本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及茄子果色上位性基因D的定位及其InDel分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：茄子果色遺傳是多基因控制的復(fù)雜性狀。發(fā)明人在茄子育種實踐中發(fā)現(xiàn)2對上位性效應(yīng)基因控制的茄子果色遺傳現(xiàn)象（圖1）。即2個純合的白果色茄子雜交后，F(xiàn)1代果色為紫紅色，F(xiàn)2代紫紅果色和白果色植株分離比為9:7，說明其果皮著色受到具有上位性的2個基因位點控制的，2個白果色茄子是由于控制花青素生物合成過程的2個獨立而又互補的基因位點（D基因和P基因）分別失活引起的。目前有關(guān)茄子果色上位性基因尚未開展相關(guān)分子標(biāo)記及定位研究。因此，開展茄子果色上位性基因的分子標(biāo)記和定位研究，可以為茄子果色分子標(biāo)記輔助選擇育種及基因克隆奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供茄子果色上位性基因D的定位及其InDel分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：采用SLAF-Seq與BSA關(guān)聯(lián)分析技術(shù)結(jié)合，將控制茄子果色上位性遺傳的2個基因（D和P）分別定位到相應(yīng)的兩個較小的區(qū)域。由于控制性狀的是兩對獨立的等位基因且分離比為9:7，確定兩個混池基因型的分離比（紫色混池D:紫色混池d：白果混池D：白果混池d）為6:3:2:5，通過卡方檢驗，共得到784個SNP位點（P>0.95）；將過濾得到的784個SNP用ED法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計算關(guān)聯(lián)值，根據(jù)99百分位數(shù)確定關(guān)聯(lián)閾值0.822。關(guān)聯(lián)到的SNP列表見表1。從表1可見，控制茄子果色的上位性基因D定位于茄子的10號染色體上。并進(jìn)一步檢測到與控制茄子果色的上位性基因D緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，其位于茄子的10號染色體上，其關(guān)聯(lián)區(qū)域所在核苷酸序列如Sme2.5_00538.1所示。本申請還進(jìn)一步開發(fā)了與控制茄子果色的上位性基因D緊密連鎖的InDel分子標(biāo)記，其為長度29bp的特異插入片段，插入位點在基因序列Sme2.5_00538.1的第22522bp處。所述InDel分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用于擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述InDel分子標(biāo)記的引物對，其核苷酸序列如下所示：22522F2：5'-ACCGAGCCATTAGGACCTCTTGT-3'，22522R2:5'-GGGAGTCCGATGCAAATTCTTGT-3'。以上所述的分子標(biāo)記、InDel分子標(biāo)記、引物對在茄子果色選育中的應(yīng)用。茄子果色上位性基因D的基因型檢測方法，包括如下步驟：（1）利用上述引物對PCR擴(kuò)增待檢植株DNA；（2）如果擴(kuò)增產(chǎn)物中僅有440bp片段，則該植株基因型為dd；如果擴(kuò)增產(chǎn)物中僅有469bp片段，則該植株基因型為DD；同時有469bp和440bp兩個片斷的則基因型為Dd。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明將控制茄子果色的1個上位性基因D定位于茄子的10號染色體上的較小關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)。并提供了與茄子果色上位性基因D緊密連鎖的分子標(biāo)記InDel22522，該標(biāo)記距離目標(biāo)基因D的遺傳距離為0.61cM，可直接用于茄子果色上位性基因D分子標(biāo)記輔助育種體系的建立。本發(fā)明的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記擴(kuò)增引物可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于茄子果色選育實踐中，同時為克隆茄子果色上位性基因D及其功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。附圖說明圖1為母本材料Female果色為白色，而且在整個生育期，下胚軸、葉脈，花，萼片都觀察不到花青素的合成；父本Male果色為白色，苗期下胚軸微紫、葉脈泛紫，花色微紫，F(xiàn)1代材料下胚軸、葉脈、花色和果色都呈現(xiàn)紫紅色。圖2為InDel22522標(biāo)記在F2分離群體白果色單株中的PCR擴(kuò)增結(jié)果：M為100bpDNAladder；母本擴(kuò)增長度為469bp（基因型DD）、父本擴(kuò)增長度為440bp（基因型dd）；F1代單株擴(kuò)增帶型為469bp和440bp兩條帶（基因型Dd）；1-12為F2代分離群體單株，其中，1-6為綠莖白果色單株（基因型有DDpp、Ddpp、ddpp），7-12為紫紅莖白果色單株（基因型有ddPP、ddPp）。圖3為InDel22522標(biāo)記在F2分離群體紫紅果色單株中的PCR擴(kuò)增結(jié)果：M為100bpDNAladder；母本擴(kuò)增長度為469bp（基因型DD）、父本擴(kuò)增長度為440bp（基因型dd）；F1代單株擴(kuò)增帶型為469bp和440bp兩條帶（基因型Dd）；1-12為F2代紫紅果色單株（基因型有DDPP、DDPp、DdPP和DdPp）。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所采用的分子生物學(xué)實驗技術(shù)包括DNA提取、PCR擴(kuò)增、PAGE凝膠電泳等實驗，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW，JanssenK,ArgentineJ.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1一、遺傳群體的構(gòu)建及遺傳分析1、供試材料植物材料：以廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所經(jīng)多代嚴(yán)格套袋自交選育的2份白果色的茄子純化自交系為父本（Male，基因型為ddPP）和母本(Female，基因型為DDpp)，配制雜交組合F1，F(xiàn)1單株自交得到F2。母本材料Female果色為白色，而且在整個生育期，下胚軸、葉脈，花，萼片都觀察不到花青素的合成；父本Male果色為白色，苗期下胚軸微紫、葉脈泛紫，花色微紫，F(xiàn)1代材料下胚軸、葉脈、花色和果色都呈現(xiàn)紫紅色（圖1）。F2分離世代紫紅和白果色植株的分離比經(jīng)卡方檢驗符合9:7。2、遺傳分析在F2代分離群體果色分為紫紅果色（有花青素）和白果色（無花青素）。486個單株組成的F2群體中，紫紅果色單株和白果色單株分別為259株和227株，卡平方（Ｘ2）檢驗其是否符合9：7比率，結(jié)果Ｘ2＝1.73（P=0.19），小于Ｘ20.05＝3.84（df=1），所以紫紅果色單株總數(shù)和白果色單株總數(shù)符合9：7比率。因此，明確了本研究中所用的茄子材料果色遺傳是受2個相互作用的上位性基因（D和P）控制的。二、茄子果色上位基因定位1、親本及F2紫紅果色池和白果色池DNA制備2個白茄父、母本各取10株苗期葉片，分別提取葉片DNA，每株取等量DNA混合，構(gòu)成父本池和母本池；F2分離群體，苗期單株取葉片，分別提取DNA，坐果期進(jìn)行果色調(diào)查，然后取100株果色為紫紅的單株DNA等量混合構(gòu)成紫紅果色池，取100株果色為白的單株DNA等量混合構(gòu)成白果色池。2、SLAF-seq結(jié)合BSA分析方法定位茄子果色上位性基因本研究前期委托北京百邁客生物科技有限公司利用其自主研發(fā)的SLAF-seq技術(shù)進(jìn)行簡化基因組測序（Sunetal.,2013），并結(jié)合集群分離分析方法（BSA）對茄子果色上位性基因進(jìn)行定位。利用2014年9月公開的茄子基因組SME_r2.5.1（http://eggplant.kazusa.or.jp）序列信息，將1117個Scaffold上共231490個SNP對應(yīng)到基因組上相應(yīng)的Scaffold。然后過濾掉低深度的SNP位點，過濾掉親本基因型相同以及雜合的SNP位點，最后過濾掉不符合分離比的SNP位點，共得到784個SNP位點。將過濾得到的784個SNP用ED法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計算關(guān)聯(lián)值（表1），根據(jù)99百分位數(shù)確定關(guān)聯(lián)閾值0.822。根據(jù)卡方檢驗和關(guān)聯(lián)計算結(jié)果，將控制茄子果色的1個上位性基因D定位于茄子的10號染色體上，其關(guān)聯(lián)區(qū)域所在核苷酸序列如Sme2.5_00538.1（http://eggplant.kazusa.or.jp）所示。（表1）。表1D基因位點關(guān)聯(lián)到顯著的SNP列表Sacffold名稱位置對應(yīng)連鎖群對應(yīng)MarkerED5關(guān)聯(lián)值Sme2.5_00538.118818E10gg3107_17191.120Sme2.5_00538.118874E10gg3107_17191.052Sme2.5_00538.118886E10gg3107_17191.0523、分子標(biāo)記InDel22522開發(fā)基于父、母本基因組重測序結(jié)果，在關(guān)聯(lián)區(qū)域所在的ScaffoldSme2.5_00538.1附近尋找InDel標(biāo)記，在序列Sme2.5_00538.1的第22522位點找到了一個InDel標(biāo)記，其在母本中比父本中多了1個29個堿基的插入。序列如SEQIDNO.1所示：5’-TTGCTGATTCACTCATATGATTTTTTGGA-3’（SEQIDNO.1）。根據(jù)上述InDel標(biāo)記設(shè)計了一組特異性引物對，該引物對可在母本中擴(kuò)增出長度為469bp的片段（基因型DD），序列如SEQIDNO.2所示；可在父本中擴(kuò)增出長度為440bp的片段（基因型dd），序列如SEQIDNO.3所示。如果同時有469bp和440bp兩個片斷擴(kuò)增則基因型為Dd。所示引物對的核苷酸序列如下所示：22522F2：5'-ACCGAGCCATTAGGACCTCTTGT-3'（SEQIDNO.4），22522R2:5'-GGGAGTCCGATGCAAATTCTTGT-3'（SEQIDNO.5）。實施例2分子標(biāo)記InDel22522的應(yīng)用1、F2單株DNA制備以廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所經(jīng)多代嚴(yán)格套袋自交選育的2份白果色的茄子純化自交系為父本（Male，基因型為ddPP）和母本(Female，基因型為DDpp)，配制雜交組合F1，F(xiàn)1單株自交得到F2，F(xiàn)2分離群體，共207株。父本、母本、F2單株苗期取葉片，分別提取DNA，坐果期進(jìn)行果色調(diào)查。2、分子標(biāo)記InDel22522在父本、母本、F2分離群體單株中PCR擴(kuò)增檢測擴(kuò)增體系為20μL：ddH2O5μL，PCRmix(Genstar)10μL，22522F2引物（10μmol/L）1.5μL，22522R2引物（10μmol/L）1.5μL，DNA模板（500ng/μL）2μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次；72℃再延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，分別取20μL產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖上電泳，Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。3、PAGE膠電泳及顯色PCR產(chǎn)物檢測利用8％變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測，上樣量為1μL，采用160V恒電壓電泳2.5~3h。PAGE膠染色采用快速銀染法，具體為：（1）從玻璃板上拆下膠置于蒸餾水中漂洗，并重復(fù)一次；（2）0.1%AgNO3溶液中染色10min；（3）蒸餾水漂洗2次；（4）1x顯色液200ml+800μL甲醛中顯色10分鐘；（5）自來水漂洗2次后讀帶。4、檢測結(jié)果檢測結(jié)果如圖2和圖3所示。特異性引物對對母本的擴(kuò)增長度為469bp（基因型DD）、父本的擴(kuò)增長度為440bp（基因型dd）；F1代單株的擴(kuò)增帶型為469bp和440bp（基因型Dd）；對F2代白果色單株的擴(kuò)增帶型分2種情況考慮：一種情況是綠莖白果色單株，其可能基因型有DDpp、Ddpp、ddpp，因此D基因分子標(biāo)記InDel22522擴(kuò)增結(jié)果有3種情況，既469bp（基因型DD）、440bp（基因型dd）、469bp和440bp（基因型Dd），圖2中（泳道1-6）為后2種情況的帶型；另一種情況是紫紅莖白果色單株，其可能基因型有ddPP、ddPp，因此D基因分子標(biāo)記InDel22522擴(kuò)增結(jié)果為440bp（基因型dd），如圖2泳道7-12結(jié)果。對F2代紫紅果色單株的擴(kuò)增帶型：F2代紫紅果色單株可能基因型有DDPP、DDPp、DdPP和DdPp，因此D基因分子標(biāo)記InDel22522擴(kuò)增結(jié)果有2種情況，既469bp（基因型DD）、469bp和440bp（基因型Dd），如圖3所示。InDel標(biāo)記檢測結(jié)果符合F2分離世代的果色分離與基因型的對應(yīng)關(guān)系，說明本方法準(zhǔn)確性高，可應(yīng)用于茄子果色上位性基因D分子標(biāo)記的輔助育種。SEQUENCELISTING<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所<120>茄子果色上位性基因D的定位及其InDel分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用<130><160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>29<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>1ttgctgattcactcatatgattttttgga29<210>2<211>469<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>2accgagccattaggacctcttgtcgagctcgttgctgattcactcatatgattttttgga60ttgcggattcactcatatgattttttggaaatattgcatcggaccccctgcagcgccaga120attcgtgggctaacacccatagaaaactgctgaaatcgtttgtttcctgttccttggtcc180ataaaatcctatcaaacatccccccgccgccgctgggacacatacgcctcttgccaggct240cgttttggatccactcatataattttttgggaatgttgcgccagaccccctcagcgccag300aatccgtggggtaatacccatagaaaactgtcgaaatcatttgtttcctgttccttggcc360cataaaatcctaccaagcgtcccccgccgccacaaggccacctaagcctcttgctgagct420cgttacggacccattcatatgattttacaagaatttgcatcggactccc469<210>3<211>440<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>3accgagcccataggacctcttgtcgagctcgttgcggattcactcatatgattttttggg60aatattgcgtcggaccccctgcagcgccagaattcgtgggctaacacccatagaaaactg120ctgaaatcgtttgtttcctgttccttggtccataaaatcctatcaaacatccccccgccg180ccgctgggacacatacgcctcttgccaggctcgttttggatccactcatataattttttg240ggaatgttacgccagaccccctcagcgccagaatccgtggggtaatacccatagaaaact300gtcgaaatcatttgtttcctgttccttggcccataaaatcctaccaagcgtccccctccg360ccacaaggccacctaaacctcttgttgagctcgttgcggacccattcatatgattttaca420agaatttgcatcggactccc440<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4accgagccattaggacctcttgt23<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5gggagtccgatgcaaattcttgt23當(dāng)前第1頁1 2 3