本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)R34W(C100T)序列的引物、方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

先天性角化不良癥(dskeratosis eongenita，DC)是一種具有遺傳異質(zhì)性的骨髓衰竭綜合征，發(fā)病率約為1/100萬。典型的DC患者約80％～90％具有皮膚黏膜異常三聯(lián)征，表現(xiàn)為皮膚網(wǎng)狀色素沉著、指(趾)甲萎縮、口腔黏膜白斑。目前文獻(xiàn)報道可引起DC的突變基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文獻(xiàn)報道，這些基因有3種遺傳方式，分別為X-連鎖隱性遺傳、常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳。但目前仍約50％患者遺傳特征不明確。X-連鎖隱性遺傳包括DKC1，常染色體顯性遺傳包括TERC及TINF2，常染色體隱性遺傳包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作為常染色體顯性遺傳又可以作為隱性遺傳的有TERT。NOP10位于15q14-q15位點(diǎn)負(fù)責(zé)編碼端粒酶相關(guān)蛋白復(fù)合體組分蛋白的基因。NOP10蛋白是端粒酶相關(guān)蛋白復(fù)合體的核心蛋白之一，與dyskerin、NHP2、GAR1蛋白共同參與了真核生物核糖體的合成，前體mRNA剪接和端粒的維持。Walne等在先天性角化不良癥患者中發(fā)現(xiàn)NOP10存在突變，該突變縮短了端粒酶的長度，并降低了TERC的表達(dá)量水平。

近年來，通過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)NOP10基因突變在先天性角化不良癥患者中非常常見。文獻(xiàn)報道NOP10基因突變存在p.R34W(C100T)突變熱點(diǎn)，該突變位點(diǎn)位于NOP10基因的第2外顯子，并且能引起該基因第34密碼子精氨酸到色氨酸的改變。該位點(diǎn)的變異能引起端粒酶RNA水平減低及端粒長度明顯縮短，并降低了TERC的表達(dá)量水平。目前國內(nèi)文獻(xiàn)報道的DC病例絕大多數(shù)為30歲左右皮膚受累的臨床病例，病例數(shù)較少，且較少進(jìn)行基因檢測。因此有必要進(jìn)行相關(guān)基因的突變檢測，有必要先對患者進(jìn)行R34W突變進(jìn)行篩選，有助于對先天性角化不良癥的早期診斷，減少誤診、漏診，并進(jìn)行治療。

本發(fā)明采用Touch-down PCR擴(kuò)增和Sanger測序法檢測NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)R34W(C100T)序列的突變，并且設(shè)計(jì)的引物可以擴(kuò)展整個第2號外顯子全外顯子序列，包括待檢測的所有突變位點(diǎn)。Touch-down PCR擴(kuò)增可確保正、反向擴(kuò)增引物與樣本DNA模板的結(jié)合發(fā)生在最互補(bǔ)的序列之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴(kuò)增發(fā)生的水平時，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在此時已經(jīng)有一個幾何數(shù)的起始優(yōu)勢，豐度較高，在剩余的擴(kuò)增反應(yīng)中，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生競爭，但是因非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較低，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物始終優(yōu)先擴(kuò)增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。而Sanger測序法是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高，并且很大程度上地節(jié)省了檢測成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供檢測NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)R34W(C100T)序列的引物，其特征在于，包括：擴(kuò)增NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)R34W(C100T)序列的正、反向引物；其堿基序列為：

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC。

進(jìn)一步地，所述引物還包括一對測序引物，其堿基序列為

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

進(jìn)一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為：NOP10-F:NOP10-R＝1:1。

進(jìn)一步地，所述一對測序引物的使用濃度比為：M13-F:M13-R＝1:1。

進(jìn)一步地，所述正、反向擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，95℃預(yù)變性10min；第二階段，變性溫度94℃30sec，退火溫度64℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度94℃30sec，退火溫度58℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)R34W(C100T)序列的方法，其包括如下步驟：

(1)提取樣本DNA；

(2)利用一對擴(kuò)增引物NOP10-F和NOP10-R對(1)中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)利用一對測序引物M13-F和M13-R對(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列；

(4)將(3)中的基因序列與NOP10基因野生型參考序列NOP10-ref進(jìn)行比較，確定突變位點(diǎn)是否存在，其特征在于，

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

進(jìn)一步地，步驟(2)中的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，95℃預(yù)變性10min；第二階段，變性溫度94℃30sec，退火溫度64℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度94℃30sec，退火溫度58℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)

R34W(C100T)序列的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括樣本DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應(yīng)液包括一對擴(kuò)增產(chǎn)物NOP10-F和NOP10-R，測序體系反應(yīng)液包括一對測序引物NOP10-F和NOP10-R，其特征在于：

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

進(jìn)一步地，所述試劑盒包括NOP10基因野生型參考序列NOP10-ref。

進(jìn)一步地，所述測序純化液包括由蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I組成的測序純化液。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)R34W(C100T)序列的正，反向引物，構(gòu)建了穩(wěn)定的Touch-down PCR擴(kuò)增體系，對整個第2號外顯子全外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增，包含待檢測的所有突變位點(diǎn)，同時在擴(kuò)增時，富集正、反向引物與模板正確配對的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，提高擴(kuò)增特異性。此外，通過調(diào)整正、反向擴(kuò)增引物的濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率達(dá)到最佳，并采用Sanger測序法，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)擴(kuò)增、純化后變性、直接測序檢測NOP10基因第2號外顯子突變位點(diǎn)R34W(C100T)序列中各突變位點(diǎn)的突變情況，具有靈敏度高、操作簡單和成本低等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1 NOP10基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果圖。M為TAKARA DL2000。

圖2樣本1NOP10基因R34W檢測結(jié)果圖。

圖3樣本2NOP10基因R34W檢測結(jié)果圖。

圖4樣本3NOP10基因R34W檢測結(jié)果圖。

圖5樣本4NOP10基因R34W檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實(shí)施例1

檢測NOP10基因第2號外顯子全外顯子序列的引物，包括：擴(kuò)增NOP10基因第2號外顯子全外顯子序列的正、反向引物；其堿基序列為：

NOP10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGACCATTGCATCTTCTATTTTC

NOP10-R：AACAGCTATGACCATGTCCCTTTATGGGTGATGCCAC。

優(yōu)選地，所述引物還包括一對測序引物，其堿基序列為

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

在檢測中，先利用上述正、反向引物對NOP10基因第2號外顯子全外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，然后利用上述一對測序引物對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列。

檢測NOP10基因第2號外顯子全外顯子序列的試劑盒，包括：樣本DNA抽提試劑(例如使用天根生物的試劑盒來抽提樣本DNA)；無水乙醇；檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中

檢測體系PCR反應(yīng)液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；擴(kuò)增NOP10基因第2號外顯子全外顯子序列的正、反向引物NOP10-F(10μm)、NOP10-R(10μm)。

測序體系反應(yīng)液包括：測序純化液、EDTA(125mmol)、無水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去離子甲酰胺)、測序引物：NOP10-F(3.2μm)、NOP10-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(購買自美國Applied Biosystems公司)，其中測序純化液包括蝦堿性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。

檢測體系PCR反應(yīng)液試劑配制如下：

其中，NOP10-F和NOP10-R的堿基序列為：

陽性對照品：含有NOP10序列的溶液。

陰性對照品：無NOP10序列的溶液。

空白對照品：2μl生理鹽水或不加任何物質(zhì)。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括NOP10基因野生型參考序列NOP10-ref，其堿基序列如下所示：

TTGACCATTGCATCTTCTATTTTCATGTTTGCCCTTTTTCGCGCTGGCCCCACCCCATTTCATCACTCCTGTACTGACATACATTCTGTGTTCCTGGAGCAGAAATTTGACCCGATGGGACAACAGACCTGCTCAGCCCATCCTGCTCGGTTCTCCCCAGATGACAAATACTCTCGACACCGAATCACCATCAAGAAACGCTTCAAGGTGCTCATGACCCAGCAACCGCGCCCTGTCCTCTGAGGGTCCCTTAAACTGATGTCTTTTCTGCCACCTGTTACCCCTCGGAGACTCCGTAACCAAACTCTTCGGACTGTGAGCCCTGATGCCTTTTTGCCAGCCATACTCTTTGGCATCCAGTCTCTCGTGGCGATTGATTATGCTTGTGTGAGGCAATCATGGTGGCATCACCCATAAAGGGA。

實(shí)施例2

檢測流程：

(1)利用血液DNA抽提試劑盒(天根生物)提取血液樣本中的基因組DNA:

1)抽取500uL血液加入1000uL紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。3000rpm離心5min，吸去上清，留下白細(xì)胞沉淀，加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混勻。

3)加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

4)加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液。

9)將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12,000rpm(13,400×g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中，獲得血液基因組DNA溶液。

(2)試劑配置：按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應(yīng)液各Xμl，每人份18μl分裝：X＝18μl反應(yīng)液×(n份樣本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)n為檢測樣本數(shù)。

(3)加樣：將2ul步驟(1)中獲得的血液基因組DNA溶液加入到檢測體系PCR反應(yīng)液中；對陽性對照實(shí)驗(yàn)而言，直接加2ul陽性對照品；對陰性對照實(shí)驗(yàn)而言，直接加2ul陰性對照品；對空白對照實(shí)驗(yàn)而言，加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)。

(4)Touch-down PCR擴(kuò)增：檢測在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可用儀器包括ABI veriti(美國Applied Biosystems公司)等。反應(yīng)條件如下：

(5)Sanger測序：

取9μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2μl測序純化液。按照以下程序進(jìn)行純化，從而獲得純化產(chǎn)物：

將1μl純化產(chǎn)物分別與測序引物M13-F(3.2μm)和M13-R(3.2μm)按照如下體系進(jìn)行混合：

測序反應(yīng)程序：

沉淀環(huán)節(jié)：

向完成測序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入2μl 125mmol的EDTA，靜置5min；加入15ml無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50ml 70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μl HIDI后進(jìn)行變性試驗(yàn)。變性程序：

變性程序結(jié)束后，上測序儀(ABI3730)測序，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列。

(6)結(jié)果判斷：將(5)中獲得的基因序列與NOP10基因野生型參考序列NOP10-ref進(jìn)行比對，根據(jù)實(shí)際突變情況對結(jié)果進(jìn)行報告。

實(shí)施例3

采用本發(fā)明核酸檢測試劑盒檢測臨床樣本。

取送檢先天性角化不良患者抗凝血樣本20例，按實(shí)施例2所述檢測流程提取樣本中的基因組DNA，配制試劑并檢測。

將2ul按照實(shí)施例2中所述檢測流程提取出的每份樣本基因組DNA溶液加入檢測體系PCR反應(yīng)液中。同時做陽性、陰性和空白對照。用普通PCR儀檢測，時間為160分鐘。

電泳結(jié)果如圖1所示，表明本發(fā)明所述引物NOP10-F、NOP10-R對血液樣本能有效擴(kuò)增，且條帶單一。

樣品1的NOP10基因R34W正向測序結(jié)果如圖2所示，為野生型，未檢測出R34W突變。

樣品2的NOP10基因R34W正向測序結(jié)果如圖3所示，為野生型，未檢測出R34W突變。

樣品3的NOP10基因R34W正向測序結(jié)果如圖4所示，為野生型，未檢測出R34W突變。

樣品4的NOP10基因R34W正向測序結(jié)果如圖5所示，為野生型，未檢測出R34W突變。

檢測結(jié)果如表1：

表1

從檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明所述引物已經(jīng)把NOP10基因第2號外顯子全外顯子序列序列包括在內(nèi)了，并且測序結(jié)果完全準(zhǔn)確。對陽性標(biāo)本的檢測表明本發(fā)明所述引物和方法及試劑盒能夠檢測出NOP10基因突變。