本發(fā)明屬于基因工程領域，具體地說是涉及一種基于第二代測序技術平臺的地溝油檢測方法。
背景技術：
：食物油作為人們每天餐桌上的必需品，不僅能使食物更美味，也能為人們提供身體必需的營養(yǎng)物質(zhì)。作為各類烹調(diào)方式必備的基礎物質(zhì)條件，食用油的安全與放心可以說是飯桌安全的重要環(huán)節(jié)。在目前的食用油摻偽行為當中，最嚴重、最惡劣同時也最被廣泛關注的，當屬地溝油的非法回收、再加工行為，稱為地溝油造假。地溝油，是人們對于各種劣質(zhì)油脂的總稱，人們往往也將其稱為“餐桌回收油”或者“潲水油”。地溝油目前被研究學者們分為廣義上的和狹義上的兩類，狹義的地溝油指的是那些通過網(wǎng)呢等打榜方式，從下水道、陰溝、河流中收集，經(jīng)過特定的脫色、除臭、精煉技術加工提煉的餐飲業(yè)再生劣質(zhì)油脂，廣義的地溝油即包括一切非法的地溝油，比如餐飲店使用的泛油、煎炸老油等。不論是哪種來源的地溝油，在歷經(jīng)了下水道的氧化、腐敗過程與多次高溫反復作用，其組成成分都發(fā)生了變化，不僅營養(yǎng)成分嚴重下降，更嚴重的是產(chǎn)生了如黃曲霉毒素B1、苯并(a)花、反式脂肪酸等各種有毒有害物質(zhì)，并含有有毒的表面活性劑成分。人們?nèi)羰情L期食用這類劣質(zhì)油，將會對健康造成相當大的影響，引發(fā)身體的病變。癥狀較輕的會有消化不良、腹脹等現(xiàn)象，嚴重的患者會發(fā)生貧血、中毒性肝病等急性病癥，而長期食用還有誘發(fā)惡性腫瘤的危險，危害性極大。目前國內(nèi)對地溝油的鑒別和檢測主要是從感官和理化檢驗兩個方面進行。理化檢測分別檢驗水分含量、比重、折光率、皂化值、酸值、羰基值、過氧化值、碘值重金屬、脂肪酸相對不飽和度、膽固醇、殘留檢測、氧化產(chǎn)物等指標。地溝油由于經(jīng)過水洗、蒸餾、脫色、脫臭等精煉工藝后，或者與普通食用植物油摻兌之后，已經(jīng)很難用常規(guī)的感官分析或者理化指標等進行區(qū)分。另外近幾年也提出來對油品的基因檢測，利用熒光定量PCR技術，通過設計多對動物源性的引物，根據(jù)PCR結果，考察油品中是否含有某個動物源性基因。這種檢測方法，雖然簡單、快速，但是只能作為輔助鑒定方法，并不能作為直接的定性檢測技術；而且由于引物數(shù)量的限制，上述檢測技術并不能涵蓋所用物種，很容易造成假陰性；另外，由于油品中的基因嚴重降解，并不能肯定檢測不出特定基因，就能說明該油品就不是地溝油。因此，不得不說，目前國內(nèi)尚缺乏能夠有效鑒定地溝油的直接檢測方法。技術實現(xiàn)要素：針對上述技術問題，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中鑒定方法無法直接定性油品是否為地溝油，且輔助鑒定技術特異性差、操作復雜、檢測成本高、假陰性等問題，提供了一種基于第二代測序技術平臺的地溝油檢測方法，該方法通過對油品中殘存DNA的直接測序，直接定性油品，其檢測特異性強，可應用于多重測序平臺，包括iLLumina測序平臺，不僅限于HISEQ2000、HISEQ2500、Miseq、Nextseq500等；也可用于IONTORRENT測序平臺，且一次可以檢測百余個樣本，通量高，操作方便且可行性高。本發(fā)明的技術方案如下：一種基于第二代測序技術平臺的地溝油檢測方法，包括以下步驟：步驟a、待檢油品樣本DNA提取及質(zhì)檢；步驟b、在第二代測序技術平臺上構建DNA文庫并質(zhì)檢；步驟c、上機測序及分析。步驟a包括：首先，取9mL待檢油品，加1mLTE緩沖液，室溫震蕩搖勻5min，12000rpm離心10min，去除上層油脂層，重復操作2-6次；其次，利用磁珠法，抽提核酸，加入50μL的TE緩沖液溶解；最后，DNA質(zhì)檢，利用Qubit檢測DNA濃度和純度。步驟b包括：首先進行末端修復及純化，從-20℃冰箱內(nèi)取出末端修復緩沖液溶解，充分混勻；將末端修復緩沖液和末端修復酶，置于冰盒上，依照表1配置反應體系；然后混合均勻，微離心后，20℃溫浴30min；反應結束后，利用磁珠純化，回收DNA，溶于25μL的TE緩沖液中；其次進行加接頭及純化，從-20℃冰箱內(nèi)取出連接緩沖液、PE接頭溶液、Barcode接頭溶液，融化后充分混勻；取出連接酶、修復酶，置于冰上，依照表2配置連接反應體系；連接反應體系配置完成后，混合均勻并微離心，置于20℃條件下溫浴30min；反應結束后，利用磁珠純化，回收DNA，溶于40μL的TE緩沖液中；然后進行文庫擴增及純化，從-20℃冰箱內(nèi)取出PCR緩沖液和PCR酶、引物1、引物2，依照表3配置PCR反應體系，PCR反應體系配置完成后，混合均勻并微離心，將樣本置于PCR儀中，運行PCR反應程序，PCR反應程序結束后，利用磁珠純化，回收DNA，溶于20μL的TE緩沖液中；最后利用Qubit或熒光定量PCR、AgiLent2100檢測文庫DNA的濃度，依據(jù)各樣本DNA濃度關系及測序數(shù)據(jù)量的關系，對樣本進行混樣。步驟c包括生物信息學分析；首先將測序數(shù)據(jù)經(jīng)過初步處理，去除低質(zhì)量、接頭序列；根據(jù)cLean的數(shù)據(jù)，去除重復序列；然后數(shù)據(jù)做BLAST對比，將測序數(shù)據(jù)與油品理論來源基因組做Mapping，未Mapping上的序列，與nt/nr數(shù)據(jù)做BLAST，鑒定是否為含有其他來源基因組；最后鑒定為何種油品：將測序數(shù)據(jù)直接與nt/nr數(shù)據(jù)做BLAST，或者將數(shù)據(jù)做拼接后再與nt/nr數(shù)據(jù)做BLAST，通過統(tǒng)計BLAST結果，鑒定是單一來源，還是多物種來源，以此鑒定為何種來源油品還是復雜來源的地溝油品。本發(fā)明的有益效果是所述基于第二代測序技術平臺的地溝油檢測方法，通過對油品中殘存DNA的直接測序，直接定性油品，其檢測特異性強，可應用于多重測序平臺，包括iLLumina測序平臺，不僅限于HISEQ2000、HISEQ2500、Miseq、Nextseq500等；也可用于IONTORRENT測序平臺，且一次可以檢測百余個樣本，通量高，操作方便且可行性高。具體實施方式下面對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。本發(fā)明公開一種基于第二代測序技術平臺的地溝油檢測方法，包括以下步驟：步驟a、待檢油品樣本DNA提取及質(zhì)檢；步驟b、在第二代測序技術平臺上構建DNA文庫并質(zhì)檢；步驟c、上機測序及分析。步驟a包括：首先，取9mL待檢油品，加1mLTE緩沖液，室溫震蕩搖勻5min，12000rpm離心10min，去除上層油脂層，重復操作2-6次；其次，利用磁珠法，抽提核酸，加入50μL的TE緩沖液溶解；最后，DNA質(zhì)檢，利用Qubit檢測DNA濃度和純度。步驟b包括：首先進行末端修復及純化，從-20℃冰箱內(nèi)取出末端修復緩沖液溶解，充分混勻；將末端修復緩沖液和末端修復酶，置于冰盒上，依照表1配置末端修復反應體系；表1：末端修復反應體系組分反應體系(μL)樣本DNA21.5末端修復緩沖液8末端修復酶0.5反應體系總量30然后混合均勻，微離心后，20℃溫浴30min；反應結束后，利用磁珠純化，回收DNA，溶于25μL的TE緩沖液中；其次進行加接頭及純化，從-20℃冰箱內(nèi)取出連接緩沖液、PE接頭溶液、Barcode接頭溶液，融化后充分混勻；取出連接酶、修復酶，置于冰上，依照表2配置連接反應體系；表2：連接反應體系組分反應體系(μL)修復產(chǎn)物20連接緩沖液3dNTP1DNA連接酶0.5修復酶0.5PE接頭溶液1Barcode接頭溶液1無核酸水3總體系30連接反應體系配置完成后，混合均勻并微離心，置于20℃條件下溫浴30min；反應結束后，利用磁珠純化，回收DNA，溶于40μL的TE緩沖液中；然后進行文庫擴增及純化，從-20℃冰箱內(nèi)取出PCR緩沖液和PCR酶、引物1、引物2，依照表3配置PCR反應體系：表3：PCR反應體系組分反應體系(μL)連接街頭產(chǎn)物12.5擴增Buffer(含有dNTP)2酶0.5引物2無核酸水8總體系25PCR反應體系配置完成后，混合均勻并微離心，將樣本置于PCR儀中，運行表4的PCR反應程序：表4：PCR反應程序PCR反應程序結束后，利用磁珠純化，回收DNA，溶于20μL的TE緩沖液中；最后利用Qubit或熒光定量PCR、AgiLent2100檢測文庫DNA的濃度，依據(jù)各樣本DNA濃度關系及測序數(shù)據(jù)量的關系，對樣本進行混樣。步驟c包括生物信息學分析；首先將測序數(shù)據(jù)經(jīng)過初步處理，去除低質(zhì)量、接頭序列；根據(jù)cLean的數(shù)據(jù)，去除重復序列；然后數(shù)據(jù)做BLAST對比，將測序數(shù)據(jù)與油品理論來源基因組做Mapping，未Mapping上的序列，與nt/nr數(shù)據(jù)做BLAST，鑒定是否為含有其他來源基因組；最后鑒定為何種油品：將測序數(shù)據(jù)直接與nt/nr數(shù)據(jù)做BLAST，或者將數(shù)據(jù)做拼接后再與nt/nr數(shù)據(jù)做BLAST，通過統(tǒng)計BLAST結果，鑒定是單一來源，還是多物種來源，以此鑒定為何種來源油品還是復雜來源的地溝油品。本發(fā)明的基于第二代測序技術平臺的地溝油檢測方法，通過對油品中殘存DNA的直接測序，直接定性油品，其檢測特異性強，可應用于多重測序平臺，包括iLLumina測序平臺，不僅限于HISEQ2000、HISEQ2500、Miseq、Nextseq500等；也可用于IONTORRENT測序平臺，且一次可以檢測百余個樣本，通量高，操作方便且可行性高。盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的表格及文字。當前第1頁1 2 3