本發(fā)明涉及分子診斷技術領域，特別涉及一種豬肺炎支原體的實時熒光PCR檢測試劑盒及其用途。

背景技術：

豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的，以咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性呼吸道傳染病，具有慢性、接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率的特征。該病廣泛分布于世界各地，國外常被稱為豬地方流行性肺炎，而在我國常被稱為豬氣喘病。Mhp感染導致豬的生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率減低、體重下降、出欄延遲等，同時破壞巨噬細胞，導致免疫抑制。因此臨床上，Mhp通常與豬藍耳病毒、豬圓環(huán)病毒、流感病毒、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、多殺巴氏桿菌等病原混合感染，不僅造成更嚴重的危害，也增加了診斷與防治的難度。豬支原體肺炎已成為當前嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟效益的重大疫病，被喻為影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟效益的陰性殺手。

Mhp傳統(tǒng)的診斷方法主要包括以下方法：(1)臨床與病理學診斷：該方法是一種輔助性診斷。通過剖檢肺臟組織，觀察組織特征性變化及病理觀察纖毛脫落與炎性細胞浸潤來進行診斷。但是由于Mhp多與其它呼吸道病原發(fā)生混合感染，因此只通過臨床與病理學方法來準確診斷Mhp十分困難。(2)病原學診斷：主要通過從豬體內(nèi)分離培養(yǎng)Mhp來進行病原學檢測，被認為是檢測病原的金標準。但是Mhp對培養(yǎng)條件要求很高，分離培養(yǎng)相當困難，且易受其它支原體污染，因此分離培養(yǎng)Mhp在臨床上使用十分受限。

近年來對Mhp快速檢測方法的研究有了很大的進展，一些敏感、特異、快速及準確的檢測方法已被廣泛應用于Mhp的診斷，包括補體結(jié)合試驗、間接血凝試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金等免疫學檢測方法，以及核酸探針、聚合酶鏈式反應(PCR)及其衍生技術的分子生物學檢測技術。目前臨床上使用較多的是ELISA法與PCR法。

免疫學檢測方法是基于抗體與抗原識別反應來檢測Mhp，文獻報道的主要有補體結(jié)合試驗、間接血凝試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金等。其中ELISA是發(fā)展較快的一種血清學檢驗方法。學者針對Mhp的保護性抗原，如P36、P46、P65等建立了相關ELISA方法，檢測靈敏度明顯高于補體結(jié)合試驗與間接血凝。豬體內(nèi)存在著將近20種支原體，通過免疫學方法不能避免支原體間的交叉反應，因此包括ELISA方法都容易在臨床檢測中受非特異性的影響，導致檢測結(jié)果的不準確。另外，抗體的產(chǎn)生要晚于病原的感染，檢測抗體來間接評估病原存在滯后性，無法及時有效的做到感染早期診斷預防。

近些年，隨著PCR技術的不斷改進，分子生物學檢測方法在對Mhp的檢測上有了更廣泛的應用，發(fā)展了多重PCR檢測技術、套式PCR診斷技術、實時熒光定量PCR診斷技術、環(huán)介導等溫擴增技術等。具體為：①常規(guī)PCR技術，是經(jīng)典的病原檢測方法，它具有簡潔、方便、快速及節(jié)約成本的優(yōu)點，但敏感性較低，不能定量，限制了該技術的發(fā)展，但常規(guī)PCR仍然廣泛應用在臨床檢測。Mhp的16SrRNA基因等多被報道用來設計引物建立PCR檢測技術。②多重PCR又稱復合PCR(multiplex PCR)，是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，使得一次擴增能同時對幾種不同類型的支原體進行檢測，擴增出多個核酸片段，其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同，節(jié)約了時間、試劑和成本，避免了多次配置PCR體系所造成的污染。但由于多重PCR擴增時，同時用幾對引物，可能引起非特異性擴增，對結(jié)果造成影響。③套式PCR又稱巢式PCR(Nested PCR，nPCR)，即在第一對引物(外套引物)的擴增區(qū)域內(nèi)另行設計一對引物(內(nèi)套引物)，用外套的擴增產(chǎn)物做模板進行第二次擴增。套式PCR外套擴增增加了起始模板量，內(nèi)套引物擴增將目的基因進一步倍增至可觀察的量，由于采用兩對不同的引物二級放大，故可提高PCR檢測的靈敏度，保證產(chǎn)物的特異性，使靈敏度和特異性高于傳統(tǒng)的PCR方法。此方法可快速、特異地從感染豬的鼻拭子和氣管、支氣管灌洗液中檢測到Mhp。這種方法敏感性較高，可用于活體豬和死亡豬的檢查，極大地方便了Mhp的流行病學研究，有利于了解豬場中病原感染及傳播方式，但陰性樣品容易受到氣溶膠中Mhp的污染，需要謹慎操作。④環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)是近年來興起的一種特殊的快速、高效、特異的PCR檢測方法，與常規(guī)PCR技術相比，不需要復雜的儀器設備，理論上適合用于基層實驗室和臨床監(jiān)測方面的應用。目前此項技術在人醫(yī)領域的應用逐步推廣，同熒光定量技術聯(lián)合，配套實時監(jiān)控設備，也解決了無法定量的缺點。但此項技術研發(fā)比較困難，試劑成本過高，獸用診斷方面多未臨床推廣使用。

實時熒光PCR(real-time PCR)技術是近年發(fā)展起來的一種新的實時定量檢測特定核酸的技術。實時熒光PCR檢測技術的建立填補了常規(guī)PCR技術不能準確定量的空缺該方法能夠?qū)崟r監(jiān)測，定量準確，靈敏度高，特異性強，重復性好，自動化程度高。近年來已解決檢測儀器國外壟斷、價格昂貴等問題，真正成為了一項方便、快捷、性價比高的檢測技術，適合在基層推廣。

豬肺炎支原體是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)種病原。Mhp造成免疫抑制，常同其它呼吸道病原混合感染，增加診斷與防治的難度。傳統(tǒng)的臨床病理診斷、分離培養(yǎng)方法與免疫學方法無法做到對于Mhp的精確診斷，急需一種用于感染早期精準診斷的技術。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在建立一種高效、快速、簡便的實時熒光PCR檢測Mhp的方法，并開發(fā)成標準化試劑盒，利用其高靈敏、高特異、低污染和實時檢測的特點，為一線豬場臨床豬支原體肺炎病的預警、早期診斷和防治監(jiān)測提供可靠的技術與產(chǎn)品保障。

基于以上目的，本發(fā)明提供了一種豬肺炎支原體的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：

上游擴增引物P46-f：5’-TTCGCTTGCATCAATTATTG-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴增引物P46-r：5’-CGGATTGTGGTTTAGAATC-3’，其為SEQ ID NO:2序列；

特異性熒光探針P46-p：FAM-5’-TGATTCTGTCTGTCCACAACCTGCTGC-3’-TAMRA，其為SEQ ID NO:3序列，其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。

合理的引物和熒光探針設計是成功應用實時熒光PCR技術的關鍵。引物和探針的特異性對反應有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴增構成中產(chǎn)生非靶標條帶，影響檢測結(jié)果的判定。

PCR及其衍生技術需要針對特定的靶標基因，目前用于豬支原體肺炎PCR檢測的靶基因主要包括16SrNA、p36(乳酸脫氫酶)、p46(表面膜蛋白)、p97(纖毛結(jié)合素)及p110(糖蛋白)。p46蛋白屬于能引起早期免疫應答反應且具有種特異性的表膜脂蛋白，也是豬肺炎支原體的主要免疫優(yōu)勢蛋白之一，又因與其他支原體無交叉反應，p46蛋白可以作為建立MPS檢測方法的優(yōu)選抗原。同源性比較表明，p46基因在MPS種內(nèi)高度保守。目前還未有依據(jù)p46基因而成的熒光PCR診斷方法的相關報道。

本發(fā)明對GenBank中公布的豬肺炎支原體168株編碼膜蛋白的p46基因序列進行對比分析，在Mhp的p46基因上篩選出一段高度保守的基因片段，該基因片段大小為86bp，作為本發(fā)明設計引物的靶片段。發(fā)明人針對該保守片段設計了多對引物和探針，最終根據(jù)擴增效果(擴增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。該引物為只針對豬肺炎支原體的通用上下游擴增引物，且匹配性和特異性良好。同時在該上下游引物擴增區(qū)86bp片段間設計了高度保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與Mhp核酸特異性結(jié)合，引物進行擴增過程中，探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴增效率較好，能特異性擴增Mhp基因組核酸，同其它種類的支原體及常見感染豬的病原無交叉。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物P46-f、所述下游擴增引物P46-r和所述特異性熒光探針P46-p的摩爾比為2:2:1。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物P46-f、所述下游擴增引物P46-r和所述特異性熒光探針P46-p在所述試劑盒中的使用終濃度均為0.1～0.4μM。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、熒光PCR反應液(含酶)、裂解液及說明書。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無RNA酶與DNA酶的ddH₂O；所述陽性對照為克隆有豬肺炎支原體p46基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-p46，克隆質(zhì)粒pEASY-p46的終濃度為1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS 0.1-0.2％；③吐溫20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％。

在PCR反應體系中加入熒光PCR反應液，其包括UNG酶系統(tǒng)，在擴增環(huán)節(jié)可以有效解決擴增污染現(xiàn)象，抗污染能力強等。本發(fā)明的熒光PCR反應液中還含有dNTPs、TaqDNA聚合酶和一些增強成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具體的增強成分根據(jù)實際需要進行添加。

在本發(fā)明中，所述豬肺炎支原體p46基因86bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

TTCGCTTGCATCAATTATTGCATTTGTTGCAGCAGGTTGTGGACAG-ACAGAATCAGGTTCGACTTCTGATTCTAAACCACAAGCCG，其為SEQ ID NO:4序列。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒pEASY-p46采用以下方法制備得到：提取豬肺炎支原體DNA，利用引物p46-f和p46-r擴增得到豬肺炎支原體p46基因片段，通過TA克隆將豬肺炎支原體p46基因片段連接至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-p46。

進一步的，本發(fā)明還提供了一種所述的豬肺炎支原體的實時熒光PCR檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)使用所述的實時熒光PCR試劑盒進行PCR擴增時，實時熒光PCR反應體系以20μL計為：

10μM的SEQ ID NO:1所示的上游擴增引物P46-f：0.4～0.8μL；

10μM的SEQ ID NO:2所示的下游擴增引物P46-r：0.4～0.8μL；

10M的SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針P46-p：0.2～0.4μL；

熒光PCR反應液(含酶)：16μL；

DNA模板：2～3μL；

ddH₂O：補足至20μL；

(2)實時熒光PCR的反應條件為：50℃UNG酶激活2min；95℃預變性5min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；結(jié)束反應；

(3)結(jié)果分析：

質(zhì)量控制：陰性對照FAM通道檢測無Ct值；陽性對照FAM通道檢測Ct值≤30；上述條件同時滿足，檢測結(jié)果有效；

結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為豬肺炎支原體感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬肺炎支原體感染陰性。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述DNA模板采用以下方法制備得到：

(1)全血、病料組織等可使用商品化DNA提純試劑盒進行提取，方法參照所使用試劑盒說明書；或者

(2)拭子、空氣樣品、血清或血漿可使用本發(fā)明試劑盒中提供的裂解液進行DNA釋放，將上述類型樣品進行瞬時離心(3000rpm離心10秒)后，微量取樣品上清1-2μL置PCR反應管中，加入等體積的裂解液，混勻室溫靜置5min，加入反應體系進行擴增。

裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％。

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，直接使用鹽酸胍、SDS、吐溫20、NP40對微量樣本進行高效裂解，DNA經(jīng)釋放后可穩(wěn)定存在，直接用于后續(xù)PCR反應。為避免溶血對PCR的影響，建議溶血嚴重樣本使用商品化DNA提純試劑盒進行提取。

在本發(fā)明中，為了使同一樣本獲得最大的擴增效率和最小的Ct值，對提取的DNA模板濃度、引物濃度和特異性熒光探針的濃度進行了優(yōu)化，尤其是探針的濃度。引物濃度過低會影響擴增效率，引物濃度過高會引起錯配和非特異性擴增，且增加引物之間形成二聚體的機會，同樣特異性熒光探針濃度過低會引起特異性的熒光信號變?nèi)?，而濃度過高則會引起探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號從而干擾特異性熒光信號，提取的DNA模板濃度會影響PCR擴增的效率，應根據(jù)目的基因的大小選擇合適的DNA模板濃度。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗，最終確定本發(fā)明的熒光PCR反應體系和反應條件，采用本發(fā)明的實時熒光PCR方法檢測豬肺炎支原體的擴增效率接近100％，并可獲得最小的Ct值。

更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備檢測豬肺炎支原體試劑中的用途。

本發(fā)明將豬肺炎支原體的p46基因和TaqMan探針相結(jié)合，針對豬肺炎支原體p46基因設計通用引物和特異性探針，通過對提取的DNA模板濃度、引物濃度以及特異性探針濃度等進行優(yōu)化，建立了檢測豬肺炎支原體核酸的實時熒光PCR方法。靈敏度試驗結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為10⁸-10¹copies/μL，可以檢測到最低10copies的豬肺炎支原體核酸，靈敏度是常規(guī)PCR方法的300倍。特異性試驗結(jié)果表明，該方法對豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬附紅細胞體、豬鼻支原體等核酸均無非特異性反應，說明該方法特異性和可靠性強。準確性試驗結(jié)果表明，對于陽性對照與陰性對照的檢測，該方法與常規(guī)PCR方法檢測結(jié)果100％符合；對于臨床血液樣品的檢測，該方法檢測豬肺炎支原體陽性17/98，常規(guī)PCR方法檢測豬肺炎支原體陽性4/98，且后者檢測的4份樣品使用該方法檢測均為陽性，說明該方法更敏感，準確性高。重復性試驗結(jié)果表明，該方法對不同核酸濃度(10⁶、10⁵、10⁴copies/μL)的陽性對照pEASY-p46克隆質(zhì)粒檢測變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復性。

綜上所述，本發(fā)明試劑盒檢測快速、準確、敏感，更適用于拭子、空氣樣品、血清或血漿中微量的豬肺炎支原體核酸檢測。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的檢測方法克服了常規(guī)檢測技術耗時長、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準確定量等問題，檢測快速高效，不會造成樣品交叉污染。

(2)本發(fā)明的檢測方法準確度高，靈敏度高，特異性強，重復性優(yōu)，可以實現(xiàn)較大通量樣品的檢測。

(3)本發(fā)明的檢測方法適用于檢測多種組織、拭子、血液樣品與空氣樣品，可用于任何實驗室和基層各級防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場等。

(4)本發(fā)明操作簡單操作時間短，做一次病原檢測僅需要2-3小時，快捷迅速、節(jié)約成本；而且需要儀器設備相對簡單，不需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及其分析軟件；結(jié)果相對可靠，不需要電泳，空氣中氣溶膠相對較少，不易污染；技術操作要求低，可以在基層大量推廣；基于該檢測方法制備的試劑盒易于質(zhì)量控制，易于標準化。

附圖說明

圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度標準曲線；

圖2為本發(fā)明敏感性檢測結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明特異性檢測結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明重復性檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細說明。

實施例1豬肺炎支原體的實時熒光PCR檢測試劑盒的組成

(1)熒光PCR反應液(含酶)：原料購自南京諾唯贊(VAZYME)公司；該反應液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴增環(huán)節(jié)可以有效解決擴增污染現(xiàn)象，抗污染能力強等；

(2)上下游引物p46-f和p46-r：由上海生工生物工程公司合成，用去離子水配制成濃度為10μM。

上游擴增引物P46-f：5’-TTCGCTTGCATCAATTATTG-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴增引物P46-r：5’-CGGATTGTGGTTTAGAATC-3’，其為SEQ ID NO:2序列；

(3)特異性熒光探針P46-p：由華大基因公司合成，用去離子水配制成濃度為10μM。

特異性熒光探針P46-p：FAM-5’-TGATTCTGTCTGTCCACAACCTGCTGC-3’-TAMRA，其為SEQ ID NO:3序列其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。

本發(fā)明對GenBank中公布的豬肺炎支原體168株編碼膜蛋白的p46基因序列進行對比分析，在Mhp高度保守的p46基因上設計了上下游擴增引物，且匹配性和特異性良好。同時在該上下游引物擴增區(qū)86bp片段間設計了高度保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與Mhp核酸特異性結(jié)合，引物進行擴增過程中，探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴增效率較好，能特異性擴增Mhp基因組核酸，同其它種類的支原體及常見感染豬的病原無交叉。

(4)陽性對照為克隆有Mhp編碼膜蛋白的p46基因片段的重組質(zhì)粒pEASY-p46，由本實驗室構建，質(zhì)粒在紫外分光光度計OD260nm測定質(zhì)量濃度，按公式6.02×10²³×(X ng/μL×10^-9)/DNA length×660換算為拷貝數(shù)，配制濃度為1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；

其中，克隆質(zhì)粒pEASY-p46的構建方法如下：①按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取豬肺炎支原體核酸；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作為特異性引物擴增p46基因中86bp目的片段，反應條件為：95℃預變性1min；95℃變性10Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定；②PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Excraction Kit膠回收試劑盒回收，通過TA克隆將Mhp P46基因中86bp目的片段克隆至pEASY-T1載體，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態(tài)細胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍白斑篩選后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進行擴增和測序，測序后比對成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-p46。

豬肺炎支原體p46基因86bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

TTCGCTTGCATCAATTATTGCATTTGTTGCAGCAGGTTGTGGACAG-ACAGAATCAGGTTCGACTTCTGATTCTAAACCACAAGCCG(SEQ ID NO:4)。

(5)陰性對照為無RNA酶與DNA酶的ddH₂O；

(6)病毒裂解液

病毒裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％。

本發(fā)明DNA模板根據(jù)不同的樣本情況，采用以下兩種不同的方法制備得到：

(1)全血、病料組織等可使用商品化DNA提純試劑盒進行提取，方法參照所使用試劑盒說明書；或者

(2)拭子、空氣樣品、血清或血漿可使用本發(fā)明試劑盒中提供的裂解液進行DNA釋放，將上述類型樣品進行瞬時離心(3000rpm離心10秒)后，微量取樣品上清1-2μL置PCR反應管中，加入等體積的裂解液，混勻室溫靜置5min，加入反應體系進行擴增。

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，直接使用鹽酸胍、SDS、吐溫20、NP40對微量樣本中的病毒進行高效裂解，DNA經(jīng)釋放后可穩(wěn)定存在，直接用于后續(xù)PCR反應。為避免溶血對PCR的影響，建議溶血嚴重樣本使用商品化DNA提純試劑盒進行提取。

(7)使用說明書。

實施例2豬肺炎支原體的實時熒光PCR檢測試劑盒的使用方法

本發(fā)明試劑盒使用方法具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)DNA提?。?4)實時熒光PCR：利用本發(fā)明設計的特異性引物和探針進行實時熒光PCR檢測；(5)判定結(jié)果。

1.樣品采集

(1)拭子樣品

A、鼻拭子用于鼻咽部標本的采集。首先將待檢豬綁定后，棉簽輕輕碰到鼻中隔，刺激豬打噴嚏3-5次后，迅速拔出棉簽得到鼻拭子樣本。

B、咽拭子用于咽部標本的采集，主要用于15kg左右的保育豬樣品的采集。首先肌肉注射氯胺酮使待檢豬全身麻醉，將嘴輕輕打開，插入喉鏡，挑起會厭軟骨暴露氣管口，將消毒棉簽在氣管和喉頭處擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，要盡量使咽部液體浸濕棉簽，迅速取出棉簽，及時用高壓滅菌的PBS浸泡所取樣本。

(2)肺部病料樣品

A、剖解取樣品：將患病豬剖解，取出完整的肺部樣品，放置在同一個干凈塑料袋內(nèi)。

B、記錄：將裝有樣品的塑料袋密封，貼標簽并記錄發(fā)病豬的日齡、體重、品種、臨床癥狀等信息。

C、將采集的病料樣品集中送至實驗室，并附上所記錄的信息。

(3)空氣樣品

在待檢豬場，通過電磁式空氣泵(內(nèi)部保證無菌)抽取豬場內(nèi)自然空氣，注入到無菌PBS的錐形瓶中，邊注邊輕搖晃動，持續(xù)4min，之后高速離心。

(4)血液樣品

使用5ml無菌注射器上腔靜脈采集仔豬血液，至冰箱冷藏保存，送至實驗室檢測。

2.DNA提取

(1)全血、病料組織等可使用商品化DNA提純試劑盒進行提取，方法參照所使用試劑盒說明書。

(2)拭子、空氣樣品、血清或血漿可使用本發(fā)明試劑盒中提供的裂解液進行DNA釋放。將上述類型樣品進行瞬時離心，微量取樣品上清1-2μL置PCR反應管中，加入等體積裂解液，混勻室溫靜置5min，加入反應體系進行擴增。

所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％。

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，直接使用鹽酸胍、SDS、吐溫20、NP40對微量樣本進行高效裂解，DNA經(jīng)釋放后可穩(wěn)定存在，直接用于后續(xù)PCR反應。為避免溶血對PCR的影響，建議溶血嚴重樣本使用商品化DNA提純試劑盒進行提取。

為監(jiān)測提取過程中的污染，建議在提取樣本的同時提取一管水作為陰性對照。

3.熒光PCR反應

對實時熒光PCR反應體系和反應條件進行優(yōu)化，優(yōu)化原則為：通過優(yōu)化使同一樣本獲得最大的擴增效率和最小的Ct值。經(jīng)過優(yōu)化，實時熒光PCR反應體系和反應條件如下所示：

(1)實時熒光PCR反應體系以20μL計為：10μM SEQ ID NO:1所示的上游擴增引物P46-f：0.4～0.8μL；10μM SEQ ID NO:2所示的下游擴增引物P46-r：0.4～0.8μL；10μM SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針P46-p：0.2～0.4μL；熒光PCR反應液(含酶)：16μL；DNA模板：2～3μL；ddH₂O：補足至20μL。

同時設有陽性對照和陰性對照，陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-p46：2～3μL，其余組分相同；陰性對照無RNA酶與DNA酶的ddH₂O：2～3μL，其余組分相同。

(2)熒光PCR反應條件為：50℃UNG酶激活2min；95℃預變性5min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；結(jié)束反應。

(3)結(jié)果分析：

質(zhì)量控制：陰性對照FAM通道檢測無Ct值；陽性對照FAM通道檢測Ct值≤30；上述條件同時滿足，檢測結(jié)果有效；

結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為豬肺炎支原體感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬肺炎支原體感染陰性。

實施例3豬肺炎支原體的實時熒光PCR檢測試劑盒的驗證

1.試劑盒擴增效率驗證

對陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-p46進行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)為：1.0×10⁸-1.0×10¹copies/μL，每個梯度重復三次進行豬肺炎支原體核酸實時熒光PCR，根據(jù)擴增結(jié)果制作標準曲線。

圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度擴增標準曲線(FAM通道)，其中該標準曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.29，截距：41.50，相關系數(shù)：1.000，擴增效率：1.012。

綜上，說明該試劑盒檢測豬肺炎支原體核酸的擴增效率接近100％。

2.試劑盒靈敏度研究

以10倍梯度稀釋的陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-p46作為模板，進行本發(fā)明試劑盒的靈敏度檢測，檢測范圍為10⁸-10¹copies/μL。結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為10⁸-10¹copies/μL，在此范圍的Mhp核酸含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測到最低10拷貝數(shù)的Mhp核酸含量的樣品，檢測結(jié)果見圖2。

3.試劑盒特異性研究

為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測豬圓環(huán)病毒，豬偽狂犬病毒，豬細小病毒，豬附紅細胞體、豬鼻支原體等病原核酸。

檢測結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對豬肺炎支原體核酸進行擴增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性檢測到Mhp，而不與其它病原核酸發(fā)生交叉反應，檢測結(jié)果見圖3。

4.試劑盒重復性研究

選用陽性對照pEASY-p46克隆質(zhì)粒10⁶、10⁵、10⁴copies/μL，對每個濃度的樣本做3個重復，結(jié)果不同核酸濃度的檢測變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復性。檢測結(jié)果見表1和圖4。

表1實時熒光PCR檢測豬肺炎支原體的重復性試驗

5.試劑盒準確性臨床驗證

同時采用本發(fā)明的試劑盒以及普通PCR方法對98份血樣以及5份健康的血樣進行了檢測，結(jié)果表明，對于臨床血液樣品的檢測，該方法檢測Mhp核酸陽性17/98，常規(guī)PCR方法檢測Mhp核酸陽性4/98，且后者檢測的4份樣品使用該方法檢測均為Mhp核酸陽性，說明該方法更敏感，準確性高；對于陰性臨床樣品的檢測，該方法檢測結(jié)果同常規(guī)PCR一致。

表2采用本發(fā)明試劑盒以及普通PCR對臨床樣品進行豬肺炎支原體核酸檢測結(jié)果的比較

綜上可見，本發(fā)明設計的一對特異性引物和一條熒光探針以及構成的試劑盒可以快速檢測豬肺炎支原體，而且該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復性好，檢測結(jié)果真實可靠。

所屬領域的普通技術人員應當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術特征之間也可以進行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務有限公司

<120>一種豬肺炎支原體的實時熒光PCR檢測試劑盒及其用途

<130> FI160721-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ttcgcttgcatcaattattg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

cggattgtggtttagaatc 19

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

tgattctgtctgtccacaacctgctgc 27

<210> 4

<211> 86

<212> DNA

<213>Mhp p46基因序列

<400> 4

ttcgcttgcatcaattattgcatttgttgcagcaggttgtggacagacagaatcaggttc 60

gacttctgattctaaaccacaagccg 86