技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于食品安全的分子生物學(xué)檢測方法領(lǐng)域，特別涉及一種鼠傷寒沙門氏菌LAMP引物組及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：
：

沙門氏菌（Salmonella spp.）是一大群寄生于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌，是腸桿菌科中最常見的人畜共患型致病菌。目前已知的沙門氏菌超過2000種，而且?guī)缀跛械纳抽T氏菌都能引起嚴(yán)重的食物中毒事件，世界衛(wèi)生組織（WTO）將沙門氏菌列入具有嚴(yán)重危害和中等危害的食物傳播性病原菌。食物傳播是人類感染沙門氏菌的主要途徑，在我國細(xì)菌性食物中毒中，有70%-80%是由沙門氏菌引起的，而引起沙門氏菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）屬沙門氏菌B群，是常見的沙門氏菌致病的血清型之一。

目前，對沙門氏菌的檢測主要是以傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、血清型實(shí)驗(yàn)和生化鑒定等方法為主，存在操作繁瑣、靈敏度低和準(zhǔn)確率不高等缺陷，不能滿足及時(shí)有效的質(zhì)量監(jiān)測和疾病控制需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的診斷技術(shù)如酶聯(lián)免疫、免疫熒光、PCR等方法檢測病原核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子廣泛應(yīng)用到沙門氏菌的檢測中，但特異性差及假陽性高以及對設(shè)備儀器較高要求不能滿足現(xiàn)場快速檢測和基層普及的需求。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是21世紀(jì)初Notomi等幾位日本學(xué)者報(bào)道的一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNAploymerase），在恒溫條件（60℃-65℃）下作用幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在保持傳統(tǒng)PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性，同時(shí)縮短了檢測時(shí)間，具有良好的發(fā)展前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于提供一組特異性好、靈敏度高和通用性強(qiáng)的用于檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP引物組。

本發(fā)明根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌侵襲蛋白A（invA）基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，應(yīng)用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer. jp/elamp4.0.0/index.html）在線設(shè)計(jì)特異引物組，利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平上實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測，為鼠傷寒沙門氏菌檢測提供了有效且快速的核酸篩查檢測方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種鼠傷寒沙門氏菌的LAMP檢測試劑盒及使用方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種鼠傷寒沙門氏菌的LAMP引物組，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

SainvA-F3:GGTCGTTCTACATTGACAGAA，

SainvA-B3:CGACACGTTCTGAACCTT；

SainvA-FIP: CGGCATCGGCTTCAATCAAGGGTACTGTTAATTACCACGCT，

SainvA-BIP:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGGTGACAATAGAGAAGACAACA；

SainvA-LF:TGGTACTGATCGATAATGCCAG，

SainvA-LB:TATTGGCGATAGCCTGGC。

一種鼠傷寒沙門氏菌的LAMP檢測試劑盒，包括以下物質(zhì)：（1）DNA聚合酶；（2）2×反應(yīng)緩沖液；（3）熒光染料；（4）密封液；（5）標(biāo)準(zhǔn)陽性模板；（6）陰性對照；（7）上述的LAMP引物組。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述的引物組濃度比例如下：外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：1-2：4-8：2-4。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述2×反應(yīng)緩沖液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，三者的體積比為10：8：7。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述熒光染料為濃度是0.02mM的SYTO-9。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述密封液為礦物油。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA；所述的陰性對照為滅菌超純水。

使用上述的LAMP檢測試劑盒檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

（1）待檢樣品的提取：采用水煮法從待檢樣品中提取DNA；

（2）反應(yīng)體系及條件：25μl反應(yīng)體系含有：SainvA-F3 0.2μM，SainvA-B3 0.2μM，SainvA-FIP 0.8μM，SainvA-BIP 0.8μM，SainvA-LF 0.4μM，SainvA-LB 0.4μM，2×反應(yīng)液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補(bǔ)齊至25μl；密封液加入體積為20μl；同時(shí)設(shè)置陽性對照和陰性對照；

將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應(yīng)30～45min，并在80℃持續(xù)2min；

（3）檢測結(jié)果判斷：將上述反應(yīng)管置于熒光PCR儀（如ABI stepone，ZYD-S1）中，根據(jù)擴(kuò)增曲線來判斷檢測結(jié)果。擴(kuò)增曲線呈“S”形，檢測結(jié)果為陽性，即檢測樣品中含有屬傷寒沙門氏菌；無“S”形擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陰性，即檢測樣品不含有鼠傷寒沙門氏菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）本發(fā)明采用的LAMP引物組在常規(guī)的LAMP檢測4條引物的基礎(chǔ)上增加了2條環(huán)引物，加快了擴(kuò)增速度，并提高擴(kuò)增效率。

（2）本發(fā)明采用SYTO-9染料作為熒光指示劑，可在配制反應(yīng)體系中添加，避免了反應(yīng)后打開蓋子添加造成的氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)，并減少了反應(yīng)步驟。

（3）本發(fā)明結(jié)果判斷簡單，可通過觀察擴(kuò)增曲線判斷檢測樣品陰陽性，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場檢測。

附圖說明：

圖1為LAMP靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；其中，從左至右依次為濃度1ng/μl、100pg/μl、10 pg/μl和1pg/μl鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA模板LAMP反應(yīng)結(jié)果。

圖2為LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)的說明，但不應(yīng)該當(dāng)作對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：一種鼠傷寒沙門氏菌的LAMP引物的設(shè)計(jì)合成和檢測試劑盒的建立

（1）LAMP引物的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以鼠傷寒沙門氏菌invA基因作為靶基因，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計(jì)包括環(huán)引物在內(nèi)的6條LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，6條引物序列如下：

SEQ NO.1：SainvA-F3:GGTCGTTCTACATTGACAGAA

SEQ NO.2：SainvA-B3:CGACACGTTCTGAACCTT

SEQ NO.3：SainvA-FIP: CGGCATCGGCTTCAATCAAGGGTACTGTTAATTACCACGCT

SEQ NO.4：SainvA-BIP:

GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGGTGACAATAGAGAAGACAACA

SEQ NO.5：SainvA-LF:TGGTACTGATCGATAATGCCAG

SEQ NO.6：SainvA-LB:TATTGGCGATAGCCTGGC

（2）鼠傷寒沙門氏菌LAMP檢測試劑盒除包括上述LAMP引物組外，還包括DNA聚合酶、2×反應(yīng)液、熒光染料、密封液、陽性對照和陰性對照。其中反應(yīng)液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，各成分體積比為10：8：7。

（3）檢測方法：

1）待檢樣品的提?。喊凑誅NA提取試劑盒進(jìn)行。

2）恒溫基因擴(kuò)增檢測反應(yīng)體系及條件：25μl反應(yīng)體系含有：SainvA-F3 0.2μM，SainvA-B3 0.2μM，SainvA-FIP 0.8μM，SainvA-BIP 0.8μM，SainvA-LF 0.4μM，SainvA-LB 0.4μM，2×反應(yīng)液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補(bǔ)齊至25μl。密封液加入體積為20μl。同時(shí)設(shè)置陽性對照和陰性對照。

將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應(yīng)30～45min，并在80℃持續(xù)2min。

3）檢測結(jié)果判斷：將上述反應(yīng)管置于熒光PCR儀（如ABI stepone，ZYD-S1）中，根據(jù)擴(kuò)增曲線來判斷檢測結(jié)果。擴(kuò)增曲線呈“S”形，檢測結(jié)果為陽性，即檢測樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；無“S”形擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陰性，即檢測樣品不含有鼠傷寒沙門氏菌。

實(shí)施例2：LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)

將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)18小時(shí)。應(yīng)用Magen細(xì)菌基因DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌DNA。將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抽提的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl五個(gè)梯度濃度DNA和陰性對照（滅菌超純水）作為模板按照實(shí)施例1的反應(yīng)體系和條件建立檢測方法，以確定試劑盒檢測方法的靈敏性。

參見圖1，結(jié)果表明：將鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，建立的鼠傷寒沙門氏菌LAMP檢測試劑盒可檢測樣品中1pg/μl的鼠傷寒沙門氏菌DNA。

實(shí)施例3：LAMP特異性實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用實(shí)施例1的LAMP檢測試劑盒對金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、單細(xì)胞增生李斯特氏菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌及副溶血性弧菌進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。設(shè)置金黃色葡萄球菌基因組DNA為陽性對照，滅菌超純水為陰性對照。從圖2中可以看出，只有鼠傷寒沙門氏菌出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，呈現(xiàn)陽性結(jié)果，其他菌株均未出現(xiàn)“S”形曲線，呈現(xiàn)陰性結(jié)果直至反應(yīng)時(shí)間延長至60min。說明實(shí)施例1的LAMP反應(yīng)體系只對鼠傷寒沙門氏菌有特異性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中華人民共和國廣州機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局，暨南大學(xué)，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司

<120> 一種鼠傷寒沙門氏菌的LAMP引物組及試劑盒與使用方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列SainvA-F3

<400> 1

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<212> DNA

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<212> DNA

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gtgaaattat cgccacgttc ggggtgacaa tagagaagac aaca 44

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<212> DNA

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tggtactgat cgataatgcc ag 22

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<211> 18

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<213> 人工序列SainvA-LB

<400> 6

tattggcgat agcctggc 18