專利名稱：葉酸代謝能力遺傳檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)及預(yù)防醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及ー種葉酸代謝能力遺傳檢測(cè)試劑盒，是通過聯(lián)合檢測(cè)三個(gè)核酸(DNA和RNA)分子標(biāo)記上單核苷酸多態(tài)性，來評(píng)估受檢者的葉酸代謝能力，有利于個(gè)性化指導(dǎo)孕前、孕期葉酸補(bǔ)充劑量，預(yù)警子代發(fā)生神經(jīng)管缺陷病的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)測(cè)個(gè)體高同型半胱氨酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，也可評(píng)估個(gè)體患腦卒中、腦出血、腦梗塞、冠心病等心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)大小。
背景技術(shù)：
葉酸是由喋呤啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸等組成的化合物，是ー種水溶性B族維生素。葉酸對(duì)人體的重要營(yíng)養(yǎng)作用早在1948年即已得到證實(shí)，是人體在利用糖分和氨基酸時(shí)的必要物質(zhì)，是機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)。葉酸在同型半胱氨酸代謝途徑中發(fā)揮重要作用。葉酸在體內(nèi)葉酸以四氫葉酸的形式起作用，如果葉酸缺乏，N5-甲基四氫葉酸合成不足，那么同型半胱氨酸向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)換就會(huì)發(fā)生障礙，相繼引發(fā)出-系列病理變化同型半胱氨酸堆積，導(dǎo)致-碳單位甲基生成減少，這就直接影響50多種重要物質(zhì)的合成。高濃度的同型半胱氨酸能損害血管的內(nèi)皮細(xì)胞，成為重要的心腦血管致病因素。葉酸還幫助蛋白質(zhì)的代謝，并與維生素B12共同促進(jìn)紅細(xì)胞的生成和成熟，是制造紅血球不可缺少的物質(zhì)。人類(或其他動(dòng)物)如缺乏葉酸可引起巨紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少癥，還會(huì)導(dǎo)致身體無力、易怒、沒胃ロ以及精神病癥狀。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，葉酸對(duì)孕婦尤其重要。孕婦對(duì)葉酸的需求量比正常人高4倍。孕早期是胎兒器官系統(tǒng)分化，胎盤形成的關(guān)鍵時(shí)期，細(xì)胞生長(zhǎng)，分裂十分旺盛。如在懷孕頭3個(gè)月內(nèi)缺乏葉酸，可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷。在我國(guó)發(fā)生率約為3. 8%。的神經(jīng)管畸形，包括無腦兒，脊柱裂等。另外還可起早期的自然流產(chǎn)。到了孕中期，孕晩期，除了胎兒生長(zhǎng)發(fā)育外，母體的血容量，乳房，胎盤的發(fā)育使得葉酸的需要量大增。葉酸不足，孕婦易發(fā)生胎盤早剝，妊娠高血壓綜合征，巨幼紅細(xì)胞性貧血；胎兒易發(fā)生宮內(nèi)發(fā)育遲緩，早產(chǎn)和出生低體重，而且這樣的胎兒出生后的生長(zhǎng)發(fā)育和智力發(fā)育都會(huì)受到影響。葉酸的營(yíng)養(yǎng)缺乏問題由此而引起廣泛的關(guān)注。雖然葉酸是是水溶性維生素，一般超出成人最低需要量20倍也不會(huì)引起中毒。但服用大劑量葉酸可能產(chǎn)生不良后果1.干擾抗驚厥藥物的作用，誘發(fā)病人驚厥發(fā)作。2.月艮葉酸350mg可能影響鋅的吸收，而導(dǎo)致鋅缺乏，使胎兒發(fā)育遲緩，低出生體重兒增加。3.掩蓋維生素B12缺乏的早期表現(xiàn)，而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受損害。4.導(dǎo)致乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的上升?？梢?，孕前及孕期的葉酸補(bǔ)充劑量需要定量指導(dǎo)。神經(jīng)管缺陷(NTDs) —直是我國(guó)圍產(chǎn)期兒中高發(fā)的畸形疾病。1986年NTDs的發(fā)生率為27. 40/萬，到2007年下降至7. 2/萬，但在某些高發(fā)省份，如山西，陜西，甘肅等，發(fā)生率仍高達(dá)30/萬，NTDs的發(fā)生是基因和環(huán)境因素的共同作用的結(jié)果。自1964年E. D. Hibbarc^PR. ff. Smhell首先發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏與神經(jīng)管缺陷(NTDs)有關(guān)以來，婦女妊娠期定量補(bǔ)充葉酸已經(jīng)成為預(yù)防NTDs出生非常有效的措施之一。[0006]葉酸是同型半胱氨酸代謝反應(yīng)中為必需因子，使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃健Ｈ~酸的不足可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥的發(fā)生。而高同型半胱氨酸血癥是腦卒中、動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究顯示，10%的冠心病患者與同型半胱氨酸升高有關(guān)，輕、中度同型半胱氨酸水平升高可使心血管疾病死亡危險(xiǎn)性增加4 6倍，血漿總Hcy水平每升高5 μ mo I/L則冠心病危險(xiǎn)性男性増加60%，女性増加80%，相對(duì)危險(xiǎn)性男性為I. 6，女性為I. 8，相當(dāng)于總膽固醇每升高20mg/dL的危險(xiǎn)性，因此成為冠心病的ー個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血漿同型半胱氨酸水平與冠狀動(dòng)脈病變血管的支數(shù)有一定關(guān)系，有人研究結(jié)果表明，單支、雙支、多支血管病變的患者血漿Hcy水平呈逐級(jí)上升趨勢(shì)。并且與血管病變的嚴(yán)重程度有關(guān)，研究表明，冠狀動(dòng)脈狹窄> 99%的患者血漿Hcy水平明顯高于狹窄< 75%的患者。血漿同型半胱氨酸水平還與冠心病患者的遠(yuǎn)期預(yù)后、生存率、病死率有夫。我國(guó)是腦卒中高發(fā)大國(guó)，衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)顯示，毎年新發(fā)病200萬人。腦卒中每年導(dǎo)致死亡150萬人，是位居腫瘤之后的城鄉(xiāng)居民第二位死因。存活的患者中，約四分之三不同程度喪失勞動(dòng)能力，重度致殘者占40%。全國(guó)毎年用于該病的治療費(fèi)用100億元以上，國(guó)家和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重。國(guó)內(nèi)專家認(rèn)為，我國(guó)沒有推行葉酸強(qiáng)化食品，大眾沒有自覺從食物中補(bǔ)充葉酸的習(xí)慣，血清葉酸水平低，血漿同型半胱氨酸水平高等因素，與原發(fā)性高血壓共同作用，可能是導(dǎo)致我國(guó)腦卒中發(fā)生率和死亡率居高不下的重要原因。對(duì)1996年至2006年國(guó)際醫(yī)學(xué)界有夫“補(bǔ)充葉酸防治腦卒中療效”研究的匯總分析顯示，補(bǔ)充葉酸能使腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低18%，療程達(dá)3年以上時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)可下降29%。文中還引用了在中國(guó)河南省林州市進(jìn)行的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)研究，顯示補(bǔ)充一定數(shù)量葉酸2年后，腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可降低37%。對(duì)無腦卒中既往史的人群效果更為明顯。近日，由中美科學(xué)家完成的“補(bǔ)充葉酸預(yù)防腦卒中的療效薈萃分析”，贏得國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)“千名醫(yī)學(xué)家”(FacultyoflOOOMedicine)科學(xué)文獻(xiàn)貢獻(xiàn)カ的高度評(píng)價(jià)，這項(xiàng)由中美醫(yī)學(xué)家聯(lián)合完成的大型匯總研究證實(shí)，補(bǔ)充葉酸可有效降低腦卒中風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)際高血壓聯(lián)盟主席劉カ生教授認(rèn)為，我國(guó)應(yīng)重視和加強(qiáng)葉酸在防治腦卒中方面的作用。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)位于第一號(hào)染色體1ρ36. 3位置，是參與體內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，與體內(nèi)葉酸/同型半胱氨酸(HCY)的代謝和蛋氨酸的合成有關(guān)，催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)換成5-甲基四氫葉酸鹽，使之能為同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸，并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個(gè)較低的水平。該酶是人體葉酸代謝中的ー個(gè)重要的酶，在胚胎神經(jīng)管發(fā)育(妊娠4-8周)中意義重大。MTHFR基因的缺陷可以導(dǎo)致多個(gè)機(jī)體必需生化途徑的紊亂，包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、DNA以及蛋白質(zhì)甲基化修飾等，并進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)管缺陷、癌癥、心腦血管等多種疾病。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR 677位點(diǎn)的多態(tài)性是影響該酶的活性的ー個(gè)重要因素。攜帯MTHFR 677 T等位基因的酶活性為野生型的45%左右，攜帶MTHFR 1298C等位基因的酶活性為野生型的68%左右，兩種情況均阻礙了葉酸代謝，引起一系列疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，而合理補(bǔ)充葉酸可以很大程度的防止基因缺陷引發(fā)的不良后果。甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)也是參與體內(nèi)葉酸代謝和同型半胱氨酸代謝的關(guān)鍵酶，其編碼基因位于5ρ15· 3-ρ15· 2。MTRR基因rsl801394是位于5ρ15· 3_ρ15· 2之間的MTRR基因第2個(gè)外顯子處的ー個(gè)A/G多態(tài)，引起MTRR基因編碼的蛋白第22個(gè)氨基酸由Ile變?yōu)镸et(Ile22Met)。該位點(diǎn)是MTRR上的主要突變，引起甲基維生素缺乏癥E型，并經(jīng)常用來研究與脊柱裂 、Down綜合癥、神經(jīng)管缺陷、白血病等疾病的關(guān)系。并且研究證明，基因型為MTRR66GG、MTRR66AG的孕婦發(fā)生NTDs的危險(xiǎn)性較正常對(duì)照組增加。在中國(guó)人群中該多態(tài)的頻率分布為A占76%，G占24%左右。
發(fā)明內(nèi)容我們對(duì)2573例無血緣關(guān)系的漢族婦女人群進(jìn)行了 MTHFR基因C677T、A1298C以及MTRR基因A66G位點(diǎn)的基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，MTHFR基因C677T的等位基因頻率分別為63. 45%和36. 55%，]^冊(cè)1 基因41298(的等位基因頻率分別為78. 20%和21. 80%，MTRR基因A66G的等位基因頻率分別為72. 81%和27. 19%。對(duì)基因多態(tài)性分布頻率的研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G多態(tài)性分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此通過三個(gè)基因多態(tài)性檢測(cè)，可以指導(dǎo)葉酸的個(gè)性化補(bǔ)充和葉酸利用能力的監(jiān)測(cè)，是許多疾病預(yù)防及保健的重要技術(shù)方法。本實(shí)用新型提供ー種葉酸代謝能力遺傳檢測(cè)試劑盒。通過對(duì)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因上的rsl801133位點(diǎn)、rsl801131位點(diǎn)，甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因上的rsl801394位點(diǎn)的聯(lián)合檢測(cè)，評(píng)估葉酸代謝能力的大小，從而指導(dǎo)個(gè)性化的應(yīng)用與保健，包括孕前、孕期葉酸補(bǔ)充劑量的指導(dǎo)；預(yù)警子代發(fā)生神經(jīng)管缺陷病的風(fēng)險(xiǎn)；預(yù)測(cè)個(gè)體高同型半胱氨酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；評(píng)估預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)生腦卒中、腦出血、腦梗塞、冠心病等心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。本試劑盒的特征是由包裝盒體、襯墊、襯墊孔中的裝有檢測(cè)三個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液的三個(gè)試管，裝有DNA測(cè)序反應(yīng)液的三個(gè)試管,裝有測(cè)序產(chǎn)物純化試劑的四個(gè)試管，裝有PCR產(chǎn)物酶解組份的ー個(gè)試管，裝有陰性對(duì)照品的ー個(gè)試管。本試劑盒的保存溫度為-20°C,盡量減少反復(fù)凍融。本試劑盒的特征是，其主要組份和含量如下，(I)PCR反應(yīng)液?jiǎn)蝹€(gè)PCR反應(yīng)體系包括10 XPCR緩沖液2. 5 μ l，25mM MgCl2溶液 2· 5μ l，25mMUdNTPs O. 2 μ l,25mM dNTPs 0· 2 μ 1，20 μ M 特異性引物對(duì)中的一對(duì)引物O. 5 μ I，5U/ μ I混合酶(Taq DNA聚合酶與UNG酶)I μ I。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染體系，經(jīng)加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。(2) PCR產(chǎn)物酶解試劑組份'2 μ I SAP酶+ExoL酶MIX。(3) DNA測(cè)序反應(yīng)液有兩部分組成測(cè)序反應(yīng)體系和測(cè)序產(chǎn)物純化。單個(gè)DNA測(cè)序反應(yīng)體系包括μ I測(cè)序試劑(25% BigDye Mix)，I μ I DNA測(cè)序引物對(duì)(只使用其中一個(gè)引物)。測(cè)序產(chǎn)物純化包括=IOOmM EDTA 2 μ 1，16 μ I無水こ醇，70%預(yù)冷こ醇70 μ I X 2，10 μ I去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)等。陰性對(duì)照品為無囷雙蒸水樣品。本試劑盒的特征是，三個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和測(cè)序引物分別是MTHFR基因rsl801133位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物對(duì)和測(cè)序引物對(duì)為擴(kuò)增上游擴(kuò)增引物序列5’-CAGTCCCTGTGGTCTCTTCAT-3’擴(kuò)增下游擴(kuò)增引物序列5’ -TCTCACCGCACCGTCCT-3’[0025]測(cè)序上游測(cè)序引物序列5’ -CGCCTTGAACAGGTGGA-3，測(cè)序下游測(cè)序引物序列5’ -TCTCACCGCACCGTCCT-3’MTHFR基因rsl801131位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物對(duì)和測(cè)序引物對(duì)為擴(kuò)增上游引物序列5’-GTCTCCCAACTTACCCTTCTC-3’擴(kuò)增上游引物序列5’-ACGGTAGATGTAACTCTTTGGTC-3’測(cè)序下游引物序列5’-CCACTCCAGCATCACTCACT-3’測(cè)序下游測(cè)序引物序列5’-ACGGTAGATGTAACTCTTTGGTC-3’MTRR基因rsl801394位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物對(duì)和測(cè)序引物對(duì)為擴(kuò)增上游擴(kuò)增引物序列5’-TCACTGTTACATGCCTTGAAGT-3’擴(kuò)增下游擴(kuò)增引物序列5’-CTTTGAAGAATTTTGGTTGGGAAGTG-3’測(cè)序上游測(cè)序引物序列5’-GGCAAAGGCCATCGCAGAAG-3’測(cè)序下游測(cè)序引物序列5’-CTTTGAAGAATTTTGGTTGGGAAGTG-3’本實(shí)用新型試劑盒通過三個(gè)葉酸代謝能力相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)基因片段進(jìn)行先擴(kuò)增再測(cè)序的聯(lián)合檢測(cè)，達(dá)到對(duì)葉酸代謝能力更全面、更準(zhǔn)確和更高效的遺傳檢測(cè)與評(píng)估，應(yīng)用于孕前、孕期葉酸補(bǔ)充劑量的個(gè)體化指導(dǎo)；預(yù)警子代發(fā)生神經(jīng)管缺陷病的風(fēng)險(xiǎn)；預(yù)測(cè)個(gè)體高同型半胱氨酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)；也是評(píng)估和預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)生腦卒中、腦出血、腦梗塞、冠心病等心腦血管疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

圖I為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2 為 MTHFR 基因 rsl801133 (C677T TT)位點(diǎn)測(cè)序圖。圖3 為 MTHFR 基因 rsl801131 (A1298C AA)位點(diǎn)測(cè)序圖。圖4 為 MTRR 基因 rsl801394 (A66G AG)位點(diǎn)測(cè)序圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)ー步闡述本實(shí)用新型。實(shí)施例僅用于說明目的，而不用干限制本發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未做詳細(xì)說明和具體描述的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)方法，應(yīng)為常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件和方法，或按廠家提供的操作步驟和方法進(jìn)行。實(shí)施例I參見圖I，本試劑盒的特征是由包裝盒體I、襯墊2、襯墊孔中裝有檢測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液的三個(gè)試管3，裝有DNA測(cè)序反應(yīng)液的三個(gè)試管4，裝有測(cè)序產(chǎn)物純化試劑的四個(gè)試管5，裝有PCR產(chǎn)物酶解液的一個(gè)試管6，裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管7。本試劑盒的保存溫度為_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本試劑盒的特征是，其主要組份和含量如下，(I) PCR反應(yīng)液?jiǎn)蝹€(gè)PCR反應(yīng)體系包括10 XPCR緩沖液2.5 μ l，25mM MgCl2溶液 2· 5μ l，25mMUdNTPs O. 2 μ l,25mM dNTPs 0· 2 μ 1，20 μ M 特異性引物對(duì)中的一對(duì)引物O. 5 μ I，5U/ μ I混合酶(Taq DNA聚合酶與UNG酶)I μ I。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染體系，經(jīng)加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。(2) PCR 產(chǎn)物酶解液2 μ I SAP 酶 +ExoL 酶 MIX。[0048](3)DNA測(cè)序反應(yīng)組分有兩部分組成測(cè)序反應(yīng)體系和測(cè)序產(chǎn)物純化。單個(gè)DNA測(cè)序反應(yīng)體系包括μ I測(cè)序試劑(25% BigDye Mix)，I μ I DNA測(cè)序引物對(duì)(只使用其中一個(gè)引物)。測(cè)序產(chǎn)物純化包括=IOOmM EDTA 2 μ 1，16 μ I無水こ醇，70%預(yù)冷こ醇70 μ I X 2，10 μ I去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)等。陰性對(duì)照品為無囷雙蒸水樣品。實(shí)施例2本試劑盒的使用I、樣本基因組DNA的獲取樣本用常規(guī)基因組總DNA提取與純化方法提取口腔粘膜脫落細(xì)胞的基因組DNA，置于-20°C保存。2、采用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段 (I)本試劑盒的特點(diǎn)是使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染體系，經(jīng)加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。(2)本試劑盒的PCR反應(yīng)試劑組份由PCR反應(yīng)液體積22 μ I、模板DNA 3 μ I (約50ng)組成。PCR 反應(yīng)液包括=IOXPCR 緩沖液 2. 5 μ I, 25mM MgCl2 溶液 2. 5 μ 1，5U/ μ I 混合酶(Taq DNA 聚合酶與 UNG 酶)I μ 1，25mM UdNTPs O. 2 μ 1，25mM dNTPs 0· 2 μ I。(3)PCR反應(yīng)試劑組份準(zhǔn)備試劑開管前請(qǐng)完全解凍后充分混勻并短暫離心。建議在DNA提取結(jié)束后配制混合反應(yīng)液，并立即加樣。如特殊情況，可將下述分裝好的混合反應(yīng)液短期存于4°C,并在3小時(shí)內(nèi)使用。(4) PCR反應(yīng)試劑組份配制按每個(gè)PCR反應(yīng)液體積22 μ I，模板DNA (陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照)3 μ 1，乘以所需的反應(yīng)管數(shù)，計(jì)算試劑的量，加于ー個(gè)無菌離心管中，振蕩混勻。再用微量加樣器在每ー PCR反應(yīng)管內(nèi)加入25 μ I上述混勻的混合反應(yīng)液。注意模板DNA若不足3 μ I可用純水補(bǔ)足。(5)PCR反應(yīng)條件循環(huán)I :94°C，3分鐘；循環(huán)2_31 :94°C變性45秒、52°C退火45秒、72°C延伸I分鐘；共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。3、PCR產(chǎn)物純化(I)電泳取5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，用2. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，以合適的DNAMarker作為分子量大小對(duì)照，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。其余PCR產(chǎn)物可4°C短期保存(不超過2天，如若超過2天不使用，請(qǐng)置于_20°C保存)。(2)觀察電泳結(jié)果(A)陰性對(duì)照應(yīng)無擴(kuò)增產(chǎn)物，否則應(yīng)全部重新擴(kuò)增；(B)條帶清晰，且大小符合目標(biāo)產(chǎn)物，則可用于后續(xù)測(cè)序反應(yīng)；無目標(biāo)條帶或條帶無法清晰辨認(rèn)的標(biāo)本，需重新進(jìn)行該位點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)；重新擴(kuò)增后仍無目的條帶或條帶無法清晰辨認(rèn)的標(biāo)本，建議重新進(jìn)行目標(biāo)DNA抽提。(3) PCR酶解產(chǎn)物選取PCR產(chǎn)物3 μ 1，再加入純化試劑組份2 μ I SAP MIX,混勻。進(jìn)行如下反應(yīng)37°C 60分鐘，80°C 15分鐘。產(chǎn)物可4°C短期保存(不超過2天，如若超過2天不使用，請(qǐng)置于_20°C保存)。4、測(cè)序反應(yīng)。將表2的各組分混合進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)試劑組份和測(cè)序反應(yīng)條件見表I和表2 表IDNA測(cè)序反應(yīng)試劑組份
試劑名稱體積(單位μ|)
LQQ64」純水I
權(quán)利要求1.一種葉酸代謝能力遺傳檢測(cè)試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)、襯墊(2)、裝有檢測(cè)三個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液的三個(gè)試管(3)、裝有測(cè)定三個(gè)DNA序列的反應(yīng)液的三個(gè)試管(4 )、裝有純化測(cè)序產(chǎn)物的試劑的四個(gè)試管(5 )、裝有酶解PCR產(chǎn)物的試劑的一個(gè)試管(6 )、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管(7 )，襯墊(2 )上設(shè)有容器孔，分別放置三管PCR反應(yīng)液(3 )、三管DNA測(cè)序反應(yīng)液(4 )、四管測(cè)序產(chǎn)物純化試劑(5 )、酶解PCR產(chǎn)物的反應(yīng)液(6 )和陰性對(duì)照品(7X
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種葉酸代謝能力遺傳檢測(cè)試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、襯墊孔中裝有檢測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液的三個(gè)試管3，裝有DNA測(cè)序反應(yīng)液的三個(gè)試管4，裝有測(cè)序產(chǎn)物純化試劑的四個(gè)試管5，裝有PCR產(chǎn)物酶解液的一個(gè)試管6，裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管7。本實(shí)用新型試劑盒通過對(duì)三個(gè)葉酸代謝能力相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)基因片段進(jìn)行先擴(kuò)增再測(cè)序的聯(lián)合檢測(cè)，達(dá)到對(duì)葉酸代謝能力更全面、更準(zhǔn)確和更高效的遺傳檢測(cè)與評(píng)估，應(yīng)用于孕前、孕期葉酸補(bǔ)充劑量的個(gè)體化指導(dǎo)；預(yù)警子代發(fā)生神經(jīng)管缺陷病的風(fēng)險(xiǎn)；預(yù)測(cè)個(gè)體高同型半胱氨酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)；也是評(píng)估和預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)生腦卒中、腦出血、腦梗塞、冠心病等心腦血管疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。
文檔編號(hào)C12M1/34GK202626189SQ201220200889

公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者崔春黎, 肖自力, 紀(jì)燕燕 申請(qǐng)人:上海金防生物科技有限公司