本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性檢測引物、檢測方法和試劑盒。

背景技術(shù)：
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美國食品藥品管理局(U.S.food and Drug Administration,FDA)2015年11月16日發(fā)布公告確定水優(yōu)鮭魚(三文魚)(商品名AquAdvantage Salmon,AAS)與非轉(zhuǎn)基因鮭魚一樣安全，這標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因鮭魚獲得美國權(quán)威機(jī)構(gòu)的最終批準(zhǔn)，依法可以商業(yè)銷售及食用。

轉(zhuǎn)基因鮭魚由加拿大水豐(AquaBounty)公司研發(fā)，自1995年水豐公司致函美國FDA申請調(diào)查開始，到獲得批準(zhǔn)所花時間約二十年。AAS經(jīng)由顯微注射構(gòu)建的opAFP-GHc2(the regulatory sequences of an antifreeze protein(AFP)gene,opAFP,；the protein coding domain of a growth hormone gene,GHc2)到野生鮭魚魚卵研發(fā)而成，所使用的轉(zhuǎn)基因元件來自大鱗大馬哈魚(王鮭)的生長激素蛋白編碼區(qū)和美洲綿鳚抗凍蛋白基因調(diào)控序列。重組后的生長激素基因可讓鮭魚的寒冷環(huán)境下仍然保持生長，使轉(zhuǎn)基因鮭魚達(dá)到上市規(guī)格的生長周期由3年縮短至18個月，大大降低了鮭魚的養(yǎng)殖成本。

轉(zhuǎn)基因鮭魚直接食用的安全性和生態(tài)安全性是人們普遍擔(dān)心問題。轉(zhuǎn)基因鮭魚可能與自然環(huán)境中的其他魚種發(fā)生有性交配，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因漂移到自然魚中，影響物種遺傳多樣性，或產(chǎn)生其他的未知風(fēng)險。目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品多數(shù)國家均采用相應(yīng)的標(biāo)識管理制度，標(biāo)識管理制度的建立和實施依賴于有效準(zhǔn)確的檢測鑒定技術(shù)。品系特異性PCR(轉(zhuǎn)化事件特異性)(Event-specific PCR)檢測的目標(biāo)序列是外源插入序列與植物基因組間連接區(qū)，相較于篩選PCR(Screening PCR)、基因特異性PCR(Gene-specific PCR)、構(gòu)建特異性PCR(Construct-specific PCR)具有更加高的具有高有特異性，能用于檢測鑒定轉(zhuǎn)基因具體品系，是目前轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)研究和實際檢測工作中的重要方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強，快速準(zhǔn)確鑒別轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性檢測引物。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

Aqu-F：5‘-CACGTTGTACTGCTGATA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Aqu-R：5‘-GTGGTTTAGTTCTCATACATC-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本發(fā)明還提供了相配套的檢測探針，所述的檢測探針為：5‘-CCTCACGTTGTACTACTGATACCACA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選，所述的熒光報告基團(tuán)為FAM，所述的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光定量PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

Aqu-F：5‘-CACGTTGTACTGCTGATA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Aqu-R：5‘-GTGGTTTAGTTCTCATACATC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

所述的檢測探針如下所示：

5‘-CCTCACGTTGTACTACTGATACCACA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣品DNA的作為模板；

(2)加入上述的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量PCR反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系；

(3)將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光PCP儀上進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系。

優(yōu)選，所述的步驟(2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：20μL體系為：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探針Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反應(yīng)程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

所述的步驟(3)的根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷樣品中是否為轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的標(biāo)準(zhǔn)為：如果擴(kuò)增曲線有典型熒光擴(kuò)增曲線，則說明樣品為轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系；如果擴(kuò)增曲線無典型熒光擴(kuò)增曲線，則說明樣品不為轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系。

本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性實時熒光PCR定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋以用作不同起始濃度的模板，分別加入上述的檢測引物、檢測探針，與實時熒光定量PCR反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，在熒光PCP儀上進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)；

(2)反應(yīng)后得到各起始濃度模板對應(yīng)的Ct值，該Ct值與起始濃度的常用對數(shù)(lg)呈線性關(guān)系，據(jù)此得到轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

提取待檢樣品的DNA，加入與步驟(1)中相同體系的上述的檢測引物、檢測探針，與實時熒光定量PCR反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，在熒光PCP儀上進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)后得到Ct值，將其代入轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待檢樣品中轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系的量。

本發(fā)明針對轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage品系特異性序列(美洲綿鳚抗凍蛋白基因啟動子區(qū)域與鮭魚基因組5’端鄰接區(qū)序列)設(shè)計引物和TaqMan探針，建立轉(zhuǎn)基因鮭魚實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測方法，利用該檢測引物和檢測探針，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，其具有特異性強，靈敏度高，檢測靈敏度為60拷貝，檢測重復(fù)性良好，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage的鑒定，滿足監(jiān)管部門對其轉(zhuǎn)基因鮭魚正確標(biāo)識的需求。

附圖說明：

圖1是退火溫度為60℃時A組、B組和C組引物探針擴(kuò)增圖，從左到右分別為A組、B組和C組擴(kuò)增曲線；

圖2是退火溫度為58℃時A組、B組和C組引物探針擴(kuò)增圖，從左到右分別為A組、B組和C組擴(kuò)增曲線；

圖3是轉(zhuǎn)基因鮭魚實時熒光PCR檢測方法特異性實驗結(jié)果，陽性擴(kuò)增曲線為AFP-Aqu質(zhì)粒分子；陰性信號分別為：西洋鮭魚、赤鮸魚、帶魚、金線魚、龍蝦、鱸魚、烏鯧魚、鯧魚、帝王蟹、青口貝和白蝦、陰性對照和空白對照；

圖4是靈敏度試驗結(jié)果，陽性信號從左到右分別為：陽性對照，300、150和30copies/μL質(zhì)粒DNA，陰性信號為陰性對照；

圖5是可重復(fù)性測試擴(kuò)增曲線，陽性信號從左到右分別為：300000、30000、15000、3000、1500、300、150和30copies/μL質(zhì)粒DNA；

圖6是標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。所用方法及技術(shù)，如無特別說明，均為常規(guī)方法和技術(shù)。

實施例1：

1材料與方法

1.1材料與試劑

大西洋鮭魚、赤鮸魚、帶魚、金線魚、龍蝦、鱸魚、烏鯧魚、鯧魚、帝王蟹、青口貝和白蝦由本實驗室收集儲備，轉(zhuǎn)基因鮭魚內(nèi)源生長激素(growth hormone，GH)和AAS品系特異性雙基因陽性質(zhì)粒(將GH基因片段160bp序列和AAS品系特異性片段150bp序列構(gòu)建到AmpR抗性的PUC57載體上，構(gòu)建得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌DH5a后-70℃保存。以下稱AFP-Aqu質(zhì)粒)為本實驗室構(gòu)建。

GH基因片段序列：CACGCATCCA CCCCACCATG CATCTCTCTC TGTCTCCCACAGGGGAGCCA GGATGGCGTA CTGAGCCTGG ATGACAATGA CTCTCAGCAT CTGCCTCCCT ACGGGAACTA CTACCAGAAC CTGGGGGGCG ATGGCAACATCAGGAGAAAC TACGAACTGT。

AAS品系特異性片段序列：GTTGTACTGC TGATGCCTCT GATACCACACAGACTGGGCC TCACGTTGTA CTGCTGATAC CACACAGACT GGGCCTCACGTTGTACTACT GATACCACAC AGTAGTACAA CGTTGGCAGA TGTATGAGAACTAAACCACT GACTGAACTT。

基因組DNA純化試劑盒普洛麥格(北京)生物技術(shù)；Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大連寶生物；質(zhì)粒DNA提取試劑盒，北京天根公司；引物和探針由閃晶生物公司合成，稀釋為終濃度為10uM的工作液使用。

1.2儀器與設(shè)備

ABI7500，ABI7500FAST實時熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；nanodrop2000c微量分光光度計，美國Thermo公司；研磨機(jī)，德國IKA。

1.3方法

1.3.1DNA提取

稱取研磨后的100mg魚肉樣品，使用基因組DNA純化試劑盒并按其操作步驟提取DNA，每次DNA提取均設(shè)置提取空白對照。微量分光光度計nanodrop2000c測定濃度。

1.3.2實時熒光PCR檢測方法的建立與優(yōu)化

根據(jù)轉(zhuǎn)入的美洲綿鳚抗凍蛋白基因美洲綿鳚抗凍蛋白基因啟動子區(qū)域與鮭魚基因組5’端鄰接區(qū)序列(AAS品系特異性片段)，應(yīng)用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物和探針。將設(shè)計的引物、探針經(jīng)NCBI網(wǎng)站上使用BLAST數(shù)據(jù)庫比對確定引物和探針的理論特異性；鮭魚內(nèi)源基因采用于魚類生長激素(growth hormone，GH)，用于鮭魚來源樣品DNA的檢測及轉(zhuǎn)基因成分的相對定量。具體引物探針信息見表1

表1實時熒光PCR的引物、探針

擴(kuò)增反應(yīng)20μL體系為：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探針Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反應(yīng)程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

1.3.3實時熒光PCR方法特異性測試

采用大西洋鮭魚、赤鮸魚、帶魚、金線魚、龍蝦、鱸魚、烏鯧魚、鯧魚、帝王蟹、青口貝和白蝦的DNA為模板，陽性樣品為轉(zhuǎn)基因鮭魚AFP-Aqu質(zhì)粒，陰性對照為大豆DNA。對建立的實時熒光PCR檢測方法的特異性測試。

擴(kuò)增反應(yīng)20μL體系為：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探針Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反應(yīng)程序為95℃ 30s；95℃ 5s、60℃ 34s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

1.3.4靈敏度測試

將轉(zhuǎn)基因鮭魚AFP-Aqu質(zhì)粒DNA用ddH₂O稀釋至300、150和30copies/μL分別進(jìn)行擴(kuò)增，測定本方法的檢測下限(limit of detection,LOD)和定量下限(limit of quantification,LOQ)，每個濃度20個重復(fù)。統(tǒng)計Ct值分析得出LOD和LOQ(以檢出率滿足不小于95％的最低濃度為LOD，在可接受的準(zhǔn)確度和精密度范圍內(nèi)可進(jìn)行精準(zhǔn)定量檢測的最低濃度為LOQ)。

擴(kuò)增反應(yīng)20μL體系為：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探針Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反應(yīng)程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

1.3.5可重復(fù)性測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將分別將提取的質(zhì)粒DNA(AFP-Aqu質(zhì)粒)溶液稀釋至300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30、6copies/μL，加入2μL DNA作為模板，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鮭魚實時熒光PCR檢測，每個樣品3個平行，根據(jù)其Ct值的計算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，并根據(jù)其線性范圍建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。，

擴(kuò)增反應(yīng)20μL體系為：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探針Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反應(yīng)程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

2結(jié)果與分析

2.1實時熒光PCR檢測方法的建立與優(yōu)化

退火溫度為60℃時，A組、B組和C組的引物和探針終濃度配比結(jié)果如圖1所示，A、B和C組引物與探針均得到良好的擴(kuò)增曲線，Ct值分別為23.60±0.01、23.07±0.01、25.935±0.07，A和B組對應(yīng)的Ct值無顯著差異，但C組與A、B兩組Ct值間存在極顯著差異(P＜0.01)，結(jié)合擴(kuò)增曲線、Ct值及經(jīng)濟(jì)性，擬選擇B組作為體系反應(yīng)的濃度。

退火溫度在58℃時，A、B和C不同的引物和探針終濃度配比結(jié)果如圖2所示，A組、B組和C組引物與探針均得到良好的擴(kuò)增曲線，其Ct值分別為：23.23±0.01、23.97±0.04、26.85±0.14，同樣的A和B組對應(yīng)的Ct值差異不明顯，如圖2，但C組與A、B兩組Ct值間存在極顯著差異(P＜0.01)，結(jié)合擴(kuò)增曲線、Ct值及經(jīng)濟(jì)性，選擇B組作為體系反應(yīng)的濃度。

B組引物探針在58℃和60℃檢測的Ct值相差不明顯，結(jié)合酶系推薦的最佳反應(yīng)溫度及方法的通用性，選擇退火溫度為60℃。

結(jié)合Ct值和擴(kuò)增曲線最后確定的20μL反應(yīng)體系如下：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探針Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反應(yīng)程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

2.2實時熒光PCR方法特異性測試

以大西洋鮭魚等11種非轉(zhuǎn)基因鮭魚和轉(zhuǎn)基因鮭魚陽性質(zhì)粒AFP-Aqu質(zhì)粒的DNA為模板，采用ASS的品系特異異引物和探針Aqu-F/R/P進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，如圖3所示，只有轉(zhuǎn)基因鮭魚AFP-Aqu質(zhì)粒的DNA成功擴(kuò)增，其他11種DNA樣本及陰性對照、空白對照無實時熒光擴(kuò)增曲線。上述結(jié)果表明針對轉(zhuǎn)基因鮭魚品系特異性序列的引物與探針特異性良好。

2.3靈敏度測試

采用轉(zhuǎn)基因鮭魚質(zhì)粒樣品DNA(AFP-Aqu質(zhì)粒)的30、150、300copies/μL梯度分別進(jìn)行擴(kuò)增，每個濃度20個重復(fù)，檢測結(jié)果如表2，圖4所示。以30copies/μL濃度時擴(kuò)增20次均出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，因此本方法的LOD為60copies質(zhì)粒DNA。隨著DNA濃度降低，SD值逐漸變大，為得到穩(wěn)定的擴(kuò)增和定量結(jié)果，Ct值間的SD值應(yīng)小于0.25。本研究中，當(dāng)以60拷貝DNA為模板時，SD值為0.30，而以300拷貝DNA為模板時，SD值為0.13，故本研究建立的實時熒光PCR方法的LOQ為300拷貝的ASS質(zhì)粒DNA。

表2轉(zhuǎn)基因鮭魚AAS品系特異性實時熒光PCR方法靈敏度測試

2.4可重復(fù)性測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將分別將提取的質(zhì)粒DNA(AFP-Aqu質(zhì)粒)溶液稀釋至300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30、15copies/μL，加入2μL DNA作為模板，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鮭魚實時熒光PCR檢測，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)實驗，水為空白對照，計算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表3所示。擴(kuò)增圖如圖5所示，由表3可知，300000-30copies/μL的8個濃度梯度所得的Ct值表明，其SD介于0.06-0.35，RSD介于0.12％-1.01％均在可接受范圍內(nèi)。即在線性范圍600000～60拷貝內(nèi)可重復(fù)性良好。采用300000～30copies/μL的8個濃度梯度所得Ct建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y＝-3.2194x+40.805,R²為0.997，大于0.98，擴(kuò)增效率為104％(介于90％～110％)，表明其線性相關(guān)性良好，擴(kuò)增效率高，均符合ENGL相關(guān)要求[Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing]

表3實時熒光PCR方法的可重復(fù)性測試

3、結(jié)論

轉(zhuǎn)基因三文魚是世界上第一個獲批可直接食用的動物來源的轉(zhuǎn)基因食品，相比其他商業(yè)化已經(jīng)19年的轉(zhuǎn)基因作物如大豆和玉米等食品，雖然直接食用是合法的，但目前還是主要用于飼料或食品添加劑，供消費者直接食用的轉(zhuǎn)基因甜玉米至今尚未在美國超市銷售。轉(zhuǎn)基因大豆作為直接入口的食品是食用油?？梢灶A(yù)測，轉(zhuǎn)基因三文魚被批準(zhǔn)直接食用，將推動轉(zhuǎn)基因作物食品的直接食用。此外，轉(zhuǎn)基因三文魚獲得批準(zhǔn)可商業(yè)化食用另一個重在影響，是將促進(jìn)接踵而來的其他轉(zhuǎn)基因動物性食品產(chǎn)業(yè)化，在水豐技術(shù)公司(Aquabounty Technologies)轉(zhuǎn)基因鮭魚等待審批的十幾年中，其實已有20家30種轉(zhuǎn)基因魚和轉(zhuǎn)基因動物正在研究開發(fā)之中，其中有幾種已經(jīng)向FDA申請商業(yè)化。批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因鮭魚商業(yè)化，為后面一大批送審的其他轉(zhuǎn)基因食用動物打開一扇大門，其影響不可估量。可能在不久的將來，轉(zhuǎn)基因鮭魚將游上百姓的餐桌。為了保障消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)，為監(jiān)管部門提供鑒定標(biāo)識的技術(shù)支持，建立準(zhǔn)確、高效、快速的轉(zhuǎn)基因鮭魚檢測技術(shù)至關(guān)重要。本文針對美洲綿鳚抗凍蛋白基因啟動子區(qū)域與鮭魚基因組5’端鄰接區(qū)序列建立的轉(zhuǎn)基因鮭魚品系特異性實時熒光PCR方法，可對轉(zhuǎn)基因鮭魚AquAdvantage進(jìn)行品系特異性快速檢測，滿足檢測監(jiān)管部門對其進(jìn)行標(biāo)識的需求。