本發(fā)明涉及生物技術領域中基因多態(tài)性檢測領域，具體涉及一種與中國人群酒精代謝相關的ADH1B基因G143A位點和ALDH2基因G1510A位點的分型檢測，與中國人群葉酸代謝吸收相關的MTHFR基因C677T位點及A1298C位點多態(tài)性和MTRR基因A66G位點的分型檢測及與中國人群的VD（維生素D）代謝能力相關的VDR基因Bsm I、Apa I、Fok I位點分型檢測試劑盒。

背景技術：

中國是酒類的消耗大國，酒是多種化學成份的混合物，乙醇是其主要成份。飲酒后，乙醇很快通過胃和小腸的毛細血管進入血液，而后經血管運輸到肝臟進行消化。酒精中毒是由于乙醇進入人體內不能被消化吸收，隨著血液進入大腦，破壞神經元細胞膜，削弱中樞神經系統(tǒng)，并通過激活抑制性神經原和抑制激活性神經原造成大腦活動遲緩而形成的。在乙醇的代謝過程中乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶有著重要的作用。但不同個體中這兩種酶的代謝能力有較大的差異，乙醇脫氫酶（ADH1B）位于4號染色體上，研究表明G143A突變能促進酶的活性，導致乙醇降解速度加快。位于12號染色體上的乙醛脫氫酶基因（ALDH2）的主要突變是G1510A，如發(fā)生突變，會導致催化活性基本喪失，造成乙醛在人體內積累。因此可以通過對產生乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的基因進行分型檢測有利于評估酒精對人體的風險狀況，降低酒精中毒的發(fā)生率。

葉酸是人體機能正常運轉不可或缺的元素，尤其在新生兒作用更為突出，是導致新生兒出生缺陷的主要原因。導致機體缺乏葉酸有兩個方面的原因：一是葉酸攝入量不足，二是由于遺傳（基因）缺陷導致機體對葉酸的利用能力低下（葉酸代謝通路障礙）。研究表明：造成各體系葉酸利用能力差異的主要原因是個體MTHFR（5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶）基因的C677T位點和A1298C位點的多態(tài)性可以顯著影響該酶的活性。另外MTRR（編碼甲硫氨酸合成酶還原酶）基因A66G位點的多態(tài)性也是造成葉酸及甲基維生素缺乏癥的主要病因。因此可以通過對人體MTHFR基因及MTRR基因易感位點進行分型檢測，及早發(fā)現(xiàn)不同個體對葉酸的吸收利用水平，從而篩查出容易引起葉酸缺乏的高危人群，實現(xiàn)個性化增補葉酸（因人而異地確切給出葉酸補充計劃和補充量），從而增強葉酸補充依從性，同時加強產前檢查，以降低新生兒出生缺陷風險。

維生素D是人體代謝的重要元素，維生素D缺乏會導致少兒佝僂病和成年人的軟骨病。個體對維生素D的吸收能力也不同，研究發(fā)現(xiàn)維生素D受體（VDR）基因參與骨量的調節(jié)，其中VDR基因的 Bsm I、Apa I、Fok I這三個位點，是參與骨代謝的主要位點。Fok I 酶切位點位轉錄起始部位，其多態(tài)性可導致氨基酸序列變化，進而影響骨代謝能力；Bsm I和Apa l酶切位點位于第VIII內含子上，其多態(tài)性不影響VDR的氨基酸序列但影響腸道對食物中鈣的攝取。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種與人類健康管理相關的代謝能力包括酒精代謝、葉酸和VD利用能力相關基因分型檢測的試劑盒，可通過一次反應快速、準確、靈敏、經濟的檢測ADH1B基因G143A位點和ALDH2基因G1510A位點，MTHFR基因A1298C位點、C677T位點和MTRR基因A66G位點及VDR基因Bsm I、Apa I、Fok I位點的基因型，為人的健康管理提供基因信息參考。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是：

提供一種用于人酒精、葉酸和VD代謝能力相關基因分型的試劑盒，所述試劑盒包括以下試劑：

（1）PCR擴增試劑，包括PCR緩沖液、dNTPs、HotStart Taq DNA聚合酶和用于針對ADH1B基因G143A位點、ALDH2基因G1510A位點2個區(qū)段，MTHFR A1298C位點，MTHFR A1298C位點和MTRR基因A66G位點3個區(qū)段，Bsm I、Apa I、Fok I位點3個區(qū)段進行擴增的引物混合液I；

（2）PCR產物純化試劑，包括酶切反應緩沖液、蝦堿性磷酸酶（SAP）和核酸外切酶（ExoI）；

（3）延伸反應試劑，包括SNaPshot Multiplex混合液和針對ADH1B基因G143A位點、ALDH2基因G1510A位點2個區(qū)段，MTHFR C677T位點，MTHFR A1298C位點和MTRR基因A66G位點3個區(qū)段，Bsm I、Apa I、Fok I位點3個區(qū)段的進行延伸的延伸引物混合液II；

（4）延伸產物純化試劑，包括蝦堿性磷酸酶、酶切緩沖溶液的混合液；

（5）和上機電泳檢測試劑，包括Hi-Di甲酰胺、GeneScan Size Standards-120LIZ。

上述技術方案中：所述PCR緩沖液是PCR擴增技術中常用的一種緩沖液，優(yōu)選是包括100mM的Tris-HCL、500mM的KCL和15mM的Mgcl₂；所述SNaPshot Multiplex混合液是SNaPshot技術中常用的一種延伸混合液。

上述技術方案中：所述試劑盒還可包括陽性對照液、陰性對照液用于對試劑盒進行質量控制，避免出現(xiàn)假陽性和假陰性結果；所述陽性対照液為上述8個檢測位點的雜合和野生型質?；旌弦航M成，各質粒的濃度為10³copies/μL；所述空白對照液為Tris-HCL緩沖液（PH=8.0）。

上述技術方案的一種優(yōu)選是：所述PCR擴增試劑中的擴增的引物混合液I包括針對ADH1B基因G143A位點擴增的引物對序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示；針對 ALDH2基因G1510位點擴增的引物對序列如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示；針對MTHFR基因C677T位點的擴增引物對序列如SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示；針對MTHFRA1298C位點的擴增引物對序列如SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示；針對 MTRR基因A66G位點的擴增引物對序列如SEQ ID No：9和SEQ ID No：10所示；針對VDR基因Bsm I位點的擴增引物對序列如SEQ ID No：11和SEQ ID No：12所示；針對VDR基因Apa I位點的擴增引物對序列如SEQ ID No：13和SEQ ID No：14所示；針對VDR基因Fok I位點擴增引物對序列如SEQ ID No：15和SEQ ID No：16所示。具體擴增引物序列和組成見表1。

表1 引物混合物I序列：

上述技術方案的一種優(yōu)選是：所述延伸反應試劑中的延伸引物混合液II包括針對ADH1B基因G143A位點的單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：17所示；針對ALDH2基因G1510A位點的單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：18所示；針對MTHFR基因C677T位點的單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：19所示；針對MTHFR基因A1298C位點的單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：20所示；針對MTRR基因A66G位點的單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：21；針對VDR基因Bsm I位點的單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：22所示；針對 VDR基因Apa I位點的單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：23所示；針對VDR基因Fok I位點單堿基延伸引物序列如SEQ ID No：24所示。具體特異性延伸引物見表2。

表2延伸引物混合物II序列：

上述技術方案的一種優(yōu)選是：所述特異性延伸反應引物SEQ ID No：17，SEQ ID No：18，SEQ ID No：19，SEQ ID No：20，SEQ ID No：21，SEQ ID No：22，SEQ ID No：23，SEQ ID No：24序列的5’端用poly GACT修飾。

上述技術方案的一種優(yōu)選是：配置反應體系時，所述各基因位點的擴增引物濃度相同；所述各基因位點的單堿基延伸引物濃度相同。

上述技術方案的一種優(yōu)選是：上述PCR擴增反應體系為20μL，所述各基因位點的擴增引物終濃度為0.15μM；所述單堿基延伸反應體系為5μL, 所述各基因位點的延伸引物終濃度為0.25μM。

本發(fā)明具有積極的效果：

（1）本發(fā)明首次將人類健康管理相關的包括酒精代謝能力、葉酸利用代謝能力、維生素D利用代謝能力相關基因的易感位點一次性完成分型檢測，方便有需要人群，一次性完成代謝能力相關基因的分型檢測。

（2）本發(fā)明的一種用于人酒精、葉酸和VD代謝能力相關基因分型的試劑盒的特異性和準確定均達到了100%，最低檢測限達到1ng基因DNA；實現(xiàn)了相關基因熱點分型的檢測高效、低成本、高靈敏度和準確性；對其他基因的分型檢測試劑盒的開發(fā)具有借鑒意義。

（3）本發(fā)明的一種用于人酒精、葉酸和VD代謝能力相關基因分型的試劑盒，一次性檢測健康管理相關的5個基因的共8個熱點位點的基因型，單次檢測成本在50元左右，相比分開檢測這些位點，成本大大降低，讓受檢測者享受到實在的優(yōu)惠，讓基因檢測更親民。

附圖說明

圖1采用本發(fā)明的一種用于人酒精、葉酸和VD代謝能力相關基因分型的試劑盒實施例1檢測樣本1電泳圖；

圖2采用本發(fā)明的一種用于人酒精、葉酸和VD代謝能力相關基因分型的試劑盒實施例1檢測樣本2電泳圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術人員可以根據上述本發(fā)明內容對本發(fā)明作出一些非本質的改進和調整。

實施例1

一、試劑盒的組成。

本實施例的一種用于人酒精、葉酸和VD代謝能力相關基因分型的試劑盒，包括：PCR擴增反應液、PCR產物純化試劑、延伸反應試劑、延伸產物純化試劑、陽性對照液和空白對照液、上機檢測液，共7管反應液組成如表3所示。

PCR反應液裝在A管內，由10×PCR緩沖液、dNTPs、HotStart Taq DNA聚合酶以及擴增的引物混合液I組成。

PCR產物純化試劑裝在B管內，由10×反應緩沖液、蝦堿性磷酸酶（SAP）和核酸外切酶（ExoI）組成。

延伸反應試劑裝在C管內，由10×SNaPshot Multiplex混合液、延伸引物混合液II組成。

延伸產物純化試劑在D管內，由10×反應緩沖液、蝦堿性磷酸酶（SAP）組成。

陽性對照液在E管內，由ADH1B基因G143A位點、ALDH2基因G1510A位點、MTHFR基因C677T位點、A1298C位點、MTRR基因 A66G位點、VDR基因Bsm I位點、Apa I位點、Fok I位點的野生型和突變型質?；旌隙?。

空白対照液在F管內，由Tris-HCL 緩沖液（PH=8.0）組成。

電泳檢測反應液在G管內， Hi-Di甲酰胺和GeneScan Size Standards-120LIZ組成。

表3 試劑盒組成表：

二、試劑盒的使用方法。

本實施例的一種用于人酒精、葉酸和VD代謝能力相關基因分型的試劑盒具體檢測步驟如下：

1、DNA提取。

采用血樣DNA提取試劑盒提取樣本1和樣品2（樣本1和樣品2是EDTA抗凝全血），具體的操作參見DNA試劑盒抽提產品說明書。

2、樣本DNA質量檢測。

獲得樣本DNA后，通過測定濃度和OD260/OD280的比值控制樣本質量，最終加入反應體系中的樣本，OD260/OD280的比值在1.7～2.0之間的可獲得最優(yōu)反應結果，濃度為5～20ng/μl較為合適。

3、PCR反應。

1）配制20μL PCR反應體系：

計算所需PCR管數4（4=樣本數為2+陽性對照+空白對照），取A管中PCR擴增反應液，分裝到4個PCR管中，每個管18μL，分別取樣本1（或樣本2）2μl，陽性對照液（E管）2μL和空白對照液(F管) 2μL，加入到對應PCR管中，蓋好PCR管蓋，根據所加模板進行標記。

2）PCR擴增程序：

將配置好的PCR反應管，在PCR擴增儀上用如下程序進行PCR擴增：第一步：95℃ 處理5min；第二步：94℃40s，65℃1min每個循環(huán)下降1℃，72℃ 1min，進行5個循環(huán)；第三步：94 ℃40 s，60 ℃1min，72 ℃1 min， 進行30個循環(huán)；最后：72oC處理8min。

4、PCR產物純化。

1）配制12μL的PCR產物純化體系：

取B管中PCR產物純化試劑，分裝到4個PCR管中，每個管4μL，取步驟3中PCR擴增后的產物，每個PCR產物取8μL加入到對應PCR管中，進行PCR產物的純化。

2）PCR產物純化程序：

37℃孵育保溫1hr，然后75℃保溫15min。

5、延伸反應。

1）配置5μL的延伸反應體系：

取C管中延伸反應試劑，分裝至4個PCR小管中，每個管3μL，取步驟4中純化后的PCR的產物，每個PCR純化產物取2μL加入到對應PCR管中，進行延伸反應。

2）延伸反應程序：

依次在96℃10s，50℃5s，60℃30s進行25個循環(huán)，得延伸產物。

6、延伸產物純化。

1）配置延伸產物純化體系

取D管中延伸反應純化試劑，分裝到4個PCR小管中，每個管分裝 0.6 μL，取步驟5延伸反應后的產物，每個延伸產物純化產物取2μL加入到對應PCR管中，進行延伸反應。

2）延伸產物純化程序

37℃孵育保溫1hr，然后65℃保溫15min

7、電泳上機檢測。

1）配置電泳檢測體系：

取G管中的電泳檢測反應液，分裝到4個PCR管中，每個管分裝5 μL，取步驟6中純化后的延伸常務，每個純化產物取取5μL加入到對應PCR管中，進行ABI3130核酸分析儀（儀器名稱）電泳檢測；

2）電泳檢測程序：

95℃變性5min，4℃迅速冷卻后，進行電泳。

8、結果判讀。

1）試劑盒有效性的判定

根據陽性對照、空白對照電泳檢測結果，判定試劑盒的有效性；

其中陽性對照，電泳檢測結果顯示8個檢測位點都為明顯的雜合峰，即8個位點都顯示為雜合型，否則需要重新進行檢測；

空白對照，電泳檢測，8個位點都無峰值圖，即無信號，否則可能存在污染，樣本檢測結果不可靠。

2）樣本位點基因型的判定

在確定試劑盒的陽性對照檢測結果和空白對照檢測結果與完全正確無誤后，對檢測樣本結果進行判讀，根據電泳后對應樣本的延伸產物峰的位置和顏色確定檢測位點的分型結果，樣本1檢測結果見圖1，樣本2檢測結果見圖2。

9、PCR產物測序驗證。

采用基因檢測的金標準-Sanger測序的方法對8個位點進行測序驗證，測序結果與采用本試劑盒的檢測結果完全一致。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州吉洛生物醫(yī)藥科技有限公司

<120> 一種用于人酒精、葉酸、VD代謝能力相關基因分型的試劑盒

<130> 無

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

acccataacc cccaagagtg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gagggagagg ccaaaaggtg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggaaggtaga gaagggcttt agac 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccaacactct ccacgatgcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggggtcagaa gcatatcagt 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctcacctgga tgggaaaga 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctttggggag ctgaaggact actac 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cactttgtga ccattccggt ttg 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

caagcccaag tagtttcgag c 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ggtaaaatcc actgtaacgg ct 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cagcaactcc tcatggctga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

atgcacggag aagtcactgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aaccagcgga agaggtcaag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gcatcgtctc cccaggtatg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

atctggagct gagaggaggg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gcaggataga agcccctgac 20

<210> 17

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gactgactga ctgactgact gactgactga ctgactgact gactacgggc tgcaggcata 60

cact 64

<210> 18

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gactgactga ctgactgact gactgactga ctgactgact gactgacttg gtggctgtag 60

gaatctgtc 69

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ctgactgact gactgactga ctgactgact gagaaggtgt ctgcgggag 49

<210> 20

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ctgactgact gactgactga ctgactgact gactggagga gctgaccagt gaag 54

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gactgactga ctgactgact gactgactga ctgactgcaa aggccatcgc agaagaaat 59

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

gactaggagc tctcagctgg gc 22

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gactgactca gagcctgagt attgggaatg 30

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

gactgactga ctgactgctg gccgccattg cctcc 35