本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物快速檢測(cè)方法，特別是涉及一種基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是日本科學(xué)家Notomi發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。與傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，LAMP不僅擴(kuò)增時(shí)間短，而且憑借極高的擴(kuò)增效率及較低的儀器要求，LAMP技術(shù)具有良好的現(xiàn)場(chǎng)、野外檢測(cè)及資源有限的基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)用前景。目前LAMP技術(shù)已被應(yīng)用于致病性微生物、致病性寄生蟲(chóng)、轉(zhuǎn)基因成分、腫瘤診斷，以及食品過(guò)敏原等領(lǐng)域。

目前用于LAMP檢測(cè)的主要有凝膠電泳法、濁度法、SYBR Green I熒光法、鈣黃綠素法、羥基萘酚藍(lán)法等幾種方法。然而，這些方法在檢測(cè)實(shí)際樣本時(shí)仍然具有一些諸如特異性及靈敏度等局限性。因此，發(fā)展新的高靈敏LAMP可視化策略對(duì)快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)LAMP可視化檢測(cè)及提高樣本檢測(cè)靈敏度。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)方法，包括：

用氫氧化鈉配制鎂試劑I溶液；

基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)反應(yīng)體系包括：Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、甜菜堿、鎂離子、dNTP Mix、LAMP引物混合物，以及DNA模板；

對(duì)所述反應(yīng)體系在一定擴(kuò)增條件下進(jìn)行擴(kuò)增后，加入鎂試劑I溶液，然后觀察試管顏色變化，并判定檢測(cè)結(jié)果。

其中，所述鎂試劑I溶液是由0.4-0.6mol/L的NaOH配制而成。

其中，所述反應(yīng)體系中鎂試劑I溶液的濃度為0.1-0.4mmol/L。

其中，所述反應(yīng)體系中鎂離子的濃度為3.0-10.0mmol/L。

其中，所述反應(yīng)體系中Bst DNA聚合酶用量為每25μL體系中含6-8U。

其中，所述反應(yīng)體系中甜菜堿濃度為8-12mmol/L。

其中，所述反應(yīng)體系中dNTP Mix濃度為1.2-1.6mmol/L。

其中，所述反應(yīng)體系中每25μL體系中含DNA模板1-2μL。

其中，所述反應(yīng)體系中LAMP引物混合物包含外引物(F3和B3)、內(nèi)引物(FIP和BIP)、環(huán)引物(LF和LB)，各引物濃度和比例如下：外引物(F3和B3)的濃度為0.1-0.3μM/L，內(nèi)引物(FIP和BIP)的濃度為1.2-1.8μM/L，環(huán)引物(LF和LB)的濃度為0.2-0.6μM/L；外引物(F3和B3)、內(nèi)引物(FIP和BIP)、環(huán)引物(LF和LB)的摩爾比為：1∶8∶2。

其中，所述擴(kuò)增條件為在60-65℃下反應(yīng)15-60分鐘，并在80℃反應(yīng)2-4分鐘。

其中，根據(jù)反應(yīng)后顏色進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判定：黃色表示陰性，紫紅色表示陽(yáng)性。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施方式一種基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)方法的流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施方式一種基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)方法效果；

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式的方法作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)方法

步驟S101：按照常規(guī)方法提取沙門(mén)氏菌基因組DNA作為L(zhǎng)AMP可視化檢測(cè)的模板。

步驟S102：在LAMP可視化檢測(cè)反應(yīng)體系分別加入緩沖液、BstDNA聚合酶、甜菜堿、鎂離子、dNTP Mix、引物組以及DNA模板。

步驟S103：對(duì)步驟S102得到的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后加入鎂試劑I溶液，然后根據(jù)試管顏色變化判定檢測(cè)結(jié)果。

基于鎂試劑I的可視化LAMP可視化檢測(cè)方法的擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中25μL的反應(yīng)體系為：LAMP引物混合物1μL，Bst DNA聚合酶8U，反應(yīng)液8.5μL，樣本DNA 1μL，染料1.5μL，然后用無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至25μL。配制好的反應(yīng)體系在PCR管混勻后，于62℃反應(yīng)60分鐘，并在80℃反應(yīng)3分鐘。然后觀察顏色試管顏色變化，判定檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，在該反應(yīng)體系下，對(duì)照中鎂離子與鎂試劑I結(jié)合成黃色，而陽(yáng)性樣本中，因鎂離子被消耗，鎂試劑I呈紫色。

實(shí)施例2NaOH濃度對(duì)LAMP可視化檢測(cè)的影響

首先，配置分別配制濃度為0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M及0.7M的NaOH溶液，然后用不同濃度的NaOH溶液配制鎂試劑I染料溶液；按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化不同NaOH濃度配制的鎂試劑I溶液對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示，NaOH濃度在0.4-0.6M之間時(shí)，對(duì)照為黃色，樣本為黃紫色或紫色，對(duì)照與樣本之間存在顏色差異。因此，在此濃度區(qū)間配制的鎂試劑I溶液可以用于檢測(cè)，其中0.5M的NaOH濃度效果最好。

表1 NaOH濃度對(duì)LAMP可視化檢測(cè)的影響

注：根據(jù)對(duì)照和樣本的顏色差異來(lái)判定該方法是否可以用于檢測(cè)。

實(shí)施例3鎂試劑I濃度對(duì)LAMP可視化檢測(cè)的影響

首先，配置配制濃度為0.5M的NaOH溶液，然后用該濃度的NaOH溶液配制3.5mM濃度的鎂試劑I溶液；按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，加入不同體積3.5mM濃度的鎂試劑I溶液，優(yōu)化體系中不同鎂試劑I濃度對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示，體系中鎂試劑I濃度為0.1-0.4mM，對(duì)照與樣本之間存在顏色差異。因此，在此濃度區(qū)間均可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，其中以0.2mM時(shí)，檢測(cè)效果最佳。

表2鎂試劑I濃度對(duì)LAMP可視化檢測(cè)的影響

注：根據(jù)對(duì)照和樣本的顏色差異來(lái)判定該方法是否可以用于檢測(cè)。

實(shí)施例4鎂離子濃度對(duì)LAMP可視化檢測(cè)的影響；

按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)體系中，加入不同體積鎂離子溶液，優(yōu)化體系中不同鎂離子濃度對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示，體系中鎂試劑I濃度為5.0-7.0mM時(shí)，對(duì)照與樣本之間存在顏色差異。因此，在此濃度區(qū)間均可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，其中以6.0mM時(shí)，檢測(cè)效果最佳。

表3鎂離子濃度對(duì)LAMP可視化檢測(cè)的影響

注：根據(jù)對(duì)照和樣本的顏色差異來(lái)判定該方法是否可以用于檢測(cè)。

實(shí)施例5是一種基于鎂試劑I的LAMP可視化檢測(cè)方法的靈敏度；

首先用常規(guī)方法培養(yǎng)沙門(mén)氏菌，按照實(shí)施例1中的方法提取基因組DNA，并使用核酸定量方法對(duì)基因組DNA進(jìn)行定量；定量的基因組DNA用無(wú)菌的TE進(jìn)行濃度調(diào)整得到100ng/μL的模板，并進(jìn)行梯度稀釋得到不同濃度的基因組DNA；按照實(shí)施例1描述的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示本方法的最低檢出度為1pg基因組DNA。

表4一種基于鎂試劑I的可視化LAMP可視化檢測(cè)方法靈敏度試驗(yàn)

注：“+”代表結(jié)果為陽(yáng)性，“-”代表結(jié)果為陰性。