本發(fā)明涉及一種人乳球蛋白mrna核酸檢測(cè)試劑盒在體外診斷試劑中檢測(cè)人乳球蛋白mrna表達(dá)量上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在全世界危害婦女的腫瘤疾病中中乳腺癌是第一位的惡性腫瘤，每年全世界約有200萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，其中有80萬(wàn)婦女死于乳腺癌。在世界各地之間，女性乳腺癌的發(fā)病率存在顯著差異，20世紀(jì)70年代前以美國(guó)和北歐為高發(fā)地區(qū)，東歐和南歐以及南美其次，亞洲的發(fā)病率最低。但從20世紀(jì)后開(kāi)始亞洲地區(qū)的發(fā)病率出現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，其中以我國(guó)的沿海城市最為顯著，如上海乳腺癌的標(biāo)化發(fā)病率在70年代初和2010年后相比增加了近2.5倍。全世界乳腺癌年均發(fā)病率依然呈逐年增加的趨勢(shì)。近20年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率在我國(guó)也處于總體上升趨勢(shì)。從2000年后，乳腺癌是我國(guó)婦女的第3死亡原因，僅次于胃癌等消化道腫瘤。

現(xiàn)今，乳腺癌依然是人類健康的重大威脅。目前,手術(shù)切除、化療、放療及內(nèi)分泌治療依然是乳腺癌的治療的主要方法。在上述技術(shù)已經(jīng)達(dá)到相當(dāng)成熟和普及的同時(shí)，高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率也依然是乳腺癌患者面臨的主要問(wèn)題，這些問(wèn)題的出現(xiàn)對(duì)患者的有效生存期起著重要的影響，嚴(yán)重危害著腫瘤患者術(shù)后的生活質(zhì)量。那么如何在患者術(shù)后檢測(cè)其腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成了眾多學(xué)者的研究課題。2000年以后，很多學(xué)者都在研究將分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用到人類健康課題上來(lái)，至今已經(jīng)十幾年，由此而發(fā)展的體外檢測(cè)技術(shù)也在不斷成熟和完善中。其中taqman熒光定量pcr就是其中的一種體外診斷技術(shù)。

由于taqman熒光定量pcr具有重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，所以在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面，一些常規(guī)檢測(cè)方法所不能解決的問(wèn)題可以以此解決。一般來(lái)說(shuō)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查可直接觀測(cè)到腫瘤細(xì)胞，但僅限于組織的病理檢測(cè)。由于腫瘤脫落至血循環(huán)中的數(shù)目微小，這種檢查的敏感性和特異性均較差，陽(yáng)性率僅為1%。后期的免疫組織化學(xué)方法提高了檢出率，但該技術(shù)生產(chǎn)復(fù)雜，且需要特異性的抗體，而且假陽(yáng)率也高。taqman熒光定量pcr與這些技術(shù)相比，有著明顯的優(yōu)點(diǎn)，由于有些腫瘤可轉(zhuǎn)錄特異性mrna，但無(wú)相應(yīng)蛋白合成，故熒光定量pcr應(yīng)用范圍較蛋白廣泛；另外只要知道待測(cè)基因序列，即可設(shè)計(jì)合成引物探針進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，操作方便；同時(shí)該方法具有較高的靈敏度及可重復(fù)性，保證了醫(yī)學(xué)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

以人乳腺球蛋白mrna檢測(cè)為例，乳腺球蛋白mrna是乳腺癌的特異性的生物標(biāo)志物，是原發(fā)性乳腺癌特異性較高的腫瘤相關(guān)抗原，在健康人外周血細(xì)胞中檢測(cè)不到人乳球蛋白mrna，而在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，如果癌細(xì)胞脫落于血液中便可以檢測(cè)到。與此同時(shí)，taqman熒光定量pcr技術(shù)具有很好的靈敏性和特異性，有針對(duì)性的對(duì)乳腺癌患者外周血及腫瘤組織﹑骨髓等樣本中的人乳球蛋白的mrna的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，便可以對(duì)乳腺癌細(xì)胞血行播散等診斷提供重要的依據(jù)。所以該技術(shù)的應(yīng)用，將會(huì)對(duì)早期尋找乳腺癌患者血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乳腺外微小轉(zhuǎn)移對(duì)于指導(dǎo)臨床治療、改善患者預(yù)后產(chǎn)生極為重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為一種人乳球蛋白mrna核酸檢測(cè)試劑盒（pcr-熒光探針?lè)ǎ?含有9種組分，分別為：紅細(xì)胞裂解液（10×）、無(wú)rna酶的水、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、pcr緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、rna提取液、2×10⁶copies/μl參考品主要成份組成。

其中紅細(xì)胞裂解液（10×）為nacl，tris-hcl，mgcl2.6h2o配制溶液。

無(wú)rna酶的水為depc-h2o。

反轉(zhuǎn)錄緩沖液和逆轉(zhuǎn)錄酶為takara寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制溶液。

pcr緩沖液含有為invitrogenpcr緩沖液，檢測(cè)探針，上下游引物混合液。

rna提取液為invitrogentrizol原液。

2×10⁶copies/μl參考品為含有目的片段的質(zhì)粒。

檢測(cè)用引物：上游引物：5’—ggcttccttgatccttgcca—3’

下游引物：5’—ctccaataaggggcagccag—3’

熒光探針序列：5’—fam—actgaacaccgacagcagcag—tamra—3’

標(biāo)準(zhǔn)品序列（含酶切位點(diǎn)）：

gaattcgacagcggcttccttgatccttgccacccgcgactgaacaccgacagcagcagcctcaccatgaagttgctgatggtcctcatgctggcggccctctcccagcactgctacgcaggctctggctgccccttattggagaatgtgatttccaagacaatcaatccacaagtgtctaagactgaatacaaagaacttcttcaagagttcatagacgacaatgccactacaaatgccatagatgaattgaaggaatgttttcttaaccaaacggatgaaactctgagcaatgttgaggtgtttatgcaattaatatatgacagcagtctttgtgatttattttaactttctgcaagacctttggctcacagaactgcagggtatggtgagaaaccaactacggattgctgcaaaccacaccttctctttcttatgtctttttactacaaactacaagacaattgttgaaacctgctatacatgtttattttaataaattgatggcagaattc。

質(zhì)控品分為陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品為有人乳球蛋白mrna細(xì)胞裂解液樣品，陰性為無(wú)人乳球蛋白mrna細(xì)胞裂解液樣品。

本試劑盒-20℃冷凍保存，有效期為9個(gè)月。應(yīng)避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)≤7次。rna提取液開(kāi)瓶后，可在4℃保存90天。紅細(xì)胞裂解液稀釋后，未用完時(shí)可在4℃保存24h。試劑盒請(qǐng)?jiān)?℃以下環(huán)境運(yùn)輸。

本試劑盒從新鮮人外周血中提取出總rna并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到含有目的基因片段的cdna，再用乳球蛋白mrna的特異性引物及特異性熒光探針，配以pcr緩沖液、耐熱dna聚合酶（taq酶）、四種核苷酸單體（dgtp、datp、dctp、dutp）及尿嘧啶dna糖基化酶等成分，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)檢測(cè)人外周血乳球蛋白mrna核酸的表達(dá)量，對(duì)原發(fā)性乳腺癌患者的腫瘤細(xì)胞是否存在血行播散提供重要的依據(jù)。

本發(fā)明試劑盒的使用方法：

每次檢測(cè)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性和陰性質(zhì)控。

一．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

按實(shí)際需要量將紅細(xì)胞裂解液用9倍體積的滅菌去離子水稀釋成紅細(xì)胞裂解液稀釋液。

二．總rna提取

1．待測(cè)樣本處理

在50ml無(wú)菌離心管中，加入5ml新鮮抗凝血液及15ml紅細(xì)胞裂解液稀釋液，漩渦振蕩混勻。冰浴10分鐘，在漩渦振蕩器上迅速混勻兩次，4℃，450g，離心5分鐘沉淀有核細(xì)胞，倒掉含有裂解紅細(xì)胞的上清液。用10ml紅細(xì)胞裂解液稀釋液洗滌沉淀的有核細(xì)胞，漩渦振蕩以完全懸浮細(xì)胞，4℃，450g，離心5分鐘，并再次倒掉上清液。用1ml紅細(xì)胞裂解液稀釋液重懸沉淀的有核細(xì)胞，轉(zhuǎn)到無(wú)rna酶的1.5mlep管中，4℃，3000rpm，離心3分鐘，倒掉上清液。

向細(xì)胞沉淀中加入1mlrna提取液，上下顛倒使細(xì)胞完全裂解。-70℃保存，當(dāng)?shù)竭_(dá)8個(gè)測(cè)試后，再統(tǒng)一進(jìn)行后續(xù)的測(cè)試。加入200μl氯仿，劇烈搖動(dòng)15秒，冰上放置3分鐘。4℃，12000g，離心15分鐘。吸取500μl上清液至新的無(wú)rna酶離心管中，注意不要吸取中間層，每管加入500μl異丙醇，反復(fù)顛倒3～5次，冰上放置10分鐘。4℃，12000g，離心10分鐘。倒掉ep管中的液體，加入75%乙醇1ml，顛倒2～3次。4℃，7500g，離心5分鐘，倒掉ep管中的液體后，重復(fù)洗滌一次。倒掉管中液體，使用離心機(jī)短暫離心收集，室溫下倒置5分鐘，乙醇揮發(fā)之后，加入50μl的無(wú)rna酶的水，溶解rna，輕彈管底，促進(jìn)溶解，室溫溶解3分鐘，冰上放置，備用。

2．質(zhì)控品處理

將陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品從-20℃冰箱中取出，置于冰上緩慢融化，各自加入200μl氯仿，劇烈搖動(dòng)15秒，冰上放置3分鐘，然后按照總rna提取步驟1.7~1.10進(jìn)行總rna的提取，備用。

三．rt-pcr

rna預(yù)變性：將提取的總rna溶液置于70℃水浴中保溫5分鐘，取出后迅速放置冰上，備用。將裝有反轉(zhuǎn)錄緩沖液和逆轉(zhuǎn)錄酶的離心管從-20℃冰箱中取出，置于冰上待其緩慢融化后，短暫離心（1000rpm，5s~10s），將反轉(zhuǎn)錄緩沖液全部轉(zhuǎn)移至逆轉(zhuǎn)錄酶的離心管中，配制成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，輕輕混勻，短暫離心，置于冰上備用。按表1配制反轉(zhuǎn)錄體系：

表1

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3.5μl

總rna溶液5.0μl

無(wú)rna酶的水1.5μl

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃20分鐘，95℃5分鐘，樣本取出置于冰上。

將裝有pcr緩沖液的離心管從-20℃冰箱中取出，置于冰上待其緩慢融化后，短暫離心，置于冰上備用。在取出的若干pcr反應(yīng)管中，按下列組成配制pcr反應(yīng)液：

表2

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5.0μl

pcr緩沖液15.0μl

去離子水5.0μl

將pcr反應(yīng)管放入儀器樣品槽。（儀器具體操作方法按照各自的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）pcr反應(yīng)條件：1）50℃2分鐘；2）95℃5分鐘；3）95℃15秒→60℃1分鐘，45個(gè)循環(huán)。

參考品的擴(kuò)增

取參考品貯存液(2×106copies/μl)10μl，用去離子水梯度稀釋為2×105，2×104，2×103，2×102，2×101copies/μl，連同參考品貯存液6個(gè)濃度，各取5μl為模板(其他組分同表2)同待測(cè)樣本一同進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以便繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

陽(yáng)性判斷值：本試劑盒的陽(yáng)性判斷的臨界值為10²copies/ml（全血拷貝數(shù)）。

附圖說(shuō)明

圖1為陽(yáng)性參考品的擴(kuò)增曲線圖。

圖2為20例臨床病例人乳球蛋白基因mrna擴(kuò)增曲線圖。

實(shí)施例1人乳球蛋白mrna核酸檢測(cè)試劑盒（pcr-熒光探針?lè)ǎz測(cè)mrna的表達(dá)

一．材料：

試劑盒組分材料來(lái)源：紅細(xì)胞裂解液（10×）為nacl，tris-hcl，mgcl2.6h2o配制溶液；無(wú)rna酶的水為depc-h2o；反轉(zhuǎn)錄緩沖液和逆轉(zhuǎn)錄酶為takara寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制溶液；pcr緩沖液為invitrogenpcr緩沖液，檢測(cè)探針，引物混合液；rna提取液為invitrogentrizol原液；2×10⁶copies/μl參考品為有目的片段的質(zhì)粒溶液；陽(yáng)性質(zhì)控品為有人乳球蛋白mrna細(xì)胞裂解液樣品；陰性為無(wú)人乳球蛋白mrna細(xì)胞裂解液樣品；10⁵copies/ml的陽(yáng)性參考品（sk-br-3細(xì)胞，購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)，公司自培）；普通pcr儀；abi7300實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。

二．引物和探針設(shè)計(jì)和合成：

以人乳球蛋白全長(zhǎng)cdna序列（genbank登錄號(hào)：u33147.1）為模板，使用abi7300型實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀隨機(jī)軟件分析taqman引物和探針位點(diǎn)，同時(shí)考慮人乳球蛋白基因組dna序列情況，從中選擇最佳組合。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。參考品溶液中的含目的基因的重組質(zhì)粒由白奧斯生物合成。

pcr上游引物序列為：5’—ggcttccttgatccttgcca—3’

下游引物序列為：5’—ctccaataaggggcagccag—3’

熒光探針序列為：5’—fam—actgaacaccgacagcagcag—tamra—3’

三．陽(yáng)性參考品的擴(kuò)增

四．取10支1.0ml/支的10⁵copies/ml的陽(yáng)性參考品，實(shí)驗(yàn)過(guò)程參考試劑盒的使用方法，提取總rna后進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，上述擴(kuò)增曲線與預(yù)期相符，本試劑盒可以完成含有人乳球蛋白的mrna表達(dá)的檢測(cè)。

實(shí)施例2人乳球蛋白mrna核酸檢測(cè)試劑盒（pcr-熒光探針?lè)ǎ┡R床檢測(cè)人乳球蛋白mrna的應(yīng)用

一實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)組：10例病例診斷為乳腺癌的患者，其中確定10例臨床確診已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移；

對(duì)照組：10例非乳腺癌患者和健康人，其中健康人3例，胃癌患者3人，肺炎患者3人，肝癌1人；

其他實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備材料參見(jiàn)實(shí)施例1材料準(zhǔn)備。

二標(biāo)本檢測(cè)

參照試劑盒使用方法，收集細(xì)胞后用rna提取液提取細(xì)胞總rna,逆轉(zhuǎn)錄后做熒光定量pcr擴(kuò)增，同時(shí)加標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)標(biāo)本的人乳球蛋白基因mrna的表達(dá)量，20例臨床病例擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。

三樣品檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)表明：實(shí)驗(yàn)組10例乳腺癌患者的外周血檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)照組健康人3例，胃癌患者3人，肺炎患者3人，肝癌1人的外周血檢測(cè)結(jié)果均為陰性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

上述結(jié)果表明本發(fā)明的試劑盒可以人乳球蛋白mrna的表達(dá)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定性和定量分析。

表120例臨床病例人乳球蛋白mrna拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果