本發(fā)明涉及原位雜交領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于檢測(cè)tert基因斷裂的探針組、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，nb)屬于兒童外周交感神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，是兒童最常見(jiàn)的胚胎性顱外腫瘤。nb腫瘤的惡性度高、進(jìn)展快，易發(fā)生骨髓、骨及其他器官轉(zhuǎn)移，在兒童腫瘤相關(guān)死因中高達(dá)15％。nb腫瘤即使經(jīng)過(guò)化療、手術(shù)和放療等多元化治療，仍有約60％的病例復(fù)發(fā)。神母腫瘤患兒中，約40％診斷為高危型nb，其5年生存率僅為30％-50％。由于缺乏有效治療手段、預(yù)后差、復(fù)發(fā)率和死亡率高，nb給患兒家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)損失和負(fù)擔(dān)。因此，深入開(kāi)展nb腫瘤分子標(biāo)志物研究，尤其是高危型nb腫瘤的分子標(biāo)記物，對(duì)于兒童nb腫瘤的早期預(yù)防和診療具有重要的臨床意義和社會(huì)意義。

mycn基因是公認(rèn)的nb腫瘤最主要致癌基因，也是國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤危險(xiǎn)度分級(jí)協(xié)作組(theinternationalneuroblastomariskgroup,inrg)推薦的nb腫瘤分期/分級(jí)標(biāo)志物。但臨床上僅在20％高危nb患兒中發(fā)現(xiàn)mycn基因異常擴(kuò)增(>10拷貝)，仍廣泛存在mycn未異常擴(kuò)增的高危nb患者，說(shuō)明現(xiàn)有nb腫瘤標(biāo)志物不能完全滿足病因復(fù)雜的nb腫瘤診治需要。

最新研究發(fā)現(xiàn)在高危nb腫瘤中，約有20-30％的腫瘤發(fā)生端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerasereversetranscriptase,tert)基因斷裂，能夠激活端粒酶活性，促進(jìn)nb腫瘤進(jìn)展，而且tert也可輔助mycn鑒別高危nb亞型。因此為了更好地對(duì)nb腫瘤患者進(jìn)行分級(jí)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及精準(zhǔn)治療，檢測(cè)nb腫瘤患者是否出現(xiàn)tert基因的斷裂十分必要。

但目前檢測(cè)tert的斷裂只能基于全基因組測(cè)序技術(shù)，不但樣本處理復(fù)雜、專業(yè)要求高、檢測(cè)周期長(zhǎng)并且成本昂貴，不適合醫(yī)院開(kāi)展tert基因的快速檢測(cè)。

因此，本領(lǐng)域亟待提出一種快速、準(zhǔn)確且成本低的檢測(cè)tert基因斷裂的試劑和方法。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于檢測(cè)tert基因斷裂的探針組，該探針組可以快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)tert基因的斷裂。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種用于檢測(cè)tert基因斷裂的試劑盒，該試劑盒包括上述探針組，可以快速、方便、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)tert基因的斷裂。

本發(fā)明的第三目的在于提供上述探針組在制備用于鑒別高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的試劑或試劑盒中的應(yīng)用，由本發(fā)明上述應(yīng)用制備的試劑或試劑盒能夠輔助鑒別高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤亞型，幫助神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種用于檢測(cè)tert基因斷裂的探針組，所述探針組包括標(biāo)記有熒光標(biāo)記的克隆片段rp11-325i22、rp11-768m3、rp11-1107m2和rp11-260h6，其中rp11-325i22和rp11-768m3標(biāo)記有同一種顏色的熒光染料，rp11-1107m2和rp11-260h6標(biāo)記有另一種顏色的熒光染料。

本發(fā)明提供上述探針組，通過(guò)上述探針組可以利用熒光原位雜交檢測(cè)樣品中tert基因的斷裂或斷裂。熒光原位雜交是利用標(biāo)記有熒光素的探針特異性與染色體和(或)基因位點(diǎn)相結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡即可觀察熒光信號(hào)的類型，從而檢測(cè)染色體和相應(yīng)基因變化的方法，具有安全、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏度高、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，而且彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法對(duì)間期細(xì)胞、復(fù)雜核型細(xì)胞以及染色體微缺失無(wú)法診斷的缺陷。同時(shí)熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于石蠟包埋的樣本上進(jìn)行回顧性研究，大大降低了對(duì)研究樣本的要求。

tert基因兩端存在數(shù)十個(gè)細(xì)菌人工染色體(bac)克隆，但這些克隆沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，缺乏特征性描述，且其中許多克隆為商品化克隆，只進(jìn)行末端測(cè)序，存在約10％的錯(cuò)誤率，體現(xiàn)為這些克隆標(biāo)記后顯示的不是目的片段或在目的片段之外，還存在較多雜交信號(hào)。同時(shí)，bac克隆還存在標(biāo)記后信號(hào)強(qiáng)度不強(qiáng)或bac克隆之間信號(hào)不連續(xù)的情況。因此，獲得特異性好、信號(hào)強(qiáng)度高且信號(hào)連續(xù)、不彌散的克隆是能夠準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)tert基因斷裂的關(guān)鍵。本發(fā)明經(jīng)過(guò)多重分析和驗(yàn)證之后，最終選擇確定的bac克隆為rp11-325i22、rp11-768m3、rp11-1107m2和rp11-260h6，其無(wú)論是在特異性、信號(hào)強(qiáng)度還是信號(hào)的連續(xù)性上都能滿足檢測(cè)要求，對(duì)上述bac克隆進(jìn)行熒光標(biāo)記，可以靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)tert基因斷裂。

首先，經(jīng)efish預(yù)測(cè)和實(shí)際測(cè)試，本發(fā)明上述bac克隆在tert基因兩端具有極高的特異性，基本不與細(xì)胞內(nèi)其他染色體發(fā)生非特異性雜交，且信號(hào)強(qiáng)度高，檢測(cè)的靈敏度高。另外，本發(fā)明上述克隆片段的大小相近，克隆片段彼此間的信號(hào)強(qiáng)度相似，不會(huì)出現(xiàn)因?yàn)榭寺∑伍L(zhǎng)短不一導(dǎo)致信號(hào)的強(qiáng)度差異較大的問(wèn)題。

其次，tert基因兩端的bac克隆片段之間的最短距離約110kb，探針在未發(fā)生斷裂或重組時(shí)兩種信號(hào)能緊密靠近，不會(huì)因?yàn)閮蓚€(gè)信號(hào)之間的距離過(guò)大而出現(xiàn)信號(hào)分離，導(dǎo)致假陽(yáng)性。

再者，tert基因同側(cè)相鄰的克隆片段之間存在少量的片段重疊，避免同側(cè)克隆片段因?yàn)殚g距較大而出現(xiàn)信號(hào)斷裂或重組，出現(xiàn)單獨(dú)信號(hào)，造成假陽(yáng)性。

一些實(shí)施方式中，所述rp11-325i22和rp11-768m3標(biāo)記有綠色熒光染料，rp11-1107m2和rp11-260h6標(biāo)記有紅色熒光染料。

在一些實(shí)施方式中，所述rp11-325i22和rp11-768m3標(biāo)記有紅色熒光染料，rp11-1107m2和rp11-260h6標(biāo)記有綠色熒光染料。

在一些實(shí)施方式中，所述綠色熒光染料選自光譜綠、熒光素、羧基熒光素、異硫氰酸熒光素、四氯熒光素、羅丹明、羧基四甲基羅丹明、bodipyfl或cy2中的一種或兩種，所述紅色熒光染料選自光譜橙、texasred、bodipytr、cy3或cy5中的一種或兩種。

在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選地，所述綠色熒光染料為光譜綠，所述紅色熒光染料為光譜橙。

本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)tert基因斷裂的試劑盒，所述試劑盒包括上述的探針組，所述試劑盒還包括雜交緩沖液、洗滌緩沖液、非特異性雜交阻斷劑、水和細(xì)胞核染料中的一種或多種。。

本發(fā)明上述試劑盒包括用于檢測(cè)tert基因斷裂的探針組，能夠快速、方便、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)對(duì)tert基因斷裂的檢測(cè)。

在一些實(shí)施方式中，所述雜交緩沖液為ssc緩沖液，所述洗滌緩沖液為含np-40的ssc緩沖液。

在一些實(shí)施方式中，所述非特異性雜交阻斷劑為牛血清白蛋白、鮭魚(yú)精子dna或人cot-1dna，優(yōu)選地，所述非特異性雜交阻斷劑為人cot-1dna。

在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞核染料選自dapi、吖啶橙、溴化乙錠、碘化丙啶和hoechst染料中的一種或多種，優(yōu)選地，所述細(xì)胞核染料為dapi。

在一些實(shí)施方式中，所述探針組與所述雜交緩沖液、非特異性雜交阻斷劑和水混合配制為探針雜交液。

本發(fā)明還涉及上述探針組在制備用于鑒別高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

由本發(fā)明上述應(yīng)用制備的試劑或試劑盒能夠輔助鑒別高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤亞型，幫助神經(jīng)母瘤細(xì)胞患者進(jìn)行精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)本發(fā)明提供用于熒光原位雜交的探針組或試劑盒，利用該探針組或試劑盒能夠通過(guò)熒光原位雜交檢測(cè)tert基因的斷裂，可以快速、準(zhǔn)確、靈敏度、低成本地檢測(cè)tert基因的斷裂。

2)本發(fā)明上述探針組或試劑盒中的克隆片段具有信號(hào)強(qiáng)度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，上述克隆片段的組合具有信號(hào)連續(xù)、信號(hào)強(qiáng)度差異小，不容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等優(yōu)點(diǎn)。

3)通過(guò)檢測(cè)tert基因斷裂，本發(fā)明上述探針組或試劑盒能夠輔助鑒別高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤亞型，幫助神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為；bac克隆rp11-161f13的efish比對(duì)結(jié)果；

圖2為：bac克隆rp11-161f13在經(jīng)培養(yǎng)的外周血中期染色體上的雜交結(jié)果；

圖3為：bac克隆rp11-379b11的efish比對(duì)結(jié)果；

圖4為：bac克隆rp11-379b11在經(jīng)培養(yǎng)的外周血中期染色體上的雜交結(jié)果；

圖5為：熒光原位雜交多克隆分離探針定位模式示意圖；

圖6為：外周血涂片的fish檢測(cè)圖；

圖7為：兒童nb腫瘤組織樣本的fish檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

篩選檢測(cè)tert基因斷裂的探針組：

(1)通過(guò)http://genome.ucsc.edu/查找5號(hào)染色體tert基因兩側(cè)(即端粒側(cè)和著絲粒側(cè))對(duì)應(yīng)的細(xì)菌人工染色體(bac克隆)。結(jié)果表明，在tert基因(chr5:1,253,287-1,295,162)位置兩端約500kb處有數(shù)十個(gè)bac克隆可覆蓋，但這些克隆沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，缺乏特異性描述。

(2)探針設(shè)計(jì)原則：在基因斷裂點(diǎn)兩側(cè)分別選取多個(gè)大小相近的bac克隆，控制兩側(cè)bac克隆片段之間的最遠(yuǎn)距離在1500kb以內(nèi)且互不重疊，同側(cè)多個(gè)片段相互之間有一定序列的重疊，避免較大缺口造成信號(hào)彌散。根據(jù)上述探針設(shè)計(jì)原則，計(jì)劃在tert基因的一側(cè)選取3個(gè)bac克隆，分別為rp11-325i22(chr5：1317,996-1,509,712)、rp11-161f13(chr5：1,509,781-1,671,154)和rp11-768m3(chr5：1,682,330-1,844,278)，長(zhǎng)約530kb，標(biāo)記綠色熒光；在tert基因的另一側(cè)選取3個(gè)bac克隆，分別為rp11-379b11(chr5：620,050-842,110)、rp11-260h6(chr5：830,274-1,019,881)和rp11-1107m2(chr5：1,009,812-1,206,909)，長(zhǎng)約470kb，標(biāo)記綠色熒光。

(3)對(duì)上述bac克隆進(jìn)行efish比對(duì)和用外周血培養(yǎng)的中期染色體涂片驗(yàn)證：

①用efish(http://projects.tcag.ca/cgi-bin/efish/index.cgi)分析上述bac克隆的特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rp11-161f13在基因組中存在非特異片段，分別在2號(hào)、3號(hào)染色體中有非特異雜交(參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖圖1)，可能標(biāo)記后有較明顯的非特異點(diǎn)干擾判讀，其他五個(gè)bac克隆在比對(duì)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)非特異性雜交。

由于基于生物信息學(xué)的比對(duì)結(jié)果未必可靠，同時(shí)考慮到如果只選取rp11-325i22和rp11-768m3，中間約有173kb的缺口，擔(dān)心信號(hào)會(huì)有彌散，而如果只選取靠近tert基因的rp11-325i22，信號(hào)點(diǎn)熒光強(qiáng)度可能較弱，不滿足樣本檢測(cè)，因此最終對(duì)rp11-325i22、rp11-768m3和rp11-161f13均進(jìn)行中期染色體涂片驗(yàn)證。

②從invitrogen公司購(gòu)買(mǎi)上述六個(gè)商品化的bac克隆，用綠色熒光染料標(biāo)記，檢測(cè)上述bac克隆在外周血細(xì)胞中期染色體上的雜交情況。結(jié)果表明：

rp11-161f13在經(jīng)培養(yǎng)的中期染色體細(xì)胞上顯示有非特異雜交信號(hào)(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖圖2)，不能使用；rp11-325i22單個(gè)克隆的標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度較弱；而rp11-325i22和rp11-768m3搭配的組合標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度可以滿足樣本檢測(cè)的要求，且雖然其中存在173kb的缺口，并沒(méi)有對(duì)信號(hào)造成影響判斷的彌散效果。

rp11-379b11在efish比對(duì)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非特異雜交(附圖3)，但是在培養(yǎng)的中期染色體和間期細(xì)胞中出現(xiàn)非特異信號(hào)點(diǎn)，不能用于后續(xù)試驗(yàn)(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖圖4)。而rp11-1107m2和rp11-260h6的組合可以滿足信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)連續(xù)性的要求。

根據(jù)上述外周血中期染色體涂片結(jié)果，最終確定用于檢測(cè)tert基因斷裂的bac克隆為rp11-325i22、rp11-768m3、rp11-1107m2和rp11-260h6，其定位模式如圖5所示。

實(shí)施例2

制備檢測(cè)tert基因斷裂的熒光標(biāo)記bac克隆探針組：

從invitrogen公司購(gòu)置相應(yīng)的bac克隆，將bac克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，利用缺口平移法，將端粒側(cè)的2個(gè)bac克隆片段rp11-1107m2和rp11-260h6用sptectrumgreen-dutp標(biāo)記為綠色熒光，將著絲粒側(cè)2個(gè)bac克隆片段rp11-325i22和rp11-768m3用sptectrumorange-dutp標(biāo)記為紅色熒光。將標(biāo)記好的探針與humancot-1dna、雜交緩沖液、純化水按比例配置成探針雜交液，-20℃避光冷凍保存。

實(shí)施例3

制備用于檢測(cè)tert基因斷裂的試劑盒：

將實(shí)施例1制備的探針雜交液與用于細(xì)胞核dna染色的dapi染料組成試劑盒。

實(shí)驗(yàn)例1

以人外周血淋巴細(xì)胞為檢測(cè)對(duì)象，評(píng)價(jià)實(shí)施例2制備的探針組的標(biāo)記效果及檢測(cè)效果。

1、人外周血培養(yǎng)及染色體制備：

(1)準(zhǔn)備以下實(shí)驗(yàn)材料：人外周血；胰酶：gibico；培養(yǎng)液：dmem(hyclone)+10％新生牛血清(gibico)+100up.s。

(2)采血：用肝素潤(rùn)濕注射針筒(0.2m1)后，常規(guī)取靜脈血約1-2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)針筒混勻肝素。

(3)接種(在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作)：在每個(gè)培養(yǎng)瓶中(含20％血清的1640培養(yǎng)液5ml，ph7.2)，加入全血0.25-0.30ml(7號(hào)針頭13-15滴)、pha5mg，蓋緊膠塞，輕輕搖勻。

(4)培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h。終止培養(yǎng)前2-4h，加入0.01％秋水仙素溶液(100μg/m1)1-2滴(7號(hào)針頭)，使終濃度為0.2μg/ml培養(yǎng)液。輕輕搖勻后，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2-4h。

(5)收獲：將培養(yǎng)后的血細(xì)胞收集在離心管中，平衡后1000rpm離心8min，棄去上清。

(6)低滲：向離心管中加入37℃0.075mol/lkcl溶液至8ml，用吸管輕輕吹打混勻細(xì)胞，置于37℃水浴箱溫育15min。

(7)預(yù)固定：向離心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液1-2ml，用吸管輕輕吹打混勻后1000rpm離心8min，棄去上清。

(8)固定：加入新配制的固定液至8ml，室溫靜置30min。3000rpm離心8min，棄去上清?？稍僦貜?fù)固定1次。

2、細(xì)胞涂片處理方法：

(1)準(zhǔn)備以下材料：

①樣本處理所需材料：固定液：體積比3:1的甲醇:冰醋酸，化學(xué)通風(fēng)櫥中配制，充分混勻；離心機(jī)。

②制片時(shí)所需材料：載玻片、移液器、顯微鏡。

③預(yù)處理時(shí)所需材料：

20×pbs；70％、90％、100％梯度乙醇；圓形玻璃染色缸；恒溫水浴鍋(37±1℃)；

胃蛋白酶溶液：400μl1mol/l的hcl加入40ml水中，置于37±1℃水浴中，使用前加入75ul10％胃蛋白酶，混勻，使用一天后更換；

4％多聚甲醛：900ml去離子水中加入500μl1mol/lnaoh，加熱到65-70℃；邊攪拌邊加入40g多聚甲醛，持續(xù)攪拌直到溶解；冷卻至室溫后加入100ml的10×pbs；用hcl調(diào)節(jié)ph到7.3；過(guò)濾除菌，2-8℃避光保存；

1％多聚甲醛(水：26ml+20×pbs：2ml+4％的多聚甲醛：10ml+1m的mgcl2：2ml)。

④雜交時(shí)需要的材料：18×18mm蓋玻片、鑷子、橡皮膠(rubbercement)、原位雜交儀(abbott)。

⑤雜交后洗滌及復(fù)染所需材料：

20×ssc；np-40；鑷子；圓形玻璃染色缸；恒溫水浴鍋(72±1℃)；70％、90％、100％梯度乙醇；22×22mm蓋玻片；

洗液i(1×ssc/0.3％np-40)：37.88ml純水+2ml20×ssc+120μlnp-40，總體積40ml；

洗液ii(2×ssc/0.1％np-40)：35.96ml純水+4ml20×ssc+40μlnp-40，總體積40ml。

(2)將實(shí)施例2制備的探針組用于檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)的外周血細(xì)胞的中期染色體：

①制片：

1.1、用新鮮固定液配平細(xì)胞懸液，5000rpm離心5分鐘，棄上清；

1.2、加1ml固定液，震蕩混勻，5000rpm離心5分鐘，棄上清；

1.3、重復(fù)1.2；

1.4、取一張干凈的載玻片；

1.5、重懸細(xì)胞后取3μl懸液滴加到載玻片上；室溫下晾干；

1.6、用10×物鏡在相差顯微鏡下觀察三個(gè)區(qū)域的細(xì)胞密度，記錄細(xì)胞沒(méi)有明顯重疊，且數(shù)量在100-200個(gè)以上；如果細(xì)胞密度及數(shù)目不合適，繼續(xù)步驟1.7；

1.7、如果滴加3μl懸液的區(qū)域仍然細(xì)胞數(shù)目太多，用新鮮固定液稀釋細(xì)胞懸液，重復(fù)步驟1.4-6；

1.8、另取一張干凈的載玻片，滴加適量的細(xì)胞懸液；

1.9、在相差顯微鏡下觀察，如果細(xì)胞碎片太多，則需要做預(yù)處理并且選擇合適的雜交區(qū)域。

②玻片預(yù)處理：

2.1玻片放入37±1℃的1×pbs中孵育5分鐘；

2.2取出玻片，再將其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化7-15分鐘(可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定酶效力)；

2.3取出玻片，再將其放入1×pbs室溫洗滌3分鐘；

2.4取出玻片，再將其放入1％多聚甲醛/pbs室溫固定10分鐘；

2.5取出玻片，再將其放入1×pbs室溫洗滌3分鐘；

2.6取出玻片，再將其放入70％、90％、100％梯度乙醇脫水各2分鐘；

2.7取出玻片，室溫晾干。

③雜交：

3.1從-20℃冰箱中取出雜交液，震蕩混勻，瞬時(shí)離心；

3.2加10μl的雜交液到雜交區(qū)域，迅速蓋上18×18mm蓋玻片，輕壓使雜交液均勻分布，避免產(chǎn)生氣泡；

3.3用橡皮膠沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片和載玻片接觸的部位；

3.4濕潤(rùn)原位雜交儀濕度條，將玻片置于原位雜交儀上，關(guān)閉原位雜交儀蓋子，設(shè)置“denat&hyb”程序，變性78℃2分鐘，雜交37℃10-18小時(shí)。

④雜交后洗滌及復(fù)染：

4.1關(guān)閉雜交儀電源，將玻片取出，輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片(若蓋玻片難以去除，可以將其放入室溫2×ssc中微微搖晃，以利于其脫落)；

4.2玻片放入72±1℃洗液i(1×ssc/0.3％np-40)中2分鐘；

4.3取出玻片，再將其放入室溫洗液ii(0.1％np-40/2×ssc)中30秒；

4.4取出玻片，再將其放入室溫70％，90％，100％乙醇中各2分鐘；

4.5取出玻片，暗處自然干燥玻片；室溫，滴加10μldapi復(fù)染劑到22×22mm的蓋玻片,載玻片目標(biāo)區(qū)域朝下，輕放于蓋玻片上，輕壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗處存放，待觀察。

(3)結(jié)果判定：參照通行的雙色探針使用標(biāo)準(zhǔn)，在暗室中使用熒光顯微鏡dapi/fifc/texasred三色濾光鏡激發(fā)，100倍物鏡下觀察間期細(xì)胞，判別熒光信號(hào)，評(píng)價(jià)探針的特異性、靈敏度、信號(hào)的強(qiáng)弱以及信號(hào)連續(xù)性(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖圖6)。

探針組質(zhì)量評(píng)價(jià)：說(shuō)明書(shū)附圖圖7的單個(gè)細(xì)胞核中只有兩個(gè)連續(xù)的紅綠信號(hào)或兩個(gè)黃色信號(hào)。首先，熒光信號(hào)的數(shù)量表明表明實(shí)施例1所述探針組的特異性好，只特異性地與5號(hào)染色體上tert兩側(cè)的目的片段結(jié)合，沒(méi)有非特異性地結(jié)合其他染色體；其次，紅綠信號(hào)緊密相連或融合形成黃色信號(hào)，表明上述探針之間的間距合適，不會(huì)因?yàn)殚g距過(guò)大而出現(xiàn)信號(hào)分離，造成檢測(cè)結(jié)果的誤判；再者，圖7所示熒光信號(hào)清晰，信號(hào)亮度高，探針組的檢測(cè)靈敏度高。考察染色體對(duì)應(yīng)區(qū)段的熒光信號(hào)及計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞核中信號(hào)雜交情況，判定熒光探針的靈敏度和特異性。結(jié)果顯示100％的染色體顯示相應(yīng)顏色的熒光信號(hào)，且無(wú)任何染色體位點(diǎn)之間的交叉雜交現(xiàn)象。探針靈敏度和特異性均達(dá)100％。

實(shí)驗(yàn)例2

使用實(shí)施例2制備的探針組檢測(cè)兒童nb腫瘤組織，具體檢測(cè)方法如下所示：

(1)將包含腫瘤組織的樣本經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋后制備成3μm組織切片。

(2)將切片置于65±1℃恒溫箱烤片過(guò)夜；之后，取出后放入二甲苯浸泡30min，再放入無(wú)水乙醇浸泡10min；接著放入100％、85％、70％梯度乙醇和純化水中復(fù)水3min，再放入純化水中100±5℃煮片20min。

(3)取出晾干后，在樣本區(qū)域滴加100μl胃蛋白酶反應(yīng)液，消化5min；之后迅速放入2×ssc洗滌5min，最后放入室溫70％、85％、100％梯度乙醇依次脫水各3min，取出晾干。

(4)加10μl本發(fā)明的探針雜交液至干燥22×22mm蓋玻片上，將樣本片翻轉(zhuǎn)，使樣本朝下，迅速蓋上，反轉(zhuǎn)后輕壓蓋玻片使雜交液均勻分布；用橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片與載玻片接觸邊緣。

(5)將玻片放在85±1℃的熱臺(tái)上，變性5min；迅速將玻片放入預(yù)熱的雜交盒中，避光，37±1℃孵育過(guò)夜。

(6)將2×ssc溶液和0.1％np-40/2×ssc溶液放入37±1℃的水浴中預(yù)熱；去除橡皮膠水和蓋玻片，將玻片放入2×ssc溶液中洗滌10min；再轉(zhuǎn)入0.1％np-40/2×ssc溶液中洗滌5min；然后室溫70％乙醇脫水3min。

(7)取出玻片在暗處晾干后，滴加10μldapi復(fù)染劑至干燥的22×22mm蓋玻片上，反轉(zhuǎn)樣本片，使蓋玻片載玻片的目標(biāo)區(qū)域接觸，反轉(zhuǎn)后減壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗處存放，使用熒光顯微鏡觀察熒光性。

(8)結(jié)果判定：參照通行的雙色探針使用標(biāo)準(zhǔn)，在暗室中使用熒光顯微鏡dapi/fifc/texasred三色濾光鏡激發(fā)，100倍物鏡下觀察間期細(xì)胞，判別熒光信號(hào)，確定免疫熒光原位雜交檢測(cè)的有效性(具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖圖7)。

使用熒光顯微鏡可以觀察到兩種信號(hào)類型：(1)正常信號(hào)：在未發(fā)生tert基因斷裂或重組的腫瘤組織中，由于雙色信號(hào)相距較近而出現(xiàn)紅綠連續(xù)信號(hào)或者黃色信號(hào)(紅綠雙色疊加的效果)，信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量取決于細(xì)胞核內(nèi)5號(hào)染色體數(shù)目；(2)分離信號(hào)：當(dāng)發(fā)生tert基因斷裂或重組時(shí)，導(dǎo)致分別標(biāo)記在tert基因兩端的紅綠信號(hào)出現(xiàn)分離。只有當(dāng)紅綠信號(hào)分離同時(shí)出現(xiàn)且距離一個(gè)信號(hào)直徑以上時(shí)，才能記為分離信號(hào)。每一列切片的整個(gè)核心區(qū)域至少有100個(gè)互不重疊的細(xì)胞核，在核心區(qū)域有超過(guò)10％的腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)紅綠分離信號(hào)，判斷熒光原位雜交陽(yáng)性；未出現(xiàn)紅綠信號(hào)分離，則判斷熒光原位雜交陰性；單獨(dú)出現(xiàn)紅色或綠色信號(hào)則不計(jì)數(shù)。

根據(jù)圖7所示結(jié)果可知，實(shí)施例2所述探針組在nb腫瘤組織的多數(shù)細(xì)胞核中均能顯示熒光信號(hào)，而且熒光信號(hào)清晰，信號(hào)亮度高，且在每一例組織切片中均成功進(jìn)行fish檢測(cè)，表明實(shí)施例2所述探針組具有特異性強(qiáng)及敏感性高的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)該探針穿透性強(qiáng)，信號(hào)清晰，信號(hào)亮度高，符合制備成診斷試劑盒的要求。

實(shí)驗(yàn)例3

參照實(shí)驗(yàn)例2所述方法，使用實(shí)施例2制備的探針組檢測(cè)50例已經(jīng)被確定為tert基因斷裂的nb腫瘤組織，結(jié)果顯示，其中的48例nb腫瘤組織被所述探針組檢測(cè)到紅綠分離信號(hào)，被判斷為tert斷裂或重組陽(yáng)性。由此可見(jiàn)，本發(fā)明所述探針組在檢測(cè)腫瘤組織的tert斷裂或重組情況的準(zhǔn)確率已經(jīng)達(dá)到96％。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。