②將陰性對照、加標(biāo)對照按照①中增菌方法進(jìn)行增菌及混合均質(zhì)。
dna提取流程：使用外購dna提取試劑盒(abimagmaxtmdnaisolationkit)，在abimagmaxtmexpress-96磁珠抽提儀上提取樣品dna，并于-20℃保存。
①檢測樣品的dna純度為od260/od280＝1.80、dna濃度為350.51ng/μl。
②陰性對照的dna純度為od260/od280＝1.79、dna濃度為384.08ng/μl。
③加標(biāo)對照的dna純度為od260/od280＝1.81、dna濃度為309.08ng/μl。
之后將檢測樣品、陰性對照、加標(biāo)對照的dna稀釋至100ng/μl進(jìn)行檢測，引物溶液、探針溶液和陽性對照為本專利所述的試劑盒主要成分，空白對照為三蒸水，外購的熒光pcr試劑為abipath-idtmqpcrmastermix，按表3進(jìn)行配制，按表4設(shè)置相關(guān)參數(shù)上機(jī)檢測(abi熒光pcr儀，型號為quantstudio5)。
表3反應(yīng)體系
表4反應(yīng)條件
注*：檢測熒光信號。
檢測結(jié)果見表5：
①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照的fam、vic、tarma、cy5熒光信號有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0；陰性對照和空白對照無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0。
②檢測樣品：fam、vic、tarma、cy5均有熒光對數(shù)增長，且ct值≤35.0，表明該樣品檢出st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus。
③加標(biāo)對照：fam、vic、tarma、cy5均有熒光對數(shù)增長，且ct值≤35.0；結(jié)合陰性對照無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0的結(jié)果，表明了本申請件方法的特異性和抗干擾性。
④比對結(jié)果：與按照gb4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》(下同)、gb4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》(下同)、gb4789.30-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)》(下同)、gb4789.7-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》(下同)對樣品進(jìn)行st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus檢測的結(jié)果相符。
表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例2國家監(jiān)督抽查風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測樣品---生牛乳的檢測
將待測生牛乳分取25ml至均為225ml的7.5％氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水、李氏增菌肉湯lb1、氯化鈉堿性蛋白胨水中，分別于36℃培養(yǎng)18h、36℃培養(yǎng)8h、30℃培養(yǎng)24h、36℃培養(yǎng)8h進(jìn)行增菌，時(shí)間先到者放4℃冰箱暫存，全部培養(yǎng)結(jié)束后將4種增菌液混合均質(zhì)。
使用外購dna提取試劑盒(天根細(xì)菌dna提取試劑盒)提取混合增菌液dna，dna純度為od260/od280＝1.79、dna濃度為262.45ng/μl，-20℃保存。之后將dna稀釋至100ng/μl進(jìn)行檢測，引物溶液、探針溶液和陽性對照為本專利所述的試劑盒主要成分，陰性對照為動物源性dna、空白對照為三蒸水，外購的熒光pcr試劑為天根superrealpremix(probe)，按表6進(jìn)行配制，按表7設(shè)置相關(guān)參數(shù)上機(jī)檢測(abi熒光pcr儀，型號為7500fast)。
表6反應(yīng)體系
表7反應(yīng)條件
注*：檢測熒光信號。
檢測結(jié)果見表8：
①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照的fam、vic、tarma、cy5熒光信號有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0；陰性對照和空白對照無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0。
②檢測樣品：fam有熒光對數(shù)增長，且ct值≤35.0，表明該樣品檢出st.aureus。vic、tarma、cy5無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0，表明該樣品未檢出sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus。
③比對結(jié)果：與按照gb4789.10-2016、gb4789.4-2016、gb4789.30-2016、gb4789.7-2013對樣品進(jìn)行st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus檢測的結(jié)果相符。
表8實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例3省級監(jiān)督抽查檢測樣品---冷凍雞肉的檢測
將待測雞肉絞碎并分取25g至均為225ml的7.5％氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水、李氏增菌肉湯lb1、氯化鈉堿性蛋白胨水中，分別于36℃培養(yǎng)18h、36℃培養(yǎng)8h、30℃培養(yǎng)24h、36℃培養(yǎng)8h進(jìn)行增菌，時(shí)間先到者放4℃冰箱暫存，全部培養(yǎng)結(jié)束后將4種增菌液混合均質(zhì)。
使用外購dna提取試劑盒(takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0)提取混合增菌液dna，dna純度為od260/od280＝1.80、dna濃度為280.03ng/μl，-20℃保存。之后將dna稀釋至100ng/μl進(jìn)行檢測，引物溶液、探針溶液和陽性對照為本專利所述的試劑盒主要成分，陰性對照為動物源性dna、空白對照為三蒸水，外購的熒光pcr試劑為takarapremixextaqtm(probeqpcr)，按表9進(jìn)行配制，按表10設(shè)置相關(guān)參數(shù)上機(jī)檢測(abi熒光pcr儀，型號為7500fast)。
表9反應(yīng)體系
表10反應(yīng)條件
注*：檢測熒光信號。
檢測結(jié)果見表11：
①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照的fam、vic、tarma、cy5熒光信號有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0；陰性對照和空白對照無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0。
②檢測樣品：vic有熒光對數(shù)增長，且ct值≤35.0，表明該樣品檢出sa.enterica。fam、tarma、cy5無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0，表明該樣品未檢出st.aureus、l.monocytogenes、v.parahemolyticus。
③比對結(jié)果：與按照gb4789.10-2016、gb4789.4-2016、gb4789.30-2016、gb4789.7-2013對樣品進(jìn)行st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus檢測的結(jié)果相符。
表11實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例4企業(yè)委托樣品---速凍餃子的檢測
配料表包括：小麥粉、水、豬肉、木耳、香菇、洋蔥、大豆蛋白、醬油、蝦米、芝麻油、精煉植物油、食鹽、白砂糖、淀粉、香辛料、味精。將待測餃子絞碎并分取25g至均為225ml的7.5％氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水、李氏增菌肉湯lb1、氯化鈉堿性蛋白胨水中，分別于36℃培養(yǎng)18h、36℃培養(yǎng)8h、30℃培養(yǎng)24h、36℃培養(yǎng)8h進(jìn)行增菌，時(shí)間先到者放4℃冰箱暫存，全部培養(yǎng)結(jié)束后將4種增菌液混合均質(zhì)。
使用外購dna提取試劑盒(toyobo
表12反應(yīng)體系
表13反應(yīng)條件
注*：檢測熒光信號。
檢測結(jié)果見表14：
①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照的fam、vic、tarma、cy5熒光信號有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0；陰性對照和空白對照無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0。
②檢測樣品：tarma有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0，表明該樣品檢出l.monocytogenes。fam、vic、cy5無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0，表明該樣品未檢出st.aureus、sa.enterica、v.parahemolyticus。
③比對結(jié)果：與按照gb4789.10-2016、gb4789.4-2016、gb4789.30-2016、gb4789.7-2013對樣品進(jìn)行st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的檢測結(jié)果相符。
表14實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例5個(gè)人委托樣品---生蠔的檢測
將待測生蠔肉剪碎并分取25g至均為225ml的7.5％氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水、李氏增菌肉湯lb1、氯化鈉堿性蛋白胨水中，分別于36℃培養(yǎng)18h、36℃培養(yǎng)8h、30℃培養(yǎng)24h、36℃培養(yǎng)8h進(jìn)行增菌，時(shí)間先到者放4℃冰箱暫存，全部培養(yǎng)結(jié)束后將4種增菌液混合均質(zhì)。
使用外購dna提取試劑盒(名稱：上海生工細(xì)菌基因組dna快速抽提試劑盒)提取混合增菌液dna，dna純度為od260/od280＝1.81、dna濃度為277.27ng/μl，-20℃保存。之后將dna稀釋至100ng/μl進(jìn)行檢測，引物溶液、探針溶液試劑和陽性對照為本專利所述的試劑盒主要成分，陰性對照為植物源性dna、空白對照為三蒸水，外購的熒光pcr試劑為上海生工sgexcelgoldstartaqmanmixture，按表15進(jìn)行配制，按表16設(shè)置相關(guān)參數(shù)上機(jī)檢測(abi熒光pcr儀，型號為7500fast)。
表15反應(yīng)體系
表16反應(yīng)條件
注*：檢測熒光信號。
檢測結(jié)果見表17：
①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照的fam、vic、tarma、cy5熒光信號有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0；陰性對照和空白對照無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0。
②檢測樣品：cy5有熒光對數(shù)增長，且ct值≤30.0，表明該樣品檢出v.parahemolyticus。的fam、vic、tarma無熒光對數(shù)增長，ct值≥40.0，表明該樣品未檢出st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes。
③比對結(jié)果：與按照gb4789.10-2016、gb4789.4-2016、gb4789.30-2016、gb4789.7-2013對樣品進(jìn)行st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的檢測結(jié)果相符。
表17實(shí)驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)5個(gè)實(shí)施例可見，本發(fā)明的四重?zé)晒鈖cr引物體系及鑒定方法和試劑盒僅對st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus的目標(biāo)基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并在擴(kuò)增中產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號，適用于食品和化妝品中的st.aureus、sa.enterica、l.monocytogenes、v.parahemolyticus檢測，具有一定實(shí)用價(jià)值。
序列表sequencelisting
<110>貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院
<120>一種檢測4種致病菌的四重實(shí)時(shí)熒光pcr方法
<130>/
<160>6
<170>patentinversion3.5
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<212>dna
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