本發(fā)明涉及微生物分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金藻的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

金藻是小球藻大規(guī)模培養(yǎng)中存在的一種污染最嚴(yán)重的原生動(dòng)物，它是一種鞭毛蟲(chóng)-Poterioochromonas sp.。該鞭毛蟲(chóng)具有自養(yǎng)與混合營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)，極易感染并快速吞噬小球藻，一經(jīng)感染，可使小球藻大規(guī)模培養(yǎng)在短時(shí)間內(nèi)完全潰敗，從而給小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)帶來(lái)極大危害。因此對(duì)于小球藻培養(yǎng)中金藻的早期快速監(jiān)測(cè)和分子鑒定方法的確定至關(guān)重要。

目前對(duì)金藻研究多局限于對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)以及其對(duì)水華藻種的吞噬習(xí)性方面的研究，而對(duì)其進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)方面的研究甚少，只停留在傳統(tǒng)的顯微鏡觀察、DNA一代測(cè)序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)階段。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察靈敏度低，最低限度為10⁴cells/mL，在原生動(dòng)物大量存在時(shí)適用，并且因?yàn)樵鷦?dòng)物種類(lèi)繁多，數(shù)量龐大，除了已知的形態(tài)學(xué)知識(shí)外，有很多形態(tài)上難以區(qū)分的物種，而DNA一代測(cè)序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)存在檢測(cè)效率低，操作繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間，假陽(yáng)性概率大，經(jīng)常影響對(duì)實(shí)際情況的判斷，錯(cuò)過(guò)最佳污染控制的時(shí)機(jī)，不適合基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，建立一種簡(jiǎn)單且靈敏的金藻早期監(jiān)測(cè)方法尤為重要。

LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)是由Notomi于2000年開(kāi)發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，借助具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，在恒等溫條件下進(jìn)行靶序列高效擴(kuò)增，可合成10⁹-10¹⁰個(gè)數(shù)量級(jí)的靶標(biāo)DNA。該技術(shù)避免了常規(guī)PCR對(duì)循環(huán)溫度的特殊要求，并因其高效性、簡(jiǎn)易行、成本低廉且檢測(cè)周期短等特點(diǎn)提升了它的應(yīng)用價(jià)值。到目前為止，還沒(méi)有將LAMP技術(shù)有效用于大規(guī)模微藻培養(yǎng)中的重要污染物金藻的早期監(jiān)測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在儀器設(shè)備有限的環(huán)境中，提供一種能簡(jiǎn)便快捷準(zhǔn)確的檢測(cè)到金藻的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大規(guī)模微藻培養(yǎng)中的重要污染物金藻進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是：采用金藻CoI基因應(yīng)用在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金藻中。一般在選擇檢測(cè)目的基因時(shí)，對(duì)于真核生物，優(yōu)先考慮的都是真核生物普遍存在的18S rRNA，但此基因具有高保守性，不適用于進(jìn)行物種特異性分析。而本發(fā)明經(jīng)過(guò)反復(fù)序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)采用CoI基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，可以有效的將金藻在微藻培養(yǎng)過(guò)程中即使有其他污染原生動(dòng)物存在的條件下也可以鑒定出來(lái)。CoI基因，細(xì)胞色素氧化酶I(CoI cytochrome c oxidase I)基因，這部分DNA序列能夠準(zhǔn)確區(qū)分出物種差異，具有每個(gè)物種的特異性，就像物種的“身份證”編號(hào)。在藻類(lèi)培養(yǎng)過(guò)程中，會(huì)應(yīng)對(duì)出現(xiàn)不同種微生物的污染，為了明確污染物的信息，本發(fā)明將金藻CoI基因作為目標(biāo)監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記。同時(shí)由于原生動(dòng)物基因序列相似度較大，如直接采用DNA直接測(cè)序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，檢測(cè)效率低，檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。故而本發(fā)明繼續(xù)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，將金藻CoI基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行特異性篩選(如序列SEQ ID No.7所示)和設(shè)計(jì)引物，繼而解決了第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，進(jìn)一步提供一組環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其可特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所述的分子標(biāo)記。

所述引物組優(yōu)選為：包括一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)狀引物；所述外引物為F3和B3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；所述內(nèi)引物為FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示；所述環(huán)狀引物為L(zhǎng)F和LB，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-6所示。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金藻的方法，以待測(cè)樣品質(zhì)粒和基因組DNA為模板，利用上述的特異性引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。

方法還包括步驟：采用所述的特異性外引物F3和B3，將包含目的擴(kuò)增片段的基因克隆到質(zhì)粒pGEM-T中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEMT-CoI作為檢測(cè)金藻拷貝數(shù)靈敏度的依據(jù)。

方法還包括步驟：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，如果出現(xiàn)特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有金藻，即為金藻陽(yáng)性。

優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：8U/μL的Bst DNA聚合酶：1μL；10×的Bst DNA聚合酶緩沖液：2.5μL；25mmol/μL的MgSO4：1.5μL；10mM的dNTPs：2.5μL；5mol/L的Betain：4μL；10mM的F3/B3引物：0.5μL；20mM的FIP/BIP引物：1.5μL；10mM的LF/LB引物：1μL；模板：1μL；H₂O：6.5μL。

優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：65℃反應(yīng)60min，80℃反應(yīng)7min。

優(yōu)選的，所述凝膠電泳是使用質(zhì)量體積比為2％的瓊脂糖凝膠，恒壓120V電泳30min。

本發(fā)明的方法也可設(shè)計(jì)為金藻早期快速鑒定試劑盒。其具有對(duì)樣本低要求，高效率，精確檢測(cè)，省時(shí)省力省費(fèi)用，效果顯著等特點(diǎn)。所述試劑盒中包含所述的特異性引物。

具體的，所述試劑盒可以包括檢測(cè)試劑和基因組DNA提取試劑。所述檢測(cè)試劑包括特異性引物組、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。所述基因組DNA提取試劑優(yōu)選包括Roche的High Pure Template Preparation Kit試劑盒和Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒中的一種。

本發(fā)明提供了一組快速檢測(cè)金藻的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物及檢測(cè)方法。所述引物組特異性強(qiáng)，靈敏度高，且具有很好的重復(fù)性。該方法可檢測(cè)出的最低濃度分別可達(dá)到100copies/μL金藻線(xiàn)粒體CoI基因的存在和1000cells/mL金藻細(xì)胞的存在，比傳統(tǒng)PCR技術(shù)的敏感度提高了1000倍，很好的解決了敏感性問(wèn)題，對(duì)微藻培養(yǎng)污染物的早期監(jiān)測(cè)具有重要意義。此外該方法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器，便于在條件有限的環(huán)境中進(jìn)行大量的樣品檢測(cè)。

對(duì)本發(fā)明方法的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性以及對(duì)環(huán)境樣品的有效性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)如下：

(1)靈敏度：用滅菌雙蒸水分別將質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)品pGEMT-CoI稀釋10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹cpies/μL，采用經(jīng)優(yōu)化后的體系進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證所建立的方法的靈敏度。本方法檢測(cè)范圍可達(dá)到8個(gè)數(shù)量級(jí)，其靈敏度可到100拷貝。

(2)特異性：本發(fā)明選取了22份樣品進(jìn)行特異性引物驗(yàn)證：5份輪蟲(chóng)樣品，12份纖毛蟲(chóng)樣品，2份變形蟲(chóng)樣品，1份鞭毛蟲(chóng)樣品，一份小球藻樣品。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示除了金藻外，其余樣品均為陰性結(jié)果。

附圖說(shuō)明

圖1為設(shè)計(jì)選擇的三對(duì)引物進(jìn)行可行性實(shí)驗(yàn)的初步篩選，其中M：100bp DNA Ladder；1：第一對(duì)引物；2：第二對(duì)引物；3：第三對(duì)引物；a：金藻基因組DNA作為模板；b：四膜蟲(chóng)基因組DNA作為模板；c：水對(duì)照；

圖2為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增金藻基因組DNA中CoI基因引物的一對(duì)特異性引物的結(jié)果；

其中M：100bp DNA Ladder；1：江西褶皺臂尾輪蟲(chóng)；2：海南褶皺臂尾輪蟲(chóng)；3：云南褶皺臂尾輪蟲(chóng)；4：血球藻旋輪蟲(chóng)；5：北京水輪蟲(chóng)；6：四膜蟲(chóng)；7：海南腹柱蟲(chóng)；8：北京Sterkiella；9：云南前口蟲(chóng)；10：北京草履蟲(chóng)；11：刀刀口蟲(chóng)；12尖毛蟲(chóng)；13：北京鐘蟲(chóng)Vorticella；14:海南扇形游樸蟲(chóng)；15:寡毛雙眉蟲(chóng)；16:膜袋蟲(chóng)；17：CBN Vannella；18：武漢Heterolobosean；19：海南鞭毛蟲(chóng)Suigetsumonas clinomigrationis；20：小球藻；21:水；22：金藻；

圖3為傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增金藻質(zhì)粒的敏感性結(jié)果：從左至右1-9分別為10⁹copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按十倍梯度稀釋樣品，濃度分別為10⁹～10¹copies/μL，M為DNA分子量標(biāo)記，N為陰性對(duì)照；

圖4為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增金藻質(zhì)粒的敏感性結(jié)果：從左至右1-9分別為10⁹copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按十倍梯度稀釋樣品，濃度分別為10⁹～10¹copies/μL，M為DNA分子量標(biāo)記，N為陰性對(duì)照；

圖5為傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增金藻基因組DNA的敏感性結(jié)果：從左至右1-8分別為10⁷cells/mL的細(xì)胞濃度按十倍梯度稀釋樣品，濃度分別為10⁷～10⁰cells/mL，M為DNA分子量標(biāo)記，N為陰性對(duì)照；

圖6為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增金藻基因組DNA的敏感性結(jié)果：從左至右1-8分別為10⁷cells/mL的細(xì)胞濃度按十倍梯度稀釋樣品，濃度分別為10⁷～10⁰cells/mL，M為DNA分子量標(biāo)記，N為陰性對(duì)照；

圖7為小球藻的細(xì)胞設(shè)定為10⁶個(gè)的添加實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的熒光信號(hào)圖，從左至右小球藻與金藻的細(xì)胞比例分別為10²:1、10³:1、10⁴:1、10⁵:1、10⁶:1；

圖8為小球藻的細(xì)胞設(shè)定為10⁷個(gè)的添加實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的熒光信號(hào)圖，從左至右小球藻與金藻的細(xì)胞比例分別為10²:1、10³:1、10⁴:1、10⁵:1、10⁶:1、10⁷:1；

圖9為小球藻的細(xì)胞設(shè)定為108個(gè)的添加實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的熒光信號(hào)圖，從左至右小球藻與金藻的細(xì)胞比例分別為10²:1、10³:1、10⁴:1、10⁵:1、10⁶:1、10⁷:1、10⁸:1。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1：引物的設(shè)計(jì)與合成

(1)引物設(shè)計(jì)篩選：根據(jù)金藻細(xì)胞色素氧化酶I(CoI cytochrome c oxidase I)基因序列設(shè)計(jì)合成若干對(duì)引物，并基于以下條件篩選其中可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的引物。

a.序列GC含量，含量介于40％-65％的定義為普通序列，含量大于65％的定義為GC富集序列，含量小于40％的定義為AT富集序列；

b.引物長(zhǎng)度基于GC含量不同，設(shè)置一下不同引物長(zhǎng)度，如下表：

c.根據(jù)序列GC含量的不同，設(shè)置了不同引物的解鏈溫度(Tm值)。

d.引物間距，F(xiàn)2和B2引物間距為120-180nt，F(xiàn)3與F2引物間距為0-20nt，F(xiàn)1c與B1c引物間距為0-100nt。

e.引物末端穩(wěn)定性，引物末端穩(wěn)定性采用引物末端6個(gè)堿基與靶標(biāo)序列節(jié)后前后的自由能差值(△G)來(lái)衡量。自由能差值采用SantaLucia方法進(jìn)行計(jì)算。F2、B2、F3、B3、LF、LB引物的3’短自由能差值應(yīng)該≤-4kcal/mol，F(xiàn)1c、B1c引物的5’端自由能差值應(yīng)該≤-3kcal/mol。

(2)引物組成：該方法主要是利用4種不同特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，且可在等溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成，擴(kuò)增效率高，可在15min-60min擴(kuò)增10⁹-10¹⁰倍；特異性高，靶基因序列的檢測(cè)可只通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的有，無(wú)來(lái)判定。有無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)是利用電泳的階梯狀條帶來(lái)判斷的。

擴(kuò)增原理：DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任意一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈會(huì)解離，變成單鏈。在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物的F2區(qū)段的3’末端為起點(diǎn)，與模板DNA互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前端的F3c序列互補(bǔ)，以3’末端為起點(diǎn)，通過(guò)鏈置換型DNA聚合酶的作用，一邊置換之前FIP引物合成的DNA鏈，一邊合成自身的DNA，如此向前延伸。最終F3引物合成而得到的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進(jìn)行置換產(chǎn)生一條單鏈，這條單鏈在5’末端存在互補(bǔ)的F1c和F1區(qū)段，發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，BIP引物同該單鏈雜交結(jié)合，以BIP引物的3’端為起點(diǎn)，合成互補(bǔ)鏈，在此過(guò)程中環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)。接著，類(lèi)似于F3,B3引物從BIP引物外側(cè)插入，形成堿基配對(duì)，以3’端為起點(diǎn)，在聚合酶的作用下，合成新的互補(bǔ)鏈。通過(guò)上述兩過(guò)程，形成雙鏈DNA。而被置換的單鏈DNA兩端存在互補(bǔ)序列，自然發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。至此為止的所有過(guò)程都是為了形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法基因擴(kuò)增循環(huán)的起點(diǎn)結(jié)構(gòu)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法基因擴(kuò)增循環(huán)：首先在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，以3’末端的F1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸。與此同時(shí)，F(xiàn)IP引物F2與環(huán)上單鏈F2c雜交，啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)。通過(guò)此過(guò)程，結(jié)果在同一條鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)，直至完成模板的復(fù)制擴(kuò)增。

根據(jù)以上設(shè)計(jì)和篩選，本發(fā)明最終選定三對(duì)特異性的外引物和內(nèi)引物，以及環(huán)狀引物。外引物為F3和B3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；內(nèi)引物為FIP(由F1c和F2的序列組成)和BIP(由B1c和B2的序列組成)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示；環(huán)狀引物為L(zhǎng)F和LB，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-6所示:

F3：5’-GTTCTTGTAACAGGACATGC-3’；

B3：5’-AAACAGTCCATCCGGTAC-3’；

FIP：5’-GGCTCCTATCATTAATGGAGCAAAATAATGATTTTCTTCATGGTTATGCC-3’；

BIP：5’-GGCGTTCCCAAGGCTAAATAATATTAGCTTCTACTAATGCTGATGA-3’；

LF：5’-GTTTCCAAATCCTCCAATT-3’；

LB：5’-GTTATTACCACCTTCTTTAT-3’。

實(shí)施例2：質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和制備

步驟：

1.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

利用PCR方法克隆得到含有靶基因序列的CoI基因片段，重組到載體pGEM-T中，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，命名為pGEMT-CoI。

2.定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

質(zhì)粒pGEMT-CoI用Omega質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取純化，根據(jù)Nanodrop8000測(cè)定的質(zhì)粒的濃度及質(zhì)量以及阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。

計(jì)算公式如下：

一個(gè)堿基對(duì)的平均分子量為660g/mol；

質(zhì)粒的總長(zhǎng)度為載體的總長(zhǎng)度加上插入片段的長(zhǎng)度；

N：代表阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×10²³copies/mol)。

實(shí)施例3：基因組DNA的提取

對(duì)純培養(yǎng)的金藻和小球藻的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到兩者的細(xì)胞密度。各取2mL細(xì)胞培養(yǎng)液分別采用High Pure Template Preparation Kit(Roche)提取純金藻DNA，用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)DNA提取試劑盒提取兩者混合的DNA，利用Nanodrop8000對(duì)DNA的濃度及質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。選取濃度和質(zhì)量最佳的DNA保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的建立

1.通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)探索，建立一個(gè)最優(yōu)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

所述最優(yōu)反應(yīng)體系的具體成分及含量如下(25μL)

所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：65℃反應(yīng)60min，80℃反應(yīng)7min。

所述凝膠電泳是使用質(zhì)量體積比為2％的瓊脂糖凝膠，恒壓120V電泳30min。

實(shí)施例5：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物可行性的初步篩選

為檢驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物的可行性，將合成的三組引物進(jìn)行樣品的可行性分析，本發(fā)明選擇陽(yáng)性樣品金藻基因組DNA，以及陰性四膜蟲(chóng)基因組DNA,以及水對(duì)照。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示除了第一組引物所得結(jié)果符合要求外，其余樣品均為陰性結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)圖1。

實(shí)施例6：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物特異性的驗(yàn)證

為檢驗(yàn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物的特異性，本發(fā)明選取了20份樣品進(jìn)行檢測(cè)：5份輪蟲(chóng)樣品，12份纖毛蟲(chóng)樣品，2份變形蟲(chóng)樣品，1份鞭毛蟲(chóng)樣品，一份小球藻，一份水對(duì)照。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示除了金藻外，其余樣品均為陰性結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)圖2。

實(shí)施例7：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的敏感性

1.模板質(zhì)粒和基因組DNA

根據(jù)實(shí)施例2中公式計(jì)算，用滅菌雙蒸水10倍梯度稀釋定量標(biāo)準(zhǔn)品pGEMT-CoI。稀釋后質(zhì)粒濃度分別為10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μL，采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。

根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果，用滅據(jù)雙蒸水10倍梯度稀釋金藻細(xì)胞樣品，進(jìn)行基因組DNA的提取，稀釋后細(xì)胞數(shù)分別為10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰cells/mL，采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。2.傳統(tǒng)PCR

以上述各梯度稀釋液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束，進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

3.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)

以上述各梯度稀釋液為模板，利用實(shí)施例4中所述反應(yīng)體系，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

結(jié)果表明，傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增后，對(duì)于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性檢測(cè)底線(xiàn)是10⁵copies/μL，如圖3；對(duì)于金藻基因組DNA檢測(cè)敏感性是10⁵cells/mL，如圖5。

以本發(fā)明提供的引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，對(duì)于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性檢測(cè)底線(xiàn)是10²copies/μL，可見(jiàn)敏感性比傳統(tǒng)PCR提高了1000倍，如圖4；對(duì)于金藻基因組DNA檢測(cè)敏感性是10³cells/mL，比傳統(tǒng)PCR敏感性提高了100倍，如圖6。

實(shí)施例8：金藻和小球藻添加實(shí)驗(yàn)

步驟：

1.小球藻的細(xì)胞設(shè)定為10⁶個(gè)

分別取10⁰、10¹、10²、10³、10⁴個(gè)金藻細(xì)胞，按照小球藻與金藻細(xì)胞比例依次為10⁶:1、10⁵:1、10⁴:1、10³:1和10²:1，按照實(shí)施例2和3所述的方法對(duì)其提取核酸。采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果顯示當(dāng)小球藻與金藻細(xì)胞比例等于10³:1時(shí)可有效的檢測(cè)到金藻的存在，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.小球藻的細(xì)胞設(shè)定為10⁷個(gè)

分別取10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵個(gè)金藻細(xì)胞，按照小球藻與金藻細(xì)胞比例依次為10⁷:1、10⁶:1、10⁵:1、10⁴:1、10³:1和10²:1，按照實(shí)施例3所述的方法對(duì)其提取核酸。采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果顯示當(dāng)小球藻與金藻細(xì)胞比例等于10⁴:1時(shí)可有效的檢測(cè)到金藻的存在，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。

3.小球藻的細(xì)胞設(shè)定為10⁸個(gè)

分別取10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶個(gè)金藻細(xì)胞，按照小球藻與金藻細(xì)胞比例依次為10⁸:1、10⁷:1、10⁶:1、10⁵:1、10⁴:1、10³:1和10²:1，按照實(shí)施例2和3所述的方法對(duì)其提取核酸。采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果顯示當(dāng)小球藻與金藻細(xì)胞比例小于等于10⁶:1時(shí)可有效的檢測(cè)到金藻的存在，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

從以上實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)可以看出，本發(fā)明的檢測(cè)方法能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出金藻的存在，所述引物特異性強(qiáng)，靈敏度高，且具有很好的重復(fù)性。該方法可檢測(cè)出的最低濃度分別可達(dá)到100copies/μL金藻線(xiàn)粒體CoI基因的存在和1000cells/mL金藻細(xì)胞的存在，比傳統(tǒng)PCR技術(shù)的敏感度提高了1000倍，很好的解決了敏感性問(wèn)題，對(duì)微藻培養(yǎng)污染物的早期監(jiān)測(cè)具有重要意義。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110> 國(guó)家開(kāi)發(fā)投資公司；中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所

<120> 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)金藻的方法及試劑盒

<130> P1610220

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttcttgtaa caggacatgc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacagtcca tccggtac 18

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggctcctatc attaatggag caaaataatg attttcttca tggttatgcc 50

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcgttccca aggctaaata atattagctt ctactaatgc tgatga 46

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtttccaaat cctccaatt 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttattacca ccttctttat 20

<210> 7

<211> 714

<212> DNA

<213> 金藻CoI基因

<400> 7

ggtcaacaaa tcataaagat attggtattt tatatatcat cttcggagca ttctctggag 60

tattagggac aactatgtct gttcttataa gaatggagct atcacaacct ggtagtgaaa 120

ttttacacgg aaattttcaa ttatataatg ttcttgtaac aggacatgct tttttaatga 180

ttttcttcat ggttatgcct atattaattg gaggatttgg aaactttttt gctccattaa 240

tgataggagc ccctgatatg gcgttcccaa ggctaaataa tatttcattc tggttattac 300

caccttcttt attattgtta ttatcatcag cattagtaga agctggacct ggtaccggat 360

ggactgttta tcctccttta tctagtattc aagctcattc aggaccttct attgatttag 420

ctatcttcag cttacattta tctggagcag cttctatttt aggttctata aattttatta 480

ctactatttt taatatgaga gcgcctggta tgttaatgca tagattacct ttatatgtat 540

ggtctgtatt agtaacatct tttttattag tactttcatt acctgtatta gggggtggaa 600

ttaccatgtt attaacagac agaaacttca atacaacttt ctttgaccct tgtggaggag 660

gagacccaat actatatcaa catttattct gattttttgg tcaccctgaa gttt 714