本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種魯氏不動(dòng)桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter lwoffii)廣泛存在于自然界中，主要在水和土壤中，在牛奶、奶制品、家禽及冷凍食品中亦可檢出本菌。魯氏不動(dòng)桿菌是重要的機(jī)會(huì)致病菌，常引發(fā)敗血癥，肺炎，心內(nèi)膜炎等^[1]，此外，魯氏不動(dòng)桿菌可產(chǎn)生耐熱的蛋白酶和脂肪酶破壞食品成分，熱殺菌處理可以破壞魯氏不動(dòng)桿菌，但這些耐熱酶的活性基本不受影響，甚至經(jīng)過超高溫殺菌處理后仍能保持部分活性，它們在食品貯藏的過程中將繼續(xù)分解蛋白質(zhì)和脂肪，從而導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生變化，最終對食品品質(zhì)產(chǎn)生不良影響：(1)蛋白酶分解乳蛋白將導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)苦，水解過程中釋放的氨基酸會(huì)使褐變反應(yīng)加??；(2)蛋白酶分解酪蛋白會(huì)引起蛋白膠凝化；(3)脂肪酶分解脂肪球膜，將釋放出自由脂肪酸，導(dǎo)致脂肪聚合上浮，產(chǎn)生一系列的風(fēng)味缺陷，例如乳酪味、魚味、麥芽味、腐爛味、肥皂味、不潔味或酵母味等等^[2]。由此可見，魯氏不動(dòng)桿菌是影響食品工業(yè)發(fā)展的重要因素之一，快速、準(zhǔn)確地檢測食品中魯氏不動(dòng)桿菌含量對提高乳制品品質(zhì)，加強(qiáng)企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益有戰(zhàn)略意義。

常規(guī)測定原料乳中魯氏不動(dòng)桿菌的方法是利用培養(yǎng)基分離鑒定，或者通過普通的PCR方法進(jìn)行檢測。其中，培養(yǎng)基分離鑒定法在實(shí)際操作中非常繁瑣，且容易受到環(huán)境中雜菌的污染：而普通PCR方法相較于傳統(tǒng)的分離鑒定檢測法，雖然較為靈敏快捷，但是對魯氏不動(dòng)桿菌在菌液中的含量以及雜菌數(shù)量等方面要求較為嚴(yán)格，且有可能出現(xiàn)假陽性與假陰性等結(jié)果，使篩選出的食品污染程度出現(xiàn)偏差。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于食品中的微生物檢測^[3]。

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌基因組內(nèi)的某些序列具有高度的保守性，這些高度保守的基因序列為生物的科、屬、種的鑒定提供了基礎(chǔ)^[4]。因此，可根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)特異的PCR引物來對食品中的微生物進(jìn)行檢測。關(guān)晶巖^[5]等根據(jù)假單胞菌屬的16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了熒光定量PCR檢測原料乳中假單胞菌的方法，研究結(jié)果表明，該法可在10h內(nèi)快速、穩(wěn)定地檢出原料乳中的假單胞菌，檢測限低于10³cfu/mL。Martins^[6]等借助PCR技術(shù)檢測乳中攜帶apr基因的假單胞菌，apr基因可編碼一種堿性金屬蛋白酶，結(jié)果顯示在人為污染的牛奶中假單胞菌的最低檢出限是10⁵cfu/mL。研究發(fā)現(xiàn)，魯氏不動(dòng)桿菌的β-內(nèi)酰胺酶基因可作為特異性識別序列^[7]。

參考文獻(xiàn)

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種魯氏不動(dòng)桿菌熒光定量PCR引物及檢測方法，以靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確地定量檢測食品中的魯氏不動(dòng)桿菌，如原料乳中、乳制品中的魯氏不動(dòng)桿菌，為食品廠在生產(chǎn)上有效控制魯氏不動(dòng)桿菌的數(shù)量，減少其對產(chǎn)品品質(zhì)的危害，提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)，對保障食品安全具有重要意義。本發(fā)明的基本原理是，通過基因組比對，尋找魯氏不動(dòng)桿菌中的特異性識別序列，以此設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR檢測食品中的魯氏不動(dòng)桿菌。采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法進(jìn)行檢測，靈敏度及特異性好。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種魯氏不動(dòng)桿菌熒光定量PCR檢測引物，其核苷酸序列如下：

AL-F：TTATTTGATCAGGCGCAAAG，

AL-R：CGTTTCTTGCCATCCCATTTA。

本發(fā)明提供了一種魯氏不動(dòng)桿菌熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，采用熒光定量PCR方法擴(kuò)增魯氏不動(dòng)桿菌，其中所使用的引物的核苷酸序列如下：

AL-F：TTATTTGATCAGGCGCAAAG，

AL-R：CGTTTCTTGCCATCCCATTTA；

在55℃退火階段收集熒光值，即Ct_樣品值，并在上述擴(kuò)增條件后增加60℃至95℃的融解曲線分析，以確定產(chǎn)物是否單一，進(jìn)而反映引物的特異性；

可選地，所述的熒光定量PCR方法中使用的熒光染料為SYBR Green I。

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與檢測結(jié)果判定：根據(jù)所選用的模式細(xì)菌在其濃度為×10²、×10³、×10⁴、×10⁵、×10⁶、×10⁷時(shí)對應(yīng)的Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值，建立魯氏不動(dòng)桿菌的細(xì)菌數(shù)lg_{標(biāo)準(zhǔn)}(cfu/mL)與Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且將步驟2)所得的待測樣本Ct_樣品值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定樣品中的魯氏不動(dòng)桿菌的數(shù)量。

可選地，上述檢測方法具體包括以下步驟：

1)提取待測樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，采用基于SYBR Green I的熒光定量PCR方法擴(kuò)增魯氏不動(dòng)桿菌，其中所使用的引物的核苷酸序列如下：

AL-F：TTATTTGATCAGGCGCAAAG，

AL-R：CGTTTCTTGCCATCCCATTTA；

在55℃退火階段收集熒光值，即Ct_樣品值，并在上述擴(kuò)增條件后增加60℃至95℃的融解曲線分析；

進(jìn)一步地，當(dāng)使用SYBR Green I熒光定量測試方法時(shí)，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，AL-F 0.8μL，AL-R 0.8μL，DNA模板2.0μL，ddH₂O 6.0μL，Rox Reference DyeⅡ0.4μL；

進(jìn)一步地，所述的熒光定量PCR方法中，PCR反應(yīng)條件為：95℃30s；95℃5s，55℃34s，40個(gè)循環(huán)；

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：選用A.lwoffii ATCC1530為模式細(xì)菌，根據(jù)其濃度為2.4×10²、2.4×10³、2.4×10⁴、2.4×10⁵、2.4×10⁶、2.4×10⁷時(shí)對應(yīng)的Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值，建立魯氏不動(dòng)桿菌的細(xì)菌數(shù)lg_{標(biāo)準(zhǔn)}(cfu/mL)與Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-3.838x+40.93，R²＝0.993；

4)檢測結(jié)果判定：將步驟2)所得的待測樣本Ct_樣品值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定樣品中的魯氏不動(dòng)桿菌的數(shù)量。

本發(fā)明還提供了上述魯氏不動(dòng)桿菌熒光定量PCR檢測引物，以及魯氏不動(dòng)桿菌熒光定量PCR檢測方法在檢測食品魯氏不動(dòng)桿菌方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案達(dá)到的有益效果是：

1)本發(fā)明根據(jù)不動(dòng)桿菌屬微生物的基因組比對，確定OXA134家族的β-內(nèi)酰胺酶基因作為魯氏不動(dòng)桿菌的特異性保守基因序列，以此設(shè)計(jì)一對特異性引物，成功建立了魯氏不動(dòng)桿菌的熒光定量PCR檢測方法。該方法特異性強(qiáng)，對食品中常見的微生物均檢測不到熒光信號，僅對魯氏不動(dòng)桿菌檢測為陽性，可以快速準(zhǔn)確地檢測食品中是否存在魯氏不動(dòng)桿菌，整個(gè)檢測耗時(shí)短，與常規(guī)培養(yǎng)檢測法相比大大提高了檢測效率；

2)本發(fā)明的魯氏不動(dòng)桿菌的熒光定量PCR檢測方法的靈敏度較高，其靈敏度可達(dá)到240cfu/mL，可用于食品中魯氏不動(dòng)桿菌的定量檢測，對保障食品安全具有重要意義。

附圖說明

圖1是熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。M:1000bp Marker，1.β-內(nèi)酰胺酶基因PCR產(chǎn)物，2.Control。

圖2是魯氏不動(dòng)桿菌熒光定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3是熒光定量PCR檢測魯氏不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因的敏感性實(shí)驗(yàn)。其中，1-7：2.4×10⁷～2.4×10¹cfu/mL。

圖4常規(guī)PCR檢測魯氏不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因的敏感性實(shí)驗(yàn)。其中，1-7：2.4×10⁷～2.4×10¹cfu/mL。

圖5是魯氏不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因熒光定量PCR擴(kuò)增特異性實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

實(shí)施例1

1.引物的設(shè)計(jì)與合成：

通過比對魯氏不動(dòng)桿菌及其相近菌種的基因組序列，如鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、申氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter schindleri)、溶血不動(dòng)桿菌(Acinetobacter haemolyticus)等，找出魯氏不動(dòng)桿菌的種間特異性序列，然后將此序列進(jìn)行BLAST比對，分析其與非不動(dòng)桿菌屬微生物的同源性，最終確定OXA134家族的β-內(nèi)酰胺酶基因?yàn)轸斒喜粍?dòng)桿菌的特異性保守基因序列。根據(jù)此基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行分析。

設(shè)計(jì)引物時(shí)，首先根據(jù)A.lwoffii ATCC1530的β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列(GenBank：WP_004728961)，比對數(shù)據(jù)庫中的各種魯氏不動(dòng)桿菌，A.lwoffii strain St17095(GenBank：AHA11126.1)、A.lwoffii AL3(GenBank：ADM47435.1)和A.lwoffii strain S459(GenBank：ALM26450.1)，找出種間保守序列區(qū)段；再對該段氨基酸序列的編碼區(qū)序列進(jìn)行DNAMAN軟件同源比對，設(shè)計(jì)引物AL-F和AL-R如下：

AL-F：TTATTTGATCAGGCGCAAAG，

AL-R：CGTTTCTTGCCATCCCATTTA。

2.通過A.lwoffii ATCC1530β-內(nèi)酰胺酶基因序列的克隆，實(shí)現(xiàn)所設(shè)計(jì)引物的正確性的檢測：

利用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取A.lwoffii ATCC1530的總DNA，使用上述引物序列AL-F和AL-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL；AL-F 0.8μL，AL-R 0.8μL；DNA模板2.0μL；ddH₂O 6.0μL；Rox Reference DyeⅡ50x 0.4μL；

PCR反應(yīng)條件為：95℃30s；95℃5s，55℃34s，40個(gè)循環(huán)；在55℃退火。

將所獲得的PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果(見圖1)顯示，擴(kuò)增魯氏不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因部分片段197bp?；厥漳康臈l帶并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109，鑒定正確后送上海生工測序。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，與擬克隆的基因序列一致，說明A.lwoffii ATCC15309β-內(nèi)酰胺酶基因序列擴(kuò)增正確。

3.熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

a)使用A.lwoffii ATCC1530為繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的模式細(xì)菌，它可代表其它魯氏不動(dòng)桿菌。將A.lwoffii ATCC1530在腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，根據(jù)GB4789.2-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)--菌落總數(shù)測定中的方法定量菌液，經(jīng)10倍梯度稀釋，得到不同濃度菌液：2.4×10¹、2.4×10²、2.4×10³、2.4×10⁴、2.4×10⁵、2.4×10⁶、2.4×10⁷cfu/mL。

b)采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取不同濃度菌液的基因組DNA；

c)使用SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件如上面2中所述；此外，在55℃退火階段收集熒光值，即Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值，并在上述擴(kuò)增條件后增加60℃至95℃的融解曲線分析，每個(gè)樣本3個(gè)平行；

d)進(jìn)行熒光定量PCR后得到每個(gè)濃度的Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值，這個(gè)值對應(yīng)熒光信號初次被檢測到時(shí)的循環(huán)數(shù)，可以反映模板初始量，以細(xì)菌數(shù)的lg_{標(biāo)準(zhǔn)}值和Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值制作細(xì)菌懸液的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝-3.838x+40.93，相關(guān)系數(shù)為0.993(圖2)，說明本發(fā)明建立的檢測方法可以準(zhǔn)確定量檢測食品中的A.lwoffii；且其檢測限為×10²cfu/mL。

實(shí)施例2

在實(shí)施例2中，使用本發(fā)明提供的檢測魯氏不動(dòng)桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測不同月份(11、12、1、2月)從江蘇省揚(yáng)州市8個(gè)奶牛場中取樣的原料乳，以確定每個(gè)牧場的原料乳是否污染了魯氏不動(dòng)桿菌(A.lwoffii)，以此監(jiān)控每個(gè)牧場的奶源質(zhì)量。

具體方法如下：

(1)提取待測原料乳樣品中的DNA：

取1mL原料乳，12000g/min離心5min，棄上層脂肪，無菌生理鹽水洗滌兩次，12000g/min離心2min，然后采用專利《從牛奶中提取總DNA的方法》(專利申請?zhí)枺?00810115822.9)中的方法提取下層沉淀中的DNA。

(2)以步驟(1)中所提取的DNA為模板，熒光定量PCR擴(kuò)增魯氏不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因部分片段；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL，包括：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL、上游引物AL-F 0.8μL、下游引物AL-R 0.8μL、DNA模板2.0μL、ddH₂O 6.0μL和Rox Reference DyeⅡ0.4μL；其中，所述的上游引物AL-F與下游引物AL-R的核苷酸序列見實(shí)施例1的步驟1)引物的設(shè)計(jì)與合成。

PCR反應(yīng)條件為：95℃30s；95℃5s，55℃34s，40個(gè)循環(huán)；在55℃退火階段收集熒光值Ct_樣品，并在上述擴(kuò)增條件后增加60℃至95℃的融解曲線分析。

(3)檢測結(jié)果判定：參照實(shí)施例1中3d)所建立的魯氏不動(dòng)桿菌的細(xì)菌數(shù)lg_{標(biāo)準(zhǔn)}(cfu/mL)與Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定細(xì)菌濃度為2.4×10²、2.4×10³、2.4×10⁴、2.4×10⁵、2.4×10⁶、2.4×10⁷時(shí)對應(yīng)的Ct_{標(biāo)準(zhǔn)}值。根據(jù)步驟(2)所得的待測樣本Ct_樣品值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝-3.838x+40.93，R²＝0.993)，確定原料乳中的魯氏不動(dòng)桿菌的數(shù)量。

在對32份原料乳樣品進(jìn)行的檢測中，常規(guī)PCR并未檢測出A.lwoffii陽性樣品，而熒光定量PCR方法檢測出A.lwoffii陽性樣品2份，Ct值介于30-31之間，陽性率為6.25％。由此可見，本發(fā)明可用于原料乳中魯氏不動(dòng)桿菌的定量檢測，對保障乳制品的安全具有重要意義。

實(shí)施例3

本實(shí)施例3中比較了本發(fā)明熒光定量PCR檢測方法與常規(guī)PCR的敏感性。

以實(shí)例1中步驟4)所獲得的不同濃度菌液的基因組DNA為模板，AL-F和AL-R為引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為：95℃3min，30個(gè)循環(huán)(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，72℃10min。由圖4可見，常規(guī)PCR檢測A.lwoffii的靈敏度是2.4×10³cfu/mL；將其與圖3所示的本發(fā)明熒光定量PCR檢測的最低菌落數(shù)(2.4×10²cfu/mL)相比，本發(fā)明的靈敏度明顯高于普通PCR檢測。

實(shí)施例4

本實(shí)施例4中，利用本發(fā)明提供的引物及熒光定量PCR方法(見實(shí)施例2)對8種乳中的常見微生物(阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、熒光假單胞菌)進(jìn)行擴(kuò)增，并選取A.lwoffii ATCC1530作為陽性對照，檢測本發(fā)明方法的特異性。

結(jié)果(見圖5)顯示只有A.lwoffii ATCC1530樣品出現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光信號，而其余8個(gè)樣品未出現(xiàn)相應(yīng)的熒光信號，由此可見本發(fā)明的特異性強(qiáng)。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。