本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變?cè)噭┖泻头椒ā?/p>

背景技術(shù)：

高繁殖力是世界綿羊生產(chǎn)共同追求的重要目標(biāo)之一。但由于綿羊絕大多數(shù)產(chǎn)單羔，少數(shù)產(chǎn)雙羔，故極大地影響了綿羊的繁殖性能，隨著集約化養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，如何提高綿羊繁殖力是養(yǎng)羊業(yè)獲得較好經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。多胎性狀是綿羊重要的繁殖性狀之一，也是綿羊多產(chǎn)、高產(chǎn)的基礎(chǔ)，繁殖力的高低直接影響生產(chǎn)成本，進(jìn)而影響經(jīng)濟(jì)效益，因此，綿羊的多胎性能引起人們的普遍關(guān)注，國(guó)內(nèi)外紛紛引進(jìn)或培育多胎綿羊品種。研究表明，大部分綿羊品種產(chǎn)羔數(shù)低，多羔的遺傳力較低，僅為0.12，在一定程度上限制了我國(guó)綿羊生產(chǎn)性能的提高，同時(shí)，繁殖性狀與生長(zhǎng)速度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，因而影響了常規(guī)育種方法的效果和可操作性，選育周期長(zhǎng)。分子標(biāo)記輔助選擇可以彌補(bǔ)常規(guī)表型選擇方法的不足，提高選擇的準(zhǔn)確性并縮短世代間隔，提高育種效率。

自從1980年以來(lái)，研究人員開始篩選、鑒定控制綿羊排卵率和產(chǎn)羔率的主效基因，研究證實(shí)綿羊fecb基因?qū)嶋H為骨形態(tài)發(fā)生蛋白ib型受體（bmpr-ib）基因，bmpr-ib基因的突變能夠顯著增加綿羊排卵率，是中國(guó)美利奴羊、小尾寒羊、湖羊等綿羊排卵率和產(chǎn)羔數(shù)的主效基因。我們前期研究表明，中國(guó)美利奴羊（軍墾型）bmpr-ib基因存在a746g堿基突變，該基因編碼區(qū)746處的a→g突變的發(fā)生與fecb表型一致，在綿羊群體中存在3種基因型，其遺傳效應(yīng)表現(xiàn)為：bb純合型與地方品種羊相比，平均排卵數(shù)增加3枚，每只母羊平均每胎能多產(chǎn)1.5只羔羊；b+雜合型與地方品種羊相比，平均排卵數(shù)增加1.5枚，每只母羊平均每胎能多產(chǎn)1.0只羔羊；++野生型產(chǎn)羔數(shù)與地方品種接近。bmpr-ib基因b等位基因在綿羊群體中存在，使得羊群的繁殖率比較高，該基因a746g堿基突變對(duì)綿羊排卵率呈加性效應(yīng)，對(duì)窩產(chǎn)羔數(shù)呈部分顯性效應(yīng)。因此，bmpr-ib基因可用于多胎綿羊的分子育種。

通過對(duì)母羊bmpr-ib基因a746g堿基突變的檢測(cè)，開展bmpr-ib基因標(biāo)記輔助選擇，組建bb基因型綿羊群體，是快速提高綿羊繁殖力的一個(gè)有效方法，能夠使群體平均產(chǎn)羔數(shù)達(dá)到230%以上，極大的增加羔羊數(shù)量，提高養(yǎng)羊的經(jīng)濟(jì)效益。而建立bmpr-ib基因a746g堿基突變的檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇的前提條件。目前，針對(duì)bmpr-ib基因a746g突變的檢測(cè)方法主要有：測(cè)序法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（pcr-rflp）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（pcr-sscp）、基因芯片法、熒光定量pcr方法（qpcr）。

測(cè)序法準(zhǔn)確性高，但操作繁瑣，成本較高?；蛐酒窃诤怂犭s交基礎(chǔ)上建立起來(lái)的新方法，在大規(guī)模樣本檢測(cè)或基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)方面具有很大優(yōu)勢(shì)，但是配套檢測(cè)儀器設(shè)備要求高、儀器價(jià)格高、檢測(cè)成本高。pcr-sscp方法存在假陰性和假陽(yáng)性，一般對(duì)長(zhǎng)度不超過300bp段的檢出率為70-80%。pcr-rflp方法是一種常用的snps檢測(cè)技術(shù)，2008年基于pcr-sscp和pcr-rflp技術(shù)已建立農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“綿羊多胎主效基因fecb分子檢測(cè)規(guī)程（ny/t1672-2008）”，pcr-rflp方法成本低，結(jié)果比較直觀，但是操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不能適應(yīng)在綿羊群體中開展大規(guī)模、并行的檢測(cè)要求。qpcr方法包括突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)pcr（又名等位基因特異pcr）（arms-pcr）方法、高分辨率熔解曲線（hrm）方法、taqman探針法，qpcr方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，pcr產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析即可判斷結(jié)果，全過程在封閉的pcr管內(nèi)進(jìn)行，能最大程度的減少交叉污染。arms-pcr方法檢測(cè)snp位點(diǎn)，操作麻煩，優(yōu)化反應(yīng)條件較難。hrm染料法對(duì)熒光染料、pcr儀器要求較高，儀器需要增加專門的hrm分析功能，不同基因型溶解曲線峰圖差異不明顯，實(shí)驗(yàn)要求比較高。taqman-mgb探針法是在普通taqman探針基礎(chǔ)之上發(fā)展起來(lái)的，mgb探針是指帶有一個(gè)小溝結(jié)合物基團(tuán)的dna探針，它可與單鏈的靶dna形成極為穩(wěn)定的異源雙鏈，mgb探針相對(duì)于通常的探針序列更短一些，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近；其3'端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的tamra等熒光標(biāo)記，3'端增加的一個(gè)mgb分子可以穩(wěn)定探針與模板的雜交，提高探針的退火溫度和特異性，使熒光本底降低，熒光光譜分辨率得以大大改善，探針淬滅效果更好，分辨率更高，檢測(cè)結(jié)果更加精確。利用taqman-mgb探針法可實(shí)現(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)綿羊bmpr-ib的a746g突變，可以為多胎綿羊育種提供一種合適的基因檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變的準(zhǔn)確、效果好、分辨率高的引物、探針；

另一個(gè)目的在于提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確率高，可規(guī)模檢測(cè)、有效提高工作效率、簡(jiǎn)便實(shí)用的檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變的試劑盒及檢測(cè)方法，適用于常用的熒光定量pcr儀，能夠快速、準(zhǔn)確對(duì)綿羊bmpr-ib基因a746g突變進(jìn)行檢測(cè)，并實(shí)現(xiàn)基因分型。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變的引物、探針，其特征在于核苷酸序列如下：

其上游引物bmf的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示；

其下游引物bmr的核苷酸序列如序列表中seqidno：2所示；

其野生探針bpa的核苷酸序列如序列表中seqidno：3所示；

其突變探針bpg的核苷酸序列如序列表中seqidno：4所示；

所述野生探針bpa的5’一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)1，3'一端標(biāo)記有mgb淬滅基團(tuán)；所述突變探針bpg的5’一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)2，3'一端標(biāo)記有mgb淬滅基團(tuán)；

其中所述的熒光基團(tuán)1或熒光基團(tuán)2為fam、tet、vic、hex或rox中的一種，且熒光基團(tuán)1與熒光基團(tuán)2不相同。

利用所述引物、探針?biāo)鶚?gòu)成的taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變的試劑盒，包含陽(yáng)性對(duì)照樣品、dna提取液ⅰ、dna提取液ⅱ、2×lightcycler480probesmaster、一對(duì)引物bmf和bmr，以及其對(duì)應(yīng)的探針bpa和bpg、ddh2o；

其中dna提取液ⅰ、dna提取液ⅱ，其組成成分如下：

dna提取液?。?.01mol/ltris，0.01mol/lnacl，0.005～0.01mol/lmgcl2﹒6h2o；

dna提取液ⅱ：10mmol/ltris，0.1mmol/ledta-na2﹒2h2o，0.1～1%tritonx-100。

作為優(yōu)選,所述試劑盒中所包含的陽(yáng)性對(duì)照樣品為三個(gè)，分別對(duì)應(yīng)綿羊bmpr-ib基因的++、b+和bb三種基因型。

一種利用所述試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

（1）從綿羊血液中提取基因組dna:

（a）取無(wú)菌的1.5ml離心管，向其中加入混勻的edta抗凝血200μl和dna提取液ⅰ溶液600μl，充分混勻,室溫靜置10min；將離心管置于離心機(jī)中，6000rpm離心1min；

（b）取出離心管，傾去上清液，保留沉淀；向離心管中加入dna提取液ⅱ溶液60μl，充分振蕩混勻；沸水浴中10min；

（c）取出離心管，置離心機(jī)中，12,000rpm離心10min，離心后上清液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

（2）將驟（1）得到的dna分別加入到pcr反應(yīng)液中，取一對(duì)引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，獲得綿羊的bmpr-ib基因包含a746g突變位點(diǎn)的基因片段；

（3）根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)對(duì)綿羊bmpr-ib基因a746g位點(diǎn)的三種基因型進(jìn)行判定，即++、b+和bb基因型。

作為優(yōu)選,所述的檢測(cè)方法，步驟（2）中實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)所使用的擴(kuò)增體系為20μl，擴(kuò)增體系中包含以下溶液或試劑：2×lightcycler480probesmaster10μl，10μmol/l上游引物bmf0.8μl，10μmol/l下游引物bmr0.8μl，10μmol/l野生探針bpa0.4μl，10μmol/l突變探針bpg0.4μl，基因組dna3μl，去離子水補(bǔ)齊至20μl。

作為優(yōu)選,所述的檢測(cè)方法，步驟（2）中實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)所使用的擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min；95℃變性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1sec，45個(gè)循環(huán)。

根據(jù)bmpr-ib基因a746g基因型將綿羊群體分為三種類型，選擇bb基因型個(gè)體組建多胎綿羊群體，從而實(shí)現(xiàn)多胎綿羊的分子標(biāo)記輔助育種，即完成基于taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變?cè)噭┖泻头椒ǖ膽?yīng)用。

所述綿羊血液中基因組dna提取原理：

批量檢測(cè)中，應(yīng)用相同起始edta-na2抗凝血，可以保證提取的基因組dna濃度的一致性，確保后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增條件的一致性，以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。抗凝血經(jīng)dna提取液ⅰ處理，將血液中紅細(xì)胞破裂，經(jīng)離心除去紅細(xì)胞碎片，保留白細(xì)胞；dna提取液ⅱ使分離的白細(xì)胞裂解，釋放出基因組dna，經(jīng)離心處理，上清中的dna可以用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因組dna的提取。

經(jīng)典方法中，通過酚/氯仿抽提基因組dna，先從血液樣品中去除蛋白質(zhì)，酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，有時(shí)還要重復(fù)幾次，這樣就大大增加了工作量。而且酚具有高度腐蝕性，易引起嚴(yán)重的燒傷；氯仿對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有麻醉作用，對(duì)操作者的心、肝、腎有損害，吸入或經(jīng)皮膚吸收引起急性中毒。因此，經(jīng)典方法對(duì)操作人員的身體傷害較大。

雖然有相關(guān)的商品化血液基因組dna提取試劑盒，其提取基因組中多數(shù)都需要加入proteinasek，成本較高。

本發(fā)明中提供的快速?gòu)难褐刑崛』蚪Mdna的方法，克服了經(jīng)典方法中有害溶劑對(duì)人體危害的影響，具有提取的基因組dna步驟少、速度快、省時(shí)省力、成本低等特點(diǎn)。24個(gè)樣品批次提取時(shí)間約為45min，比一般的動(dòng)物血液基因組dna提取試劑盒減少約1h，比經(jīng)典方法減少約2h。雖然應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的基因組dna條帶較弱、純度較低，但是完全可以滿足所述的taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變位點(diǎn)。

所述的taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變的方法是以快速提取的綿羊基因組dna為模版，在實(shí)時(shí)熒光定量pcr體系中同時(shí)加入上述引物和探針，引物用于綿羊bmpr-ib基因包含a746g的基因片段擴(kuò)增，上述探針中在5’端分別加入2種不同熒光基團(tuán)，即fam和vic，野生探針（bpa）和突變探針（bpg）分別與bmpr-ib基因的+和b等位基因完全配對(duì)。探針的3’端加入淬滅基團(tuán)為mgb。taqman-mgb探針是利用taqdna聚合酶5’→3’外切酶活性切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。探針和模版特異性的結(jié)合在兩條引物之間，由于探針5’端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)（fam、vic），3′端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)mgb。當(dāng)探針完整時(shí)，5’端報(bào)告基團(tuán)和3′端淬滅基團(tuán)緊鄰在一起，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著pcr的進(jìn)行，taqdna聚合酶在鏈延伸中遇到與模版結(jié)合的探針，與模板完全配對(duì)的探針逐步被taqdna聚合酶5’→3’外切核酸酶活性切斷，致使探針5’端上的報(bào)告基團(tuán)與3’端的淬滅基團(tuán)分離，淬滅效應(yīng)解除，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量不能被吸收，產(chǎn)生熒光信號(hào)。而與模板不完全配對(duì)的探針不能被切斷，故檢測(cè)不到熒光信號(hào)。因此，儀器根據(jù)熒光信號(hào)及其對(duì)應(yīng)的顏色就可以實(shí)現(xiàn)基因突變的檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果即可判定綿羊個(gè)體為bmpr-ib基因的++、b+或bb基因型。

本發(fā)明中的mgb探針具有3’端淬滅基團(tuán)，不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，也將探針的tm值提高10℃左右，提高探針的退火溫度和特異性，因此為了獲得同樣的tm值，mgb探針可以比普通的taqman探針設(shè)計(jì)的更短，既可以降低合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高，探針淬滅效果更好，分辨率更高，對(duì)單個(gè)堿基突變檢測(cè)更敏感、準(zhǔn)確，比傳統(tǒng)的taqman探針檢測(cè)和hrm檢測(cè)等方法結(jié)果判讀更容易。與pcr-rflp方法檢測(cè)bmpr-ib基因多態(tài)性相比，根據(jù)pcr儀器的通用性，一次可以檢測(cè)92個(gè)樣品，且不需要進(jìn)行pcr產(chǎn)物的酶切和電泳后續(xù)分析，在節(jié)省檢測(cè)成本的同時(shí)，大大縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)的效率。由于全過程在封閉的pcr管內(nèi)進(jìn)行，也有效降低了pcr產(chǎn)物污染引起假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果更易于準(zhǔn)確判讀。所提供的基于taqman-mgb探針的綿羊bmpr-ib基因a746g突變檢測(cè)試劑盒和方法，可實(shí)現(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)綿羊bmpr-ib的基因型，可以為多胎綿羊分子輔助育種提供一種合適的基因檢測(cè)方法。該試劑盒及檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高，而且不需要進(jìn)行pcr產(chǎn)物后續(xù)分析即可判型，反應(yīng)全過程在封閉的管內(nèi)進(jìn)行，減少了交叉污染。

附圖說(shuō)明

附圖1，為本發(fā)明實(shí)施例1中基于taqman-mgb探針的綿羊bmpr-ib基因的a746g突變?nèi)N基因型的檢測(cè)結(jié)果，圖中標(biāo)注的bb、b+和++分別對(duì)應(yīng)bmpr-ib基因的bb、b+和++三種基因型。

附圖2，為選取的1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)綿羊樣本，經(jīng)基于taqman-mgb探針的bmpr-ib基因?qū)崟r(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序圖譜，如圖2所示，1號(hào)樣本經(jīng)pcr擴(kuò)增及測(cè)序，證明在bmpr-ib基因746處堿基為a，對(duì)應(yīng)bmpr-ib基因型為++基因型；2號(hào)樣本經(jīng)pcr擴(kuò)增及測(cè)序，證明在bmpr-ib基因746處堿基為a/g雜合型，對(duì)應(yīng)bmpr-ib基因型為b+基因型；3號(hào)樣本經(jīng)pcr擴(kuò)增及測(cè)序，證明在bmpr-ib基因746處堿基為g，對(duì)應(yīng)bmpr-ib基因型為bb基因型；經(jīng)對(duì)比，基于taqman-mgb探針的綿羊bmpr-ib基因a746g突變檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全符合。

附圖3，為參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“綿羊多胎主效基因fecb分子檢測(cè)規(guī)程（ny/t1672-2008）”，應(yīng)用pcr-rflp方法，進(jìn)行綿羊bmpr-ib基因a746g突變檢測(cè)結(jié)果，圖中m為dna分子量puc19dna/mspⅰ(hapⅱ)marker；1～12分別為不同樣本pcr-rflp電泳分型結(jié)果，8為bb基因型，1、3、4、5、10、12為b+基因型，2、6、7、9、11為++基因型。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

參考附圖1-圖3，下面結(jié)合附圖對(duì)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，本實(shí)施例實(shí)施步驟如下：

1、實(shí)驗(yàn)材料與樣品采集：

選取498只中國(guó)美利奴（軍墾型）肉用多胎品系、464只中國(guó)美利奴（軍墾型）毛用多胎品系、663只多胎薩?？搜?、150只薩福克羊、320只哈薩克羊和150湖羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，共計(jì)2245只。

采用一次性注射器從綿羊頸靜脈抽取約1ml的血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約150μl2%無(wú)菌edta（ethylenediaminetetraaceticacid，edta）抗凝劑的1.5ml離心管中，輕輕搖勻，記錄羊號(hào)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、主要藥品和試劑：

三（羥甲基）氨基甲烷（tris），nacl，mgcl2﹒6h2o，edta-na2﹒2h2o，tritonx-100，生工生物工程（上海）股份有限公司；lightcycler480probesmaster，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

3、主要儀器：

lightcycler?480高通量實(shí)時(shí)熒光定量pcr系統(tǒng)，roche公司；hico21高速離心機(jī)，生工生物工程（上海）股份有限公司。

4、引物和探針的設(shè)計(jì)與合成：

根據(jù)綿羊bmpr-ib基因a746gsnp位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物bmf和下游引物bmr由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，野生探針bpa和突變探針bpg由上海輝睿生物科技有限公司合成。

上游引物（bmf）：5'-gtgttcttcactacagaggaggc-3'

下游引物（bmr）：5'-cctgaacatcgctaatacagactt-3'

野生探針（bpa）：5’-fam-caacaccgtctgatat-mgb-3'

突變探針（bpg）：5’-vic-caacaccgtccgatat-mgb-3'

5、綿羊基因組dna的快速提取：

（1）試劑配制：

配制綿羊基因組dna快速提取的試劑，如下：

dna提取液?。╬h8.0）：0.01mol/ltris，0.01mol/lnacl，0.005～0.01mol/lmgcl2﹒6h2o；

dna提取液ⅱ（ph8.0）：10mmol/ltris，0.1mmol/ledta-na2﹒2h2o，0.1～1%tritonx-100。

（2）取無(wú)菌的1.5ml離心管（自備），向其中加入混勻的edta抗凝血200μl和dna提取液ⅰ溶液600μl，充分混勻,室溫靜置10min；將離心管置于離心機(jī)中，6000rpm離心1min。

（3）取出離心管，傾去上清液，保留沉淀；向離心管中加入dna提取液ⅱ溶液60μl，充分振蕩混勻；沸水浴中10min。

（4）取出離心管，置離心機(jī)中，12,000rpm離心10min，離心后上清液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6、基于taqman-mgb探針的實(shí)時(shí)熒光定量pcr：

（1）以綿羊基因組dna為模版，利用前述的引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，獲得綿羊的bmpr-ib基因包含a746g突變的117bp基因片段。

20μl反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑：

2×lightcycler480probesmaster10μl；

上游引物bmf（10μm）0.8μl；

下游引物bmr（10μm）0.8μl；

探針bpa（10μm）0.4μl；

探針bpg（10μm）0.4μl；

去離子水4.6μl；

基因組dna3.0μl。

其中2×lightcycler480probesmaster，包含faststarttaqdna聚合酶、pcr反應(yīng)buffer、6.4mmmgcl2和dntp混合物。

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀器規(guī)格，通常為96孔，為提高加樣一致性和速度，可制備除了基因組dna以外的混合pcr反應(yīng)體系，考慮移液器和吸頭誤差，一般每個(gè)96孔板按100個(gè)反應(yīng)體系計(jì)算，應(yīng)用移液器將反應(yīng)體系分至96孔板，每孔分別加入待檢測(cè)的基因組dna樣品，完成以后用封口膜封口，瞬時(shí)離心。

每個(gè)96孔板上設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照ntc和三個(gè)已知基因型（bb、b+和++基因型）的綿羊基因組對(duì)照。

（2）將上述溶液混合均勻，按以下條件進(jìn)行pcr反應(yīng)。

95℃預(yù)變性10min；95℃變性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1sec，45個(gè)循環(huán)。

7、基因分型：

反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用lightcycler?480高通量實(shí)時(shí)熒光定量pcr系統(tǒng)配套軟件lightcycler480softwarerelease1.5.1.62軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果，分型產(chǎn)生三種基因型（bb、b+和++基因型）（見圖1）。

++基因型：接近x軸區(qū)域，呈藍(lán)色點(diǎn)。

bb基因型：接近y軸區(qū)域，呈綠色點(diǎn)。

b+基因型：位于x軸和y軸的中間區(qū)域，呈紅色點(diǎn)。

8、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)中國(guó)美利奴（軍墾型）肉用多胎品系、中國(guó)美利奴（軍墾型）毛用多胎品系、多胎薩?？搜颉⑺_?？搜?、哈薩克羊和湖羊不同基因型。

表1不同品種綿羊bmpr-iba746g位點(diǎn)基因型頻率分布

注：cmmm代表中國(guó)美利奴（軍墾型）肉用多胎品系；cmmw代表中國(guó)美利奴（軍墾型）毛用多胎品系。括號(hào)中為綿羊只數(shù)。

可見，中國(guó)美利奴（軍墾型）肉用多胎品系、中國(guó)美利奴（軍墾型）毛用多胎品系和多胎薩?？搜蛉后w中存在bmpr-ib基因三種基因型，中國(guó)美利奴（軍墾型）肉用多胎品系和中國(guó)美利奴（軍墾型）毛用多胎品系以++基因型為主；多胎薩?？艘詁+基因型為主；薩?？搜蚝凸_克羊全部為++基因型；湖羊全部為bb基因型。

對(duì)檢測(cè)結(jié)果的分析如下：

（1）條件優(yōu)化：

taqman-mgb探針的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)過程中，基因組dna模版的使用量、pcr引物的擴(kuò)增效率和特異性、探針的特異性和使用量、最適退火溫度都成為成功檢測(cè)的關(guān)鍵因素。因此在設(shè)計(jì)時(shí)，考慮了批量檢測(cè)時(shí)間要短，pcr產(chǎn)物的長(zhǎng)度要合適，檢測(cè)過程中設(shè)置了一個(gè)空白對(duì)照ntc和三個(gè)已知基因型（bb、b+和++基因型）的綿羊基因組對(duì)照，pcr過程中對(duì)兩步法和三步法及退火溫度進(jìn)行了條件摸索，并對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行了抽樣測(cè)序，確保了每一個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果的正確性。

經(jīng)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定了綿羊基因組dna快速提取試劑和提取方法，實(shí)時(shí)熒光定量pcr采用三步法，退火溫度使用55℃，可以確保pcr的擴(kuò)增效率和正確性。

（2）準(zhǔn)確性和特異性檢測(cè)：

每批次檢測(cè)結(jié)束以后，隨機(jī)選取++基因型、b+基因型和bb基因型的bmpr-ib基因pcr產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，基因序列用blast在線軟件進(jìn)行比對(duì)分析。序列比對(duì)結(jié)果證實(shí)pcr擴(kuò)增序列為綿羊bmpr-ib基因包含a746g突變位點(diǎn)的基因片段，3個(gè)樣本為++基因型、b+基因型和bb基因型（見圖2），檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物和探針正確，特異性高。

（3）重復(fù)性檢測(cè)：

從2245只綿羊樣本中隨機(jī)選出95只羊，每一個(gè)樣本從基因組dna提取、應(yīng)用taqman-mgb探針的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)，至少重復(fù)完成3次，結(jié)果表明所有樣本經(jīng)多次檢測(cè)，分析結(jié)果都相同，重復(fù)檢測(cè)正確率達(dá)到100%，說(shuō)明探針設(shè)計(jì)合理，檢測(cè)結(jié)果可靠。

（4）為了進(jìn)一步證明檢測(cè)結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選擇600只中國(guó)美利奴羊（軍墾型）為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用taqman-mgb探針的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒對(duì)bmpr-ib基因進(jìn)行基因分型，并參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“綿羊多胎主效基因fecb分子檢測(cè)規(guī)程（ny/t1672-2008）”，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)中的pcr-rflp方法對(duì)bmpr-ib基因進(jìn)行檢測(cè)（圖3），對(duì)比分析，結(jié)果表明，兩種方法檢測(cè)bmpr-ib的基因型結(jié)果一致，taqman-mgb探針的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒和方法的檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到100%，其中++基因型個(gè)體數(shù)為282只，b+基因型個(gè)體數(shù)為271只，bb個(gè)體數(shù)為47只，說(shuō)明建立的taqman-mgb探針檢測(cè)bmpr-ib基因a746g突變的試劑盒和方法能夠?qū)崿F(xiàn)綿羊多胎主效基因bmpr-ib基因型的檢測(cè)。

以上檢測(cè)試劑盒中所包含的陽(yáng)性對(duì)照樣品、dna提取液ⅰ、dna提取液ⅱ、2×lightcycler480probesmaster、兩對(duì)引物及其對(duì)應(yīng)的探針，以及檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)綿羊多胎性狀主效基因bmpr-ib基因的不同基因型，選擇bb基因型綿羊個(gè)體進(jìn)行組群，從而能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確、快速、并行的綿羊多胎性狀主效基因標(biāo)記輔助育種。

上述實(shí)施例是提供給熟悉本領(lǐng)域內(nèi)的人員來(lái)實(shí)現(xiàn)或使用本發(fā)明的，熟悉本領(lǐng)域的人員可在不脫離本發(fā)明的發(fā)明思想的情況下，對(duì)上述實(shí)施例做出種種修改或變化，因而本發(fā)明的保護(hù)范圍并不被上述實(shí)施例所限，而應(yīng)該是符合權(quán)利要求書提到的創(chuàng)新性特征的最大范圍。

<110>新疆農(nóng)墾科學(xué)院

<120>基于taqman-mgb探針檢測(cè)綿羊bmpr-ib基因a746g突變的試劑盒和方法

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