本發(fā)明提供一種快速、簡捷、高效的同時(shí)檢測抗病基因SW-5和TY3的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

番茄是世界上重要的蔬菜作物，自上個(gè)世紀(jì)20年代番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)被首次報(bào)道以來，現(xiàn)已遍及世界各地，并已經(jīng)成為繼TY之后的危害番茄生產(chǎn)的主要病害。目前已發(fā)現(xiàn)的抗TSWV病的基因主要有三個(gè)分別為Swa1、Swb1、sw2、sw3、sw4和sw5。在番茄抗病育種中，由于sw5基因?qū)SWV不同小種具有很高的廣譜抗性, 因而尤其受到重視。

為了將SW5高效率地應(yīng)有于番茄育種中，眾多研究者開發(fā)了該基因的分子標(biāo)記，其中以Dianese等的工作最為有效，利用SW5序列開發(fā)了一個(gè)共顯性SCAR標(biāo)記SW5-2，利用該標(biāo)記篩選的結(jié)果穩(wěn)定性好，為番茄斑萎病毒抗病基因SW5-2的分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

番茄生產(chǎn)上經(jīng)常發(fā)生的另一種病害就是番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TY）。從1994年至今，人們已經(jīng)開發(fā)了與5個(gè)抗TYLCV基因TY1—TY5緊密連鎖的可用于抗性基因選擇的分子標(biāo)記，目前生產(chǎn)上利用較多的抗性基因是TY1、TY2、TY3、TY3a。TY-1是最早發(fā)現(xiàn)的抗性基因，屬于不完全顯性，通常表現(xiàn)為耐病。TY-2屬于顯性基因，但抗性表現(xiàn)出地區(qū)差異。TY-3和TY3a在抗性遺傳中呈加性顯性效應(yīng)，對不同的TY種均具較高的抗性，成為目前抗TY品種選育的主要來源。Ji等人（2007）建立了SCAR標(biāo)記可以鑒定等基因基因TY3、TY3a。

在育種中，SW5和TY3被認(rèn)為是主效基因，為了提高番茄對這兩種病的抗性，育種工作者可同時(shí)將這兩個(gè)基因通過有性雜交的方式導(dǎo)入某個(gè)品種。而在雜交后代群體中選擇出兩個(gè)基因合一的符合育種目標(biāo)的個(gè)體是一個(gè)耗時(shí)、耗力的過程。由于受時(shí)間、環(huán)境和地域限制較少，所以應(yīng)用不同的分子標(biāo)記對抗病基因進(jìn)行輔助選擇，可以大幅度提高所需品種選擇的準(zhǔn)確性和選擇效率，縮短育種年限。

目前已開發(fā)出分別檢測這兩個(gè)基因的分子標(biāo)記，能夠區(qū)分抗病、感病材料。未見在一個(gè)反應(yīng)體系中對SW5和TY3標(biāo)記進(jìn)行多重 PCR 的報(bào)道。本試驗(yàn)探索通過多重 PCR 在同一個(gè)反應(yīng)中完成兩個(gè)標(biāo)記的擴(kuò)增，為番茄抗性育種分子標(biāo)記相關(guān)研究提供一種更加省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)有效的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

一種利用雙重PCR技術(shù)同時(shí)檢測SW-5和 TY3基因的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

（1）方法：取番茄植株的葉片，提取總DNA；

（2）引物的設(shè)計(jì)與合成

（3） 單管PCR擴(kuò)增：

PCR總體積為25μL，其中包括10×反應(yīng)緩沖液（含Mg^2＋）2.5μL，dNTP混合物（2.5mmol/L） 0.5μL，上游引物（10μmol/L） 2.5μL，下游引物（10μmol/L）2.5μL，模板 DNA （1 ng /μL ）2μL，DNA聚合酶（5 U/μL ）0.5μL，其余用水補(bǔ)足。反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min ;94 ℃30 s ，50 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在 4℃保存；

PCR 反應(yīng)體系擴(kuò)增：

模 DNA（1 ng /μL ）2μL ， dNTP（2.5mmol/L） 1μl，10×Buffer 2.5μl， Taq 酶（5 U/μL） 0.5μl，引物SCAR3F F/R（10mM）為2μl，引物SW-5-2F/R（10mM）為2μl的引物濃度配比, 加 ddH2O 至25μl，反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min；94 ℃30 s ，50 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。

本發(fā)明更進(jìn)一步公開了利用雙重PCR技術(shù)檢測SW-5和 TY3基因的方法在用于同時(shí)檢測SW-5和 TY3基因節(jié)省時(shí)間方面的應(yīng)用。

本發(fā)明更加詳細(xì)的描述如下：

1 材料和方法

1.1材料

含有SW-5和TY3a雙基因的番茄品種“思貝德”（先正達(dá)(Syngenta)公司）自交3代后得到的單株206,207,208; 含有SW-5雜合基因的材料為“思貝德”（F1）代號(hào)為205；含有TY3a的材料為“齊達(dá)利” （先正達(dá)(Syngenta)公司的F2代單株，代號(hào)為301，302；不含有這兩個(gè)抗性基因的品種為中雜106（中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所）代號(hào)401。

注：TY-3a/ TY-3a為抗性純合基因型，能擴(kuò)增出630bp的條帶；TY-3a/ty3a為抗性雜合基因型，能擴(kuò)增出630bp和320bp的條帶；ty3a /ty3a為抗感病基因型，能擴(kuò)增出320bp的條帶；SW-5/sw-5為抗性雜合基因型，能擴(kuò)增出570bp, 464bp的條帶；sw-5/ sw-5為抗感病基因型，能擴(kuò)增出464bp的條帶。

方法

1.2.1 DNA 提取 取番茄植株的葉片，按王關(guān)林的CTAB法提取總DNA（王關(guān)林，植物基因工程，第2版，北京：科學(xué)出版社，2002）。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Dianese等人（Molecular Breeding，2010 ,25(1): 133―142）設(shè)計(jì)的一對引物用來檢測TY3a基因的引物SCAR3F/R，依Ji等人（http://www.plantpath.wisc.edu/Geminivirus Resistant Tomato/Markers/MAS-Protocols/Ty3a-allele.pdf; Ji et al.,2007;）設(shè)計(jì)的引物，用于擴(kuò)增TY-3a分子標(biāo)記片段。引物序列分別如表1。

表1 雙重PCR所用引物

注：含有SW5基因的材料能擴(kuò)出570bp大小的條帶，不含有該基因的材料能擴(kuò)出464bp的條帶，雜合型擴(kuò)出570bp和464bp兩條帶；含有TY3a基因的材料能擴(kuò)出630bp的條帶，不含有TY3a基因的材料能擴(kuò)出320bp的條帶,雜合型擴(kuò)出630bp和320bp兩條帶。

1.2.3 單管PCR擴(kuò)增

PCR總體積為25μL，其中包括10×反應(yīng)緩沖液（含Mg^2＋）2.5μL，dNTP混合物（2.5mmol/L） 0.5μL，上游引物（10μmol/L） 2.5μL，下游引物（10μmol/L）2.5μL，模板 DNA（1 ng /μL ）2μL，DNA聚合酶（5 U/μL ）0.5μL，其余用水補(bǔ)足。反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min ;94 ℃30 s ，50 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在 4℃保存。

1.2.4 雙重PCR擴(kuò)增

影響雙重PCR體系的因素很多，其中最主要的就是引物的配比。在本實(shí)驗(yàn)中利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的引物配比。其它因素一致，只是修改引物在體系中的濃度。

表2：各體系引物配比

PCR 反應(yīng)其它參數(shù)采用以下體系進(jìn)行擴(kuò)增：

模板 DNA（1 ng /μL ）2μl， dNTP（2.5mmol/L） 1μl，10×Buffer 2.5μl， Taq 酶（5 U/μL） 0.5μl，引物濃度配比選擇體系1（SCAR3F F/R（10mM）為2μl，引物SW-5-2F/R（10mM）為2μl）, 加 ddH2O 至25μl，反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min；94 ℃30 s ，50 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物在 4℃保存。

結(jié)果與分析

2.1SW5擴(kuò)增結(jié)果

對含有SW5基因的品種思貝德的兩個(gè)單株205-1和205-2及對照401利用SW5-2F/R進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增，205-1和205-2擴(kuò)增出570/464bp的條帶，而401只擴(kuò)增出一條464bp條帶。證明205-1和205-2為含有雜合抗性SW-5/sw-5基因型的材料，而401無SW-5基因（圖1）。

擴(kuò)增結(jié)果

利用SCAR3F/R進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明301擴(kuò)出了630bp的條，401擴(kuò)出了320bp的條帶；302擴(kuò)增出了630bp和320bp兩條帶（圖2）。這說明301含有TY3a抗性純合基因，302含有TY3a抗性雜合基因，401不含抗病基因TY3a。

雙重PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增結(jié)果

以含有雙基因的番茄品種“思貝德”自交3代后（F3）的材料206、207、208為實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)對SCAR3F F/R和SW-5-2F/R兩對引物進(jìn)行了引物配比、dNTP濃度調(diào)整等多次試驗(yàn)，最終確定體系為：模 DNA（1 ng /μL ）2μl， dNTP（2.5mmol/L） 1μl，10×Buffer 2.5μl， Taq 酶（5 U/μL） 0.5μl，引物濃度配比選擇體系1（SCAR3F F/R（10mM）為2μl，引物SW-5-2F/R（10mM）為2μl）, 加 ddH2O 至25μl，反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min；94 ℃30 s ，50 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物在 4℃保存。

從圖中可以看出206為含有抗性純合的TY3a且不含有SW-5基因，其基因型為sw-5/ sw-5 TY-3a/ TY-3a；207為含有抗性雜合的TY3a且不含有SW-5基因，其基因型為 sw-5/ sw-5,TY-3a/ty3a；205-1為含有抗性雜合的TY3a和SW-5基因，其基因型為SW-5/sw-5,TY-3a/ty3a。結(jié)果與預(yù)期大小一致，證明該體系可同時(shí)對這兩對引物進(jìn)行擴(kuò)增（圖3），大大節(jié)省了時(shí)間和檢測成本，為番茄的抗病育種提供了切實(shí)可行的分子標(biāo)記檢測方法。

本發(fā)明公開的利用雙重PCR技術(shù)檢測SW-5和 TY3基因的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：

（1）檢測時(shí)間縮短一倍：現(xiàn)有的技術(shù)方法只能對這個(gè)基因進(jìn)行單管擴(kuò)增，時(shí)間在8個(gè)小時(shí)左右，而使用本發(fā)明的檢測方法只需一次PCR即可完成兩個(gè)基因的同時(shí)檢測，時(shí)間約為3個(gè)小時(shí)。

（2）檢測成本減少一倍：現(xiàn)有的技術(shù)方法要分別對兩個(gè)基因進(jìn)行檢測，單份樣品的兩個(gè)基因的檢測成本在30元左右，而使用本發(fā)明的檢測方法只需加一份各反應(yīng)成份，即可完成兩個(gè)基因的同時(shí)檢測，成本約為15元。

附圖說明：

圖1 SW-5-2F/R擴(kuò)增結(jié)果；

圖2 SCAR3F F/R引物擴(kuò)增結(jié)果；

圖3 SCAR3F F/R和SW-5-2F/R的多重PCR。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料、番茄品種及試劑均有市售。

實(shí)施例1

利用雙重PCR技術(shù)同時(shí)檢測SW-5和 TY3基因的方法：

（1）DNA 提?。阂允惺劢螂s214（天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司）為材料，取番茄植株的葉片，提取總DNA；

（2）引物的設(shè)計(jì)與合成：雙重PCR所用引物：

（3） 單管PCR擴(kuò)增：

PCR總體積為25μL，其中包括10×反應(yīng)緩沖液（含Mg^2＋）2.5μL，dNTP混合物（2.5mmol/L） 0.5μL，上游引物（10μmol/L） 2.5μL，下游引物（10μmol/L）2.5μL，模板 DNA（1 ng /μL ）2μL，DNA聚合酶（5 U/μL ）0.5μL，其余用水補(bǔ)足。反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min ;94 ℃30 s ，50 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物在 4℃保存。

（4）雙重PCR擴(kuò)增模板 DNA（1 ng /μL ）2μl， dNTP（2.5mmol/L） 1μl，10×Buffer 2.5μl， Taq 酶（5 U/μL） 0.5μl，引物濃度配比選擇體系1（SCAR3F F/R（10mM）為2μl，引物SW-5-2F/R（10mM）為2μl）, 加 ddH2O 至25μl，反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min；94 ℃30 s ，50 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物在 4℃保存。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

在模板濃度為2μL（10μM）時(shí)可同時(shí)擴(kuò)增出這兩個(gè)基因，證明津雜214含有這兩個(gè)抗性基因。

實(shí)施例2

對比試驗(yàn)：

結(jié)論：

利用本發(fā)明檢測抗斑萎病毒基因SW-5和抗番茄黃化曲葉病毒基因TY-3a的成本和時(shí)間比單管檢測節(jié)約一半，為番茄抗病育種過程中的大批量篩選雙抗植株提供了經(jīng)濟(jì)、高效的檢測方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心

<120> 一種利用雙重PCR技術(shù)檢測SW-5和 TY3基因的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aattaggttc ttgaagccca tct 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttccgcatca gccaatagtg t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtagtggaa atgatgctgc tc 22

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctgccta ttgtcccata tataacc 27