茄子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了茄子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因及其應(yīng)用，其具有Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明根據(jù)Mi基因序列設(shè)計兩個特異引物，采用RACE方法獲得茄子Mi同源基因的全長序列，利用RT-PCR技術(shù)驗證其功能，為茄子抗根結(jié)線蟲分子育種奠定初步基礎(chǔ)。
【專利說明】茄子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體的涉及一種茄子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因及 其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)在已經(jīng)克隆的抗線蟲基因主要集中于番茄、辣椒、甜菜、馬鈴薯和小麥，其中以 番茄Mi基因研究的最為詳細(xì)。抗線蟲基因編碼的蛋白大多含有保守的結(jié)構(gòu)域，如C-端存在 富亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat, LRR)，N-端存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZ)，跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TM)等。第一個克隆到的抗線蟲基因是Hsl pi^1,它來自甜菜，只有抗甜菜胞囊線蟲 的作用，其編碼的蛋白有一個LRR結(jié)構(gòu)域和一個TM結(jié)構(gòu)域，但是其LRR結(jié)構(gòu)域很小，序列與 其它R基因編碼的蛋白的LRR有明顯差異。番茄Mi是利用圖位克隆從秘魯番茄So I anum peruvianum中分離到的，屬于LZ-NBS-LRR家族。馬鈴薯抗線蟲基因 Gpa2、番爺?shù)目垢€ 蟲基因 Hero A和小麥抗胞囊線蟲基因 Cre3等都屬于NBS-LRR家族，只是在N端的連接序 列不同。在不同植物上克隆出來的抗根結(jié)線蟲基因大多屬于NBS-LRR家族（除了 Hslpi^1), 對Gpa2、HeroA、Mi、Cre3進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，大多具有NBS-LRR保守序列，因此可以通過同 源序列克隆抗根結(jié)線蟲基因。陳儒鋼等利用同源序列克隆的方法，分別從抗根結(jié)線蟲的番 茄和辣椒材料中克隆到抗根結(jié)線蟲基因 SlMi及CaMi，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法 把辣椒的CaMi轉(zhuǎn)入根結(jié)線蟲敏感的番茄中，獲得了抗根結(jié)線蟲的番茄轉(zhuǎn)基因株系并應(yīng)用 于育種中。張麗英等利用同源序列克隆的方法將克隆得到的SlMi基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 轉(zhuǎn)入到缺乏抗性的萵苣中，為萵苣抗根結(jié)線蟲育種、為異源基因在萵苣中的成功應(yīng)用奠定 了基礎(chǔ)。
[0003] 近年來，人們除了對番茄、辣椒直接抗根結(jié)線蟲基因克隆外，還對其相關(guān)的WRKY 基因進(jìn)行克隆。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它參與抗病反應(yīng)，同時影響植物的衰 老、抗脅迫能力以及生長和發(fā)育。在辣椒上已成功克隆6個WRKY基因。李淑敏等從辣椒中分 離到 6 個 WRKY 基因 WRKY-a、WRKY-b、WRKY-c、WRKYl、CaWRKYl 和 CaWRKY2,這 6 個 WRKY 基因 在接種根結(jié)線蟲36h后的辣椒根尖、莖、葉片中都表達(dá)，而CaWRKYl基因在根結(jié)線蟲接種36h 后的辣椒根尖、葉片中表達(dá)，在莖中不表達(dá)，這表明辣椒WRKY-b、WRKY-c、CaWRKYl和WRKYl 這4個基因在辣椒中表現(xiàn)為組成型表達(dá)，而WRKY-a、CaWRKY2基因是誘導(dǎo)型表達(dá)，CaWRKYl 基因的表達(dá)具有組織特異性。鄭井元等克隆出一個辣椒在早期應(yīng)答南方根結(jié)線蟲侵染時的 抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CaRKNIF2。實時熒光定量PCR分析表明該基因在線蟲侵染3h后表達(dá)量 即明顯上升，到12h時，表達(dá)量達(dá)到最大，表明CaRKNIF2參與了辣椒與南方根結(jié)線蟲的不親 和互作。在不同組織進(jìn)行的實時熒光定量PCR分析顯示，該基因在根尖組織中的表達(dá)量最 高，具有組織特異性，表明其在參與根尖組織的應(yīng)急反應(yīng)中具有重要功能。
[0004] 茄子在我國深受大眾喜愛，經(jīng)濟(jì)效益較高，但同時也易受根結(jié)線蟲的危害。根結(jié)線 蟲是一類寄生在植物根系，破壞植物正常生理代謝，造成植株死亡的病害。它們可以侵染很 多種經(jīng)濟(jì)作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重危害。其中，南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種，能給許多園藝 作物特別是蔬菜和果樹帶來毀滅性災(zāi)難。目前，控制根結(jié)線蟲主要是通過輪作、土壤熏蒸1 和化學(xué)藥物防治。但是，這些方法還不能完全控制根結(jié)線蟲病的發(fā)生。例如土壤熏蒸，熏蒸 劑嚴(yán)重破壞環(huán)境，并且很多熏蒸劑被限制使用。化學(xué)藥劑防治根結(jié)線蟲是不可取的，因為它 不會成為一個高效和持久的控制方法。因此，克隆和驗證抗性基因是實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因育種的一 條高效途徑。野生茄子種質(zhì)資源豐富，具有許多優(yōu)良性狀，其中托魯巴姆對根結(jié)線蟲具有較 高的抗性。因此，利用分子生物技術(shù)從托魯巴姆中克隆抗根結(jié)線蟲基因，對于了解茄子根結(jié) 線蟲病害的發(fā)生機(jī)制、抗病分子機(jī)理和抗病性育種有著非常重要的意義。
[0005] 從不同物種里克隆出70多個R基因，其中大多數(shù)抗性基因的克隆都是根據(jù) NBS-LRR保守區(qū)域設(shè)計引物，采用PCR技術(shù)從植物DNA或cDNA中擴(kuò)增得到同源片段，如咖 啡、棉花、野生稻等。NBS即核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，存在于真核生物的許多蛋白中，主要功能是負(fù) 責(zé)ATP的水解和釋放信號。NBS包含三個區(qū)域，kinase-la區(qū)、kinase_2a區(qū)、kinase_3a區(qū)。 LRR即富亮氨酸重復(fù)序列，是長度在24個氨基酸之內(nèi)的多重重復(fù)，主要功能是決定寄主與 病原的特異性識別。在園藝作物中已經(jīng)克隆的抗線蟲基因主要有甜菜抗胞囊線蟲Hsl pra' 馬鈴薯抗白線蟲Gpa2、番茄的抗根腐線蟲Hero、辣椒抗根結(jié)線蟲CaMi、番茄抗根結(jié)線蟲Mi， 其中以Mi研究最為詳細(xì)。番茄的Mi基因，它編碼一個富亮氨酸重復(fù)序列并且對根結(jié)線蟲、 蚜蟲、粉虱具有較高的抗性。Mi基因可以被轉(zhuǎn)基因表達(dá)，轉(zhuǎn)入到感病番茄和親緣關(guān)系近的物 種中對根結(jié)線蟲具有明顯抗性。但是，當(dāng)煙草和擬南芥被侵染根結(jié)線蟲后，Mi-L 2基因不 表現(xiàn)抗性。目前，利用NBS-LRR保守區(qū)域設(shè)計引物，克隆得到的同源基因片段可以與分子標(biāo) 記相結(jié)合，借助遺傳圖譜將同源基因片段定位在染色體上，找到抗病基因。Qi等通過此方法 將向日葵抗銹蝕病R4基因定位于向日葵的13號連鎖群上。前人對茄子抗根結(jié)線蟲基因的 研究較少，茄子抗根結(jié)線蟲的基因尚未被克隆。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種茄子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因，其具有Seq. ID. No. 1所示 的核苷酸序列。
[0007] 本發(fā)明另一個目的是提供一種茄子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因在茄子選育和抗根結(jié)線 蟲選育中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明根據(jù)已知抗線蟲基因 NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計引物，以野生茄托姆巴魯 cDNA為模板克隆抗性基因同源片段，并分析這些序列的相關(guān)性，利用RT-PCR技術(shù)驗證其功 能，確定抗根結(jié)線蟲基因片段；根據(jù)Mi基因序列設(shè)計兩個特異引物，采用RACE方法獲得茄 子Mi同源基因的全長序列，利用RT-PCR技術(shù)驗證其功能，為茄子抗根結(jié)線蟲分子育種奠定 初步基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1 :茄子根系RNA完整性的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（1 :根系RNA);
[0010] 圖 2 :5' 端和 3' 端 RACE PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果（1 :5' 端 RACE ;2 :3' 端 RACE);
[0011] 圖3 :重組質(zhì)粒PCR檢測結(jié)果（1 :重組質(zhì)粒的5'端PCR產(chǎn)物）；
[0012] 圖4 :重組質(zhì)粒PCR檢測結(jié)果（1 :重組質(zhì)粒的3'端PCR產(chǎn)物）；
[0013] 圖5 :根結(jié)線蟲侵染前后茄子Mi同源基因在根、莖、葉中相對表達(dá)量。

【具體實施方式】
[0014] 若未特別說明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0015] 實施例1 :
[0016] I. 1 材料
[0017] 1.1.1植物材料
[0018] 實驗材料為野生茄托魯巴姆。
[0019] I. 1. 2南方根結(jié)線蟲懸浮液
[0020] (1)取被侵染的茄子根系，洗去根表土，切成2_4mm長根放入IOOOml燒瓶中。
[0021] (2)加入200ml 0· 5% NaClO溶液于燒瓶，加蓋，攪動3-5min。
[0022] (3)立即把碎片同溶液倒入200目和500目網(wǎng)篩組，用自來水充分洗下200目網(wǎng)篩 上的卵。用自來水緩慢洗500目網(wǎng)篩內(nèi)的卵5分鐘，并集中于一處。
[0023] (4)500目網(wǎng)篩內(nèi)的線蟲收集于250ml燒杯內(nèi)，定容至100ml。
[0024] (5)用吸管取0. 5ml懸浮液移入盛有4. 5ml自來水的小燒杯內(nèi)，充分搖勻。
[0025] (6)立即取0. 5ml稀釋的懸浮液于計數(shù)皿上，用少許自來水滴入主數(shù)皿內(nèi)，使幼蟲 隨機(jī)落在計數(shù)皿底。
[0026] (7)在立體解剖鏡下計1/4計數(shù)皿底上的蟲數(shù)。
[0027] (8)從（4)步開始重復(fù)一次，兩次記錄蟲數(shù)平均數(shù)乘以80,便得到原懸浮液每毫升 所含幼蟲數(shù)目。
[0028] I. L 3 試劑盒
[0029] RNA 提取試劑盒、PrimeScript? RT reagent Kit、pMD18_T Vector 克隆試劑盒、 凝膠回收試劑盒、TakaRa SYBRl8 PreMix Ex Taq?。
[0030] 1.1.4常用儲液
[0031] X-Gal、IPTG、Amp、LB 液體培養(yǎng)基、Tris 緩沖液。
[0032] 1. 2 方法
[0033] I. 2. 1材料的準(zhǔn)備
[0034] (1)將托魯巴姆種子播種于裝有經(jīng)熱力消毒的砂壤土和粗砂土（1:1混合）的陶盆 內(nèi)，播完種子的陶盆置于20-25°C溫室工作臺上，培養(yǎng)42天，2-4真葉期進(jìn)行接種。將南方 根結(jié)線蟲懸浮液（1000個/L)貼近植株倒入5ml于每盆中。
[0035] (2)分別取未接種前植株的葉片、莖段、根系和接種后6h、12h、24h植株的葉片、莖 段、根系，經(jīng)過液氮冷凍，-80°C保存。
[0036] 1. 2. 2總RNA提取與cDNA的合成
[0037] 以托魯巴姆的嫩葉為材料，提取托魯巴姆總RNA，總RNA的提取參照RNA提取試劑 盒說明書上的操作步驟，cDNA的合成參照PrimeScript? RT reagent Kit說明書上的操作 步驟，分裝后直接用于PCR或置于-20°C冰箱保存。
[0038] (1)用液氮研磨適量的茄子葉片，并將磨好的樣品移至2ml離心管中，裝至2/3就 可以。離心管一定提前用液氮預(yù)冷，操作要快，避免樣品反復(fù)凍融；
[0039] (2)吸取Iml TakaRa RNAiso Reagent試劑加入樣品中，槍頭不能碰到離心管和樣 品，蓋上離心管蓋，并搖晃使混勻，靜置5Min ;
[0040] (3) 12000r/Min4°C離心5Min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的I. 5ml離心管中；
[0041] (4)加入上清液體積1/5的氯仿，充分搖晃混勻呈浮濁色，靜置5Min，12000r/ Min4°C 離心 5Min ;
[0042] (5)吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管中，切忌吸出白色中間層，加入 500ul氯仿混勻搖晃，靜置5Min ;
[0043] (6) 12000r/Min4°C離心5Min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的I. 5ml離心管中；
[0044] (7)加入與上清等體積的異丙醇，室溫靜置lOMin，12000r/Min4°C離心lOMin，試 管底部出現(xiàn)沉淀；
[0045] (8)小心棄去上清，盡量將上清去除干凈，可將離心管蓋子打開倒置于干凈的紙 上，緩慢沿離心管壁加入lml75%乙醇，輕輕上下顛倒幾下，洗滌沉淀；
[0046] (9) 12000r/Min4°C離心5Min，小心棄去乙醇上清液，也需倒置，室溫干燥沉淀 2-5Min，加入適量DEPC水，溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待沉淀完全溶解后 于-80°C保存。
[0047] 利用核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，并保證A260/A280和A260/A230的值不小于 1.8。使用 TakaRa PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0048] 按下列組分配制RT反應(yīng)液（反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行）：
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種茄子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因，其具有Seq. ID. No. 1所示的核苷酸序列。
2. -種載體，其特征在于含有上述基因。
3. 一種爺子抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因在爺子選育和抗根結(jié)線蟲爺子選育中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313035SQ201410554602
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】楊旭, 成玉富, 張宇, 翁偉 申請人:揚(yáng)州大學(xué)