本發(fā)明屬于豬遺傳育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于中國(guó)地方豬品種大腸桿菌抗性的分子標(biāo)記方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

疾病可導(dǎo)致畜禽產(chǎn)量下降、質(zhì)量低劣，同時(shí)它還嚴(yán)重降低遺傳進(jìn)展，給養(yǎng)豬業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約占總產(chǎn)值的12％～15％。仔豬腹瀉是規(guī)?；i場(chǎng)最常見(jiàn)的一類(lèi)疾病，對(duì)哺乳仔豬的危害尤為嚴(yán)重。據(jù)有關(guān)資料的統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，許多豬群仔豬腹瀉性疾病發(fā)病率高達(dá)50％以上，病死率高達(dá)15％～20％，由腹瀉引起的仔豬死亡數(shù)占仔豬死亡總數(shù)的39.8％(何維明等，2001)。盡管當(dāng)前對(duì)仔豬腹瀉采取的一些預(yù)防性措施(如提高管理水平、改善衛(wèi)生環(huán)境、注射藥物以及亞單位疫苗接種等)，在一定程度上減少了該病的發(fā)生，但并沒(méi)有從根本上消除斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生與流行，大腸桿菌性仔豬腹瀉仍然是引起仔豬高發(fā)病率和死亡率最主要的原因之一。由此可見(jiàn)，從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展考慮，尋求一種全新的預(yù)防與控制策略，采用遺傳學(xué)方法，培育出抗病新品種(品系)，從遺傳素質(zhì)上永久性地提高仔豬對(duì)大腸桿菌病的抵抗能力，是現(xiàn)代育種學(xué)家共同追求的目標(biāo)。

F18大腸桿菌是目前在養(yǎng)豬業(yè)中發(fā)生最普遍、危害最大的腸毒素大腸桿菌病原(Van den BroeckW et al,2000)，可引起斷奶仔豬腹瀉(porcine post-weaning diarrhea,PWD)等疾病，在豬的病原學(xué)上有極為重要的意義(Boldin，2008)。

Vogeli等(1997)通過(guò)候選基因法和連鎖分析法，研究了位于豬染色體6q11區(qū)的α(1,2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(alpha(l,2)fucosyltransferase)基因1(FUT1)，發(fā)現(xiàn)FUT1基因第307個(gè)堿基的突變可以作為一個(gè)遺傳標(biāo)記，用于篩選對(duì)F18菌毛化大腸桿菌具抵抗力的新品系；Meijerink等(2000)認(rèn)為FUT1酶的第103個(gè)氨基酸(即FUT1基因M307位點(diǎn))對(duì)小腸粘膜F18菌毛受體的表達(dá)具有重要的作用，導(dǎo)致豬對(duì)F18黏附素的抗性和敏感性，AA基因型豬表現(xiàn)為抗性，GG基因型豬表現(xiàn)為敏感性。Meijerink以此為標(biāo)記，并在250頭的瑞士大約克、杜洛克、漢普夏、皮特蘭等豬種中進(jìn)行基因型測(cè)定，依據(jù)測(cè)定結(jié)果通過(guò)適當(dāng)?shù)倪x種選配，實(shí)施了抗性育種。美國(guó)的ARS(Agricultural Research service)買(mǎi)斷該成果并申請(qǐng)專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)：443766)，同時(shí)進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，且于1999年7月宣布在大約克中育成該病的抗性豬。在國(guó)外宣布育成大約克抗F18抗大腸桿菌病新品系后，國(guó)內(nèi)針對(duì)地方豬種FUT1基因的研究開(kāi)始成為熱點(diǎn)，本課題組(吳圣龍等，2006；Bao et al,2008)以及國(guó)內(nèi)國(guó)內(nèi)許多學(xué)者如晏學(xué)明等(2003)和施啟順等(2003)已經(jīng)系統(tǒng)研究了杜洛克、皮特蘭、約克夏、長(zhǎng)白豬和漢普夏等5個(gè)外來(lái)豬種和幾十個(gè)國(guó)內(nèi)地方豬種FUT1基因M307位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果都顯示FUT1基因M307位點(diǎn)在外來(lái)豬種以及含外血的雜交培育品種(如：蘇太豬)中具有多態(tài)性，但在中國(guó)地方豬種中尚未發(fā)現(xiàn)AA基因型甚至AG基因型存在。這就充分表明：國(guó)外豬種的F18大腸桿菌抗性遺傳基礎(chǔ)與國(guó)內(nèi)地方豬種的F18大腸桿菌抗性遺傳基礎(chǔ)確實(shí)存在著明顯的差異，適用于國(guó)外豬種的FUT1基因遺傳標(biāo)記并不能同樣適合于中國(guó)地方豬種，因此近年來(lái)關(guān)于中國(guó)地方豬種抗F18大腸桿菌病的相關(guān)研究和育種工作也陷于困境。

microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)短的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼RNA分子，廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中。miRNA主要是通過(guò)與靶標(biāo)mRNA的3′-UTR區(qū)域完全或不完全配對(duì)而降解靶標(biāo)mRNA或抑制mRNA的正常翻譯，進(jìn)而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。隨著近幾年不斷的深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、凋亡以及胚胎發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的重要作用。此外，miRNA作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因素參與了多種癌癥、腎病、呼吸系統(tǒng)疾病等疾病的發(fā)生。近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者逐漸把miRNA研究從人擴(kuò)展到其他模式動(dòng)物上，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在豬骨骼肌和心肌發(fā)育、脂肪生成代謝以及各種病毒性和細(xì)菌性疾病發(fā)生等過(guò)程均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本課題組前期運(yùn)用Illumina Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)E.coli F18抗性型和敏感型個(gè)體十二指腸內(nèi)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分析(數(shù)據(jù)已經(jīng)提交于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Gene Expression Omnibus，GEO Series accession number GSE32527)，并通過(guò)定量驗(yàn)證篩選出表達(dá)量差異極顯著的miRNA—miR-215。

核酸內(nèi)切酶Drosha和Dicer通過(guò)識(shí)別miRNA前體的特異構(gòu)象對(duì)其進(jìn)行切割加工,所以miRNA前體序列的突變，必然會(huì)影響其構(gòu)象，進(jìn)而使其加工成熟發(fā)生變化，使成熟miRNA水平上調(diào)或下調(diào)，并最終影響到其對(duì)靶基因的調(diào)控，如果突變發(fā)生在“種子序列”，則有可能失去對(duì)原有靶基因的調(diào)控或者產(chǎn)生新的靶基因，使生物的相應(yīng)性狀發(fā)生改變甚至產(chǎn)生疾病。到目前為止，miRNA前體多態(tài)性的相關(guān)研究主要集中在人類(lèi)疾病發(fā)生上，而對(duì)豬疾病易感性相關(guān)的報(bào)道較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于中國(guó)地方豬品種大腸桿菌抗性的分子標(biāo)記方法與應(yīng)用。具體采用miRNA-215前體序列中的AT插入突變作為中國(guó)地方豬品種大腸桿菌抗性的分子標(biāo)記及方法與應(yīng)用。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)解決方案是：

檢測(cè)該分子標(biāo)記的方法包括待測(cè)樣本的豬基因組DNA的提取及整個(gè)miRNA-215前體序列的PCR擴(kuò)增，miRNA-215前體序列的PCR經(jīng)SSCP分析，當(dāng)待測(cè)豬個(gè)體基因型為BB型(出現(xiàn)4條帶中間的第2和第3這2條帶，在miR-215前體序列6bp處存在2個(gè)堿基(AT)的插入突變)，則為大腸桿菌抗性強(qiáng)的個(gè)體。

其中，待測(cè)樣本選擇梅山豬或/和東串豬，每個(gè)個(gè)體采取耳組織樣約1.0g，放入1.5mL的離心管內(nèi)，置-20℃存放。采用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，超純水溶解后用NanoDrop-1000微量核酸測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，根據(jù)其濃度用超純水稀釋成100mg/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

miRNA-215前體序列的PCR擴(kuò)增引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

F：5’-CTGTTCAGTCGCTTTAGAAA-3’(SEQ ID NO.1)；

R：5’-CATCTACCATTGTGTTGCTT-3’(SEQ ID NO.2)。

所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：基因組DNA(100ng/μL)1.0μL，PCR Master-Mix10.0μL，上下游引物(10pmol/L)各1.0μL，加ddH₂O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，最后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明為從遺傳素質(zhì)上永久性地提高中國(guó)地方豬品種斷奶仔豬大腸桿菌抗性提供了有效的分子標(biāo)記育種手段。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：

1)本發(fā)明為中國(guó)地方豬品種大腸桿菌性腹瀉抗病育種工作的分子標(biāo)記輔助選擇提供一個(gè)更加高效準(zhǔn)確的分子遺傳標(biāo)記，為提高仔豬腹瀉抗病力提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段。用該遺傳標(biāo)記對(duì)豬大腸桿菌抗性進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，開(kāi)展抗病育種，提高豬的抗大腸桿菌侵染的能力，從根本上降低腹瀉病的發(fā)病率。

2)使用該遺傳標(biāo)記進(jìn)行分子選育，不僅加快育種進(jìn)程，而且對(duì)于豬的免疫應(yīng)答能力和一般抗病力沒(méi)有任何不利的影響。

3)本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用較為低廉，準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的直接檢測(cè)，本發(fā)明將在中國(guó)地方豬品種的抗病育種中發(fā)揮巨大作用。

附圖說(shuō)明

圖1為miR-215PCR-SSCP帶型(其中第1、3、4、6、7泳道為AA基因型；2泳道為BB基因型；5、8、9泳道為AB基因型)。

圖2為miR-215前體序列插入突變測(cè)序峰圖。

圖3為大腸桿菌易感型判定結(jié)果(A：標(biāo)準(zhǔn)菌株107/86；B：rE.coli1534；C：pnirBMisL-fedF(照片均使用油鏡鏡頭，以1000倍放大比例拍攝))。

圖4為大腸桿菌抗性型判定結(jié)果(A：標(biāo)準(zhǔn)菌株107/86；B：rE.coli1534；C：pnirBMisL-fedF的能力喪失(照片均使用油鏡鏡頭，以1000倍放大比例拍攝))。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1利用miRNA-215前體序列中的AT插入突變變異位點(diǎn)標(biāo)記對(duì)地方豬品種梅山豬和東串豬核心群全面檢測(cè)基因型

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

梅山豬和東串豬分別來(lái)自昆山市梅山豬保種有限公司和南通華多種豬繁育有限公司(東串豬省級(jí)保種場(chǎng))。

1.2DNA提取

每個(gè)個(gè)體采取耳組織樣約1.0g，放入1.5mL的離心管內(nèi)，置-20℃存放。采用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，超純水溶解后用NanoDrop-1000微量核酸測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，根據(jù)其濃度用超純水稀釋成100mg/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴(kuò)增

設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段包含整個(gè)miRNA前體序列的PCR引物，利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。miR-215擴(kuò)增引物，上下游引物序列為：

F：5’-CTGTTCAGTCGCTTTAGAAA-3’(SEQ ID NO.1)；

R：5’-CATCTACCATTGTGTTGCTT-3’(SEQ ID NO.2)；

目的片段長(zhǎng)度203bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20μL：基因組DNA(100ng/μL)1.0μL，PCR Master-Mix 10.0μL，上下游引物(10pmol/L)各1.0μL，加ddH₂O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，最后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4SSCP檢測(cè)

取3μL PCR產(chǎn)物與3μL變性上樣緩沖液(2×)混合，98℃變性15min，立即冰浴15min，經(jīng)12％聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺＝29:1)110V電泳12h，利用0.1％AgNO₃進(jìn)行銀染，1.5％NaOH(含體積比1‰的甲醛)顯色。

根據(jù)PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果，選取不同基因型個(gè)體交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司ABI PRISM 377 DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序分析。

PCR-SSCP結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-215前體序列檢測(cè)到3種基因型，分別定義為AA、AB、BB(出現(xiàn)4條帶的為AB型，出現(xiàn)4條帶中間的第2和第3這2條帶的為BB型，出現(xiàn)4條帶中間的第1和第4這2條帶的為AA型)(圖1)經(jīng)直接測(cè)序確定BB型在miR-215前體序列6bp處存在2個(gè)堿基(AT)的插入突變(圖2)。

對(duì)miR-215前體序列插入突變位點(diǎn)基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示。在東串豬中AA基因型82頭，BB基因型24頭，AB基因型44頭，基因型頻率分別為0.547、0.160、0.293，A、B等位基因頻率分別為0.693、0.307；梅山豬中AA基因型82頭，BB基因型16頭，AB基因型20頭，基因型頻率分別為0.695、0.136、0.169，A、B等位基因頻率分別為0.780、0.220。東串豬和梅山豬基因型分布相同，均為AA型最多，AB型次之，BB型最少。該突變位點(diǎn)在所檢測(cè)2個(gè)群體中基因型分布不符合哈代溫伯格平衡。

表1插入突變等位基因及基因型頻率

注：χ²_0.05(1)＝3.841，χ²_0.01(1)＝6.635

Note:χ²_0.05(1)＝3.841，χ²_0.01(1)＝6.635

實(shí)施例2仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附試驗(yàn)確定個(gè)體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性

在仔豬斷奶前后，也是最易感染大腸桿菌F18菌株而表現(xiàn)出腹瀉癥狀的35日齡階段屠宰取十二指腸、空腸腸段15cm用于小腸上皮細(xì)胞的制備，

產(chǎn)F18ab菌毛標(biāo)準(zhǔn)菌株107/86(O139:K12:H1)由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。能誘導(dǎo)表達(dá)F18ac菌毛含fed操縱子全基因的重組大腸菌rE.coli1534由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，能表面分泌表達(dá)F18ab菌毛FedF亞單位的重組大腸桿菌pnirBMisL-fedF也由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。將厭氧誘導(dǎo)的細(xì)菌用PBS反復(fù)離心洗滌3次，調(diào)整細(xì)菌濃度至約1×109CFU/ml。分別取上述野生菌或誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌菌液0.5ml，在其中添加終濃度為1％甘露糖于37℃作用30min后和0.5ml小腸上皮細(xì)胞混合，再于37℃孵育30min,1000r/min離心5min,用PBR溶液懸浮后取50μl滴于潔凈玻片上，自然干燥，火焰固定，用美蘭染色3-5min，油鏡觀察結(jié)果。

斷奶仔豬的小腸上皮細(xì)胞如均能與表達(dá)F18ab菌毛標(biāo)準(zhǔn)菌株107/86、誘導(dǎo)表達(dá)的重組大腸桿菌rE.coli1534及誘導(dǎo)表達(dá)的重組大腸桿菌pnirBMisL-fedF發(fā)生黏附作用(圖3)，將其定義為大腸桿菌F18菌株敏感型；而如仔豬小腸上皮細(xì)胞對(duì)上述三株大腸桿菌的黏附能力幾乎為零(圖4)，則將其定義為抗性型。

實(shí)施例3miRNA-215前體序列中的AT插入突變與F18大腸桿菌抗性的關(guān)系分析及抗性標(biāo)記的確定

對(duì)梅山豬和東串豬miRNA-215前體序列3種基因型個(gè)體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性進(jìn)行分析，東串豬和梅山豬3種基因型個(gè)體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性的頻率分別見(jiàn)表2和表3；可見(jiàn)，東串豬BB基因型中大腸桿菌F18菌株抗性型個(gè)體的頻率為91.7％，顯著或極顯著地高于AB基因型(41.7％)和AA基因型(16.7％)的個(gè)體。梅山豬BB基因型中大腸桿菌F18菌株抗性型個(gè)體的頻率為87.5％，顯著或極顯著地高于AB基因型(31.5％)和AA基因型(18.8％)的個(gè)體。無(wú)論是東串豬還是梅山豬，均可以將miRNA-215前體序列中的AT插入突變基因型BB基因型確定為抗大腸桿菌的分子遺傳標(biāo)記。

表2東串豬miRNA-215前體序列3種基因型個(gè)體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性的頻率表

表3梅山豬miRNA-215前體序列3種基因型個(gè)體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性的頻率表

實(shí)施例4豬一般抗病力指標(biāo)(重要細(xì)胞因子)的測(cè)定

利用豬多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(Procarta Immunoassay Kits)(Affymetrix,USA)對(duì)上述樣本血清中部分重要細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)水平進(jìn)行測(cè)定，具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

實(shí)施例5miRNA-215前體序列中的AT插入突變及其與一般抗病力指標(biāo)間的關(guān)系分析

分別測(cè)定了蘇太豬和梅山豬不同基因型樣本血清中部分重要細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的表達(dá)水平。顯著性關(guān)聯(lián)分析表明(表4和表5)。

表4東串豬插入突變不同基因型免疫因子水平

表5梅山豬插入突變不同基因型免疫因子水平

在動(dòng)物抗病育種過(guò)程中，大部分的研究只是注重于一種或幾種疾病的抗性篩選，而忽略了機(jī)體的整體免疫力。機(jī)體的免疫系統(tǒng)是由中樞淋巴器官、外周淋巴器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，所涉及的基因數(shù)量眾多，各個(gè)基因的表達(dá)水平會(huì)隨著機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化而變化。因此我們?cè)趯?duì)遺傳變異篩選的同時(shí)，對(duì)機(jī)體部分重要細(xì)胞免疫因子的水平進(jìn)行了測(cè)定。關(guān)聯(lián)分析顯示，梅山豬和東串豬不同基因型個(gè)體間部分細(xì)胞免疫因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)水平均不存在顯著性差異。這一方面由于本實(shí)驗(yàn)所涉及的個(gè)體均處于健康狀態(tài)，未受到外界病原菌的干擾，因此各個(gè)免疫指標(biāo)水平也均處在正常范圍之內(nèi)；另一方面進(jìn)一步推測(cè)miR-215主要通過(guò)靶向重要的抗性基因調(diào)控F18大腸桿菌的抗性，因此miR-215前體突變并沒(méi)有影響到機(jī)體的一般免疫力，進(jìn)一步表明了其作為抗大腸桿菌病遺傳標(biāo)記的可行性。