本發(fā)明屬于橡膠樹棒孢霉落葉病的病原菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測橡膠樹葉片攜帶棒孢霉落葉病病原菌CAS5亞型菌株的方法及引物。

背景技術(shù)：

天然橡膠是世界四大工業(yè)原料之一，我國是世界上最大的天然橡膠消費國，雖然也是生產(chǎn)國家之一，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)的需求。如何保證天然橡膠生產(chǎn)的穩(wěn)定和提高，是當(dāng)前亟待解決的問題。

由多主棒孢(Corynespora cassicola)引起的棒孢霉落葉病(Corynespora leaf fall disease，CLFD)是繼南美葉疫病(South American Leaf Blight，SALB)之后第二個威脅世界天然橡膠產(chǎn)業(yè)的重要病害，現(xiàn)已成為亞洲和非洲等天然橡膠產(chǎn)區(qū)最具破壞性的病害之一。近年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病已成為危害我國橡膠樹苗圃的主要病害，疫情發(fā)展迅速，潛在威脅巨大。該病在橡膠樹的各個生理期均能發(fā)生，主要為害橡膠樹葉片，引起橡膠樹反復(fù)落葉、樹冠稀疏，影響幼苗和幼樹生長，降低開割樹產(chǎn)膠量。該病在葉片上表現(xiàn)出多種癥狀，除了“魚骨狀”的典型癥狀，還包括圓斑和回枯等癥狀。該病害有些癥狀易與白粉病和炭疽病的病害癥狀混淆。因此，給該病害的準(zhǔn)確鑒定帶來了一定的困難。

寄主選擇性毒素cassiicolin是橡膠樹多主棒孢的主要致病因子。目前，國外已經(jīng)明確了橡膠樹上的多主棒孢存在5個cassiicolin毒素亞型，根據(jù)毒素亞型和寄主專化性將該病害的病原菌分為多個生理小種。具有Cas1亞型菌株致病性最強，主要分布在菲律賓和喀麥隆、加納等非洲國家。Cas3和Cas4亞型均來自于巴西橡膠樹內(nèi)生多主棒孢菌株。Cas5亞型菌株則來源于馬來西亞、斯里蘭卡等亞洲國家的橡膠樹。還有一些橡膠樹多主棒孢菌株未檢測到cassiicolin基因，劃分為Cas0型，主要分布于馬來西亞、斯里蘭卡、印度和泰國等亞洲各植膠國家。而我國橡膠樹多主棒孢主要有Cas2、Cas5和Cas0三種類型，其中Cas5亞型為優(yōu)勢群體，危害最嚴(yán)重。對病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，進(jìn)而對病害進(jìn)行快速的早期診斷，具有重要實際應(yīng)用價值。

目前，只是建立了橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌多主棒孢的特異引物和PCR檢測方法，還沒有多主棒孢種以下小種或亞型的特異引物和PCR檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明根據(jù)cassiicolin毒素編碼基因序列設(shè)計了一對橡膠樹多主棒孢Cas5亞型菌株的特異性檢測引物，并建立了PCR檢測方法，實現(xiàn)高效準(zhǔn)確的對橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌的分子檢測。

本發(fā)明的目的之一是提供一對多主棒孢Cas5亞型菌株的特異引物,以及特異性強、靈敏度高、易于操作、結(jié)果可靠的橡膠樹棒孢霉落葉病分子檢測方法。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的：

對橡膠樹棒孢霉落葉病發(fā)病葉片進(jìn)行取樣，提取樣品基因組DNA作為模板，以

上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’(序列表中序列1)；

下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’(序列表中序列2)；

進(jìn)行PCR擴增，

PCR擴增反應(yīng)體系中含有待測樣品DNA，2.5μL含15mM MgCL2的10×PCR緩沖液，2μL濃度為2.5mM dNTP,濃度為10μmoll-1上游正向引物和下游反向引物各1μL，；1U的Taq DNA聚合酶，加雙蒸水補足到25μL；

PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52℃退火30s,72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。

取5μL PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。染料染色后根據(jù)有無擴增產(chǎn)物判定結(jié)果，擴增產(chǎn)物中含有350bp的條帶，則待測樣品中帶有多主棒孢Cas5毒素亞型菌株。

本發(fā)明的有益效果為：上述引物可應(yīng)用于引起橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌多主棒孢Cas5亞型菌株的鑒定和檢測，可以在菌量較少的情況下檢測到病原菌多主棒孢Cas5亞型菌株的存在。實驗證明，當(dāng)待測樣品達(dá)到10pg時即可檢出，表明該方法具有較高的靈敏性。同時，本發(fā)明的引物可以縮短對病原菌菌種的鑒定時間，從而達(dá)到快速高效鑒定菌種的目的。

所發(fā)明的檢測方法適用于橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌(Corynespora cassiicola)和田間帶菌橡膠樹組織高靈敏度快速檢測，為橡膠樹棒孢霉落葉病的早期診斷和及時預(yù)防提供可靠地理論依據(jù)和技術(shù)方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明特異性引物檢測樣品DNA擴增后的凝膠電泳圖。

圖2為本發(fā)明的引物靈敏度檢測結(jié)果。

具體實施方式

實施例1、本發(fā)明的用于快速檢測多主棒孢Cas5亞型菌株引物的獲得及其應(yīng)用

一、用于快速檢測多主棒孢Cas5亞型菌株引物的獲得

將本實驗室測序獲得的不同亞型的cassiicolin毒素編碼基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已登錄6個亞型的cassiicolin毒素編碼基因序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)Cas5亞型與其它亞型間的差異位點設(shè)計特異引物，所得引物即為本發(fā)明的引物，引物序列為上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’(序列表中序列1)；下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’(序列表中序列2)。

二、本發(fā)明用于多主棒孢Cas5亞型菌株的快速檢測引物的效果驗證

1、引物合成

上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’；下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’由華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

2、特異引物的準(zhǔn)確性驗證

以下為研究所用菌株：8株Corynespora cassiicola Cas5亞型菌株；3株Corynespora cassiicola Cas2亞型菌株；2株Corynespora cassiicola Cas0亞型菌株；1株膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；1株尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatun)；1株橡膠粉孢(Oidium.hevea)。

上述菌株除了橡膠粉孢(Oidium.hevea)的基因組DNA從發(fā)病組織直接提取，其它菌株均保藏于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。菌株相應(yīng)的分離自我國海南、云南、廣東等植膠區(qū)的橡膠樹棒孢霉落葉病病樣，所有菌株都經(jīng)過了形態(tài)鑒定和ITS序列的分子鑒定，多主棒孢菌株還進(jìn)行了毒素亞型的分子鑒定。

3、提取病原菌DNA

(1)從生長7d的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物邊緣打取菌絲塊，將菌絲轉(zhuǎn)接到50mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中，25℃，200rpm振蕩培養(yǎng)4-5d；

(2)將生長了5d的菌絲真空抽濾，用Whatman No.1濾紙過濾收集菌絲體，然后用無菌水清洗菌絲體3次，置于真空冷凍干燥儀中干燥，放于－80℃冰箱，備用；

(3)用預(yù)冷的研缽和研磨棒在液氮中充分迅速的將1g菌絲體研磨成粉狀。將研磨粉碎的菌絲體分裝于50mL離心管中(注意分裝時離心管應(yīng)預(yù)冷，且粉狀菌絲要一直處于冷卻狀態(tài)以防止DNA降解)。加入15mL預(yù)熱(65℃)的CTAB提取緩沖液，充分振蕩均勻，65℃下水浴1h，期間10min振蕩一次；

(4)加入3mL 5mol/L KAc，冰浴20min；

(5)加入氯仿：異戊醇(24：1)，4℃10,000rpm離心5min；

(6)取上清轉(zhuǎn)入另一個干凈的50mL離心管中，加入0.6V體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻后，-20℃靜置30min；

(7)用毛細(xì)管挑出絮狀沉淀，75％的乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗一次，倒置離心管于干凈的吸水紙上，在滅菌的工作臺中吹干沉淀；

(8)將沉淀重懸于500μL的TE緩沖液中，加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃處理1h；

(9)將上步所獲的溶液轉(zhuǎn)入干凈的2mL離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，來回顛倒離心管數(shù)次將其混勻，4℃10,000rpm離心10min；再用氯仿：異戊醇(24：1)抽提一次；

(10)吸取上清轉(zhuǎn)入干凈的2mL離心管中，加入1/10體積預(yù)冷的3mol/L NaAc(PH5.2)，2.5V體積預(yù)冷的無水乙醇，-80℃沉淀30min以上，4℃12,000rpm離心30min。棄上清，用70％的乙醇洗一次，吹干后溶于500μL的TE，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、病原菌ITS的PCR擴增

以步驟3提取的8株Corynespora cassiicola Cas5亞型菌株；3株Corynespora cassiicola Cas2亞型菌株；2株Corynespora cassiicola Cas0亞型菌株；1株膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；1株尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatun)；1株橡膠粉孢(Oidium.hevea)樣品基因組DNA分別作為模板，以

上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’；

下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’；

進(jìn)行PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系中含有待測樣品DNA，2.5μL含15mM MgCL₂的10×PCR緩沖液，2μL濃度為2.5mM dNTP,濃度為10μmol/l上游正向引物和下游反向引物各1μL，；1U的Taq DNA聚合酶，加雙蒸水補足到25μL；

PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52℃退火30s,72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。

取5μL PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。染料染色后根據(jù)有無擴增產(chǎn)物判定結(jié)果，擴增產(chǎn)物中含有350bp的條帶，則待測樣品中帶有多主棒孢Cas5毒素亞型菌株。

結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，8株Corynespora cassiicola Cas5亞型菌株(圖1中泳道1-8)均擴增出350bp的條帶，而其他病原菌(泳道10-17)均為擴增到相應(yīng)條帶。說明本發(fā)明的方法準(zhǔn)確性很高。

將其中一株Corynespora cassiicola Cas5亞型菌株的基因組DNA定容，然后依次稀釋十倍，用上述方法進(jìn)行擴增，結(jié)果表明，當(dāng)待測樣品在擴增體系中達(dá)到10pg時即可檢出，表明該方法具有較高的靈敏性(圖2，圖2的泳道1-7為依次十倍稀釋的Corynespora cassiicola Cas5亞型菌株的基因組DNA)。

以上說明對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在不脫離所附權(quán)利要求所限定的精神和范圍的情況下，可做出許多修改、變化或等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110>中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所

<120> 橡膠樹棒孢霉落葉病菌CAS5亞型菌株的分子檢測方法

<130> WHOI160084

<160>2

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

cgaatgacag ccaggag 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

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