用于治療的una寡聚體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于治療的UNA寡聚體。具體而言，本發(fā)明涉及RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸的復(fù)合物，其含有至少一個(gè)羥甲基取代的核苷酸單體。羥甲基取代的核苷酸單體理解為含有羥甲基基團(tuán)的核苷酸單體。該羥甲基基團(tuán)不參與形成核苷酸間鍵合且不是天然RNA單體的羥甲基基團(tuán)。該復(fù)合物包括能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的短干擾RNA復(fù)合物。這些鏈中至少一條被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的羥甲基取代的核苷酸單體修飾，所述核苷酸單體可位于3’-末端、5’-末端或內(nèi)部。本發(fā)明的RNA復(fù)合物還可為以至少一個(gè)羥甲基取代的核苷酸單體修飾的單鏈RNA寡核苷酸。本發(fā)明的復(fù)合物相對(duì)于包括完全天然RNA單體的相應(yīng)復(fù)合物展示對(duì)溶核降解增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
【專利說(shuō)明】用于治療的UNA寡聚體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00880016977. 5,申請(qǐng)日為2008年05月21日，發(fā)明名稱為"羥 甲基取代的RNA寡核苷酸和RNA復(fù)合物"的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 序列表
[0003] 本申請(qǐng)包括序列表，其經(jīng)由EFS-Web以2009年11月2日創(chuàng)建的名為MD0807PC. txt的ASCII文件提交，大小是30, 642字節(jié)，據(jù)此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。

【背景技術(shù)】
[0004] RNA干擾（RNAi)近年吸引了大量注意，因?yàn)樗峁┏聊谢虮磉_(dá)的手段。它為 基礎(chǔ)研究提供研究遺傳和生化途徑、和單獨(dú)基因和基因產(chǎn)物功能的方法。因此，RNA干擾已 成為在制藥行業(yè)中驗(yàn)證靶的關(guān)鍵工具。而且，本著開(kāi)發(fā)可用作藥物的能夠介導(dǎo)RNA干擾復(fù) 合物的RNA復(fù)合物的目標(biāo)，已進(jìn)行了大量的研究。
[0005] RNAi用于治療的吸引力在于其敏感性和序列特異性。然而，已經(jīng)產(chǎn)生了關(guān)于序列 特異性的擔(dān)憂，如由于RNA復(fù)合物的錯(cuò)誤鏈可能指導(dǎo)對(duì)錯(cuò)誤的靶核酸響應(yīng)。而且，某種大小 的RNA復(fù)合物誘導(dǎo)非特異性干擾素依賴性響應(yīng)，這也是不期望的。
[0006] 專利申請(qǐng)US2003/0108923描述能夠介導(dǎo)RNAi的包含反義鏈和信使鏈的RNA復(fù)合 物，其中各鏈長(zhǎng)度是21-23個(gè)核苷酸。提議將該RNA復(fù)合物用于治療應(yīng)用。
[0007] 類似地，專利申請(qǐng)US2005/0234007描述能夠介導(dǎo)RNAi的包含反義鏈和信使鏈的 RNA復(fù)合物，其中復(fù)合物包括3' -懸端（3' -overhang)。提議將該RNA復(fù)合物用于治療應(yīng) 用。
[0008] W02005/073378描述含有化學(xué)修飾的核苷酸、能夠介導(dǎo)RNAi、包含反義鏈和信使 鏈的RNAi復(fù)合物。該說(shuō)明書中所述的RNA復(fù)合物包括LNA殘基，且指出在靠近一條鏈5' 末端處并入LNA殘基可控制哪條鏈并入RISC復(fù)合物，因?yàn)樵?-末端形成最弱堿基對(duì)的鏈 并入RISC復(fù)合物。
[0009] RNAi只是使用包括本發(fā)明的RNA復(fù)合物的寡核苷酸介導(dǎo)基因表達(dá)抑制的許多策 略之一。包括RNA酶H介導(dǎo)的RNA裂解、立體封閉RNA結(jié)合、DNA酶或核酶介導(dǎo)的RNA裂解 和siRNA方法的這些不同策略已連同與生物活性相容的所選的化學(xué)修飾的核苷酸的性質(zhì) 描述于文獻(xiàn)中[J. Kurreck, Eur. J. Biochem. 2003, 270, 1628]。
[0010] 本發(fā)明的羥甲基取代的單體B-E已經(jīng)被并入DNA鏈，且因此已報(bào)道制備其 用于自動(dòng)DNA/RNA合成的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的程序[K. D. Nielsen等人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3,1493 ;H.Thrane 等人，Tetrahedron 1995, 51，10389 ;P. Nielsen 等 人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]。已被并入DNA鏈的胸腺嘧啶單體是獨(dú)有的。這些羥甲 基取代的單體此前都還未被并入RNA鏈。
[0011] 在一項(xiàng)報(bào)道中，一個(gè)或兩個(gè)2' -開(kāi)環(huán)尿苷被并入DNA寡核苷酸并觀察到對(duì)RNA酶 H介導(dǎo)的 RNA 降解的積極效應(yīng)（Mangos MM，Min KL，Viazovkina E，Galarneau A, Elzagheid MI, Parniak MA, Damha MJ.，J Am Chem Soc. 2003Jan 22 ; 125 (3):654-61.)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供具有并入RNA鏈的一個(gè)或多個(gè)羥甲基取代的單體、將在關(guān)于RNA-引導(dǎo) 的基因調(diào)節(jié)或基因分析、尤其是RNA干擾的情況下使用的RNA復(fù)合物。因此，本發(fā)明的一個(gè) 目的是提供與通常使用的RNA復(fù)合物相比具有減少的脫靶效應(yīng)的RNA復(fù)合物。另一目的是 提供誘導(dǎo)減少的干擾素應(yīng)答的RNA復(fù)合物。又另一目的是提供在細(xì)胞培養(yǎng)物中或體內(nèi)關(guān)于 對(duì)酶促降解的穩(wěn)定性具有改善特性的RNA復(fù)合物。又另一目的是提供相對(duì)于未修飾的RNA 復(fù)合物，在細(xì)胞培養(yǎng)物中或體內(nèi)展示增強(qiáng)的基因調(diào)節(jié)功能如基因沉默效應(yīng)的RNA復(fù)合物。 又另一目的是提供靶向特定器官或組織并能夠穿透細(xì)胞膜的RNA復(fù)合物。本發(fā)明還提供適 于將羥甲基取代的單體并入寡核苷酸的單體和其合成方法。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1 :顯示并入RNA復(fù)合物的羥甲基取代的核苷酸的不同構(gòu)造的示例。為了比較 顯示單體A，其是具有其核糖支架的天然RNA單體。包括在本發(fā)明的RNA復(fù)合物中的單體 B-E的特征是其包含為羥甲基基團(tuán)（"自由羥甲基基團(tuán)"）的取代基，且因此本發(fā)明題為"羥 甲基取代的RNA寡核苷酸和RNA復(fù)合物"。自由羥甲基基團(tuán)例如連接在環(huán)狀核糖支架的C4' 原子或基于無(wú)環(huán)的核糖的支架的C1'原子。本發(fā)明的羥甲基取代的核苷酸含有各自連接于 磷原子并因此參與形成核苷酸間鍵合的其它氧原子（參見(jiàn)圖1)。這些其它氧原子中的一個(gè) 或多個(gè)可為羥基基團(tuán)的一部分，這是當(dāng)本發(fā)明的RNA復(fù)合物的羥甲基取代的核苷酸中的一 個(gè)或多個(gè)位于RNA鏈的3' -或5' -末端時(shí)的情形。當(dāng)本發(fā)明的RNA復(fù)合物的羥甲基取代的 核苷酸中的一個(gè)位于RNA鏈的3' -末端和/或5' -末端時(shí)，該單體的輕基基團(tuán)可被磷酸化， 如對(duì)任何位于末端的天然RNA單體的情形一樣。向本發(fā)明的羥甲基取代的核苷酸連接核堿 基如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤或任何其它已知的天然或合 成的核堿基或核堿基類似物（圖1中標(biāo)為"堿基"）。
[0014] 圖2 :顯示羥甲基取代的單體的衍生化、官能化和共軛變體。作為實(shí)例顯示羥甲基 取代的2'，3' -開(kāi)環(huán)-RNA單體D的衍生化、官能化和共軛變體（參見(jiàn)圖1)。單體F含有經(jīng) 由醚鍵合連接的基團(tuán)R。單體G含有經(jīng)由硫醚鍵合連接的基團(tuán)R。單體H含有經(jīng)由酰胺鍵 合連接的基團(tuán)R。單體I含有經(jīng)由氨基鍵合連接的基團(tuán)R。單體J含有經(jīng)由哌嗪基單元連 接的基團(tuán)R。通過(guò)將這種單體中的一個(gè)或若干個(gè)并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物，可調(diào)節(jié)RNA復(fù)合 物的特性。例如可引入增加的生物穩(wěn)定性、增加的RNA靶向能力或特異性遞送特性、并為了 檢測(cè)目的可連接熒光基團(tuán)。
[0015] 圖3 :兩個(gè)羥甲基取代的單體（單體C和單體D)的結(jié)構(gòu)，它們可為寡核苷酸或RNA 復(fù)合物的單體。
[0016] 圖4 :含有"單體X"（即2'，3' -開(kāi)環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基 因沉默結(jié)果。結(jié)果以含有具有尿嘧啶作為核堿基的單體D(顯示為W130有義鏈中的'X'） 的W130有義鏈（參見(jiàn)圖4的核苷酸序列）獲得。用于本研究的反義鏈的核酸序列列在該 圖下部（反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。具有上標(biāo)"L"的單 體代表鎖核酸（例如，f表示胸腺嘧啶鎖核酸或LNA)。圖4按出現(xiàn)的順序分別公開(kāi)了 SEQ ID NO:44-52。
[0017] 圖5 :含有"單體X"（即2'，3' -開(kāi)環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基 因沉默結(jié)果。結(jié)果以含有具有尿嘧啶作為核堿基的單體D(顯示為W131有義鏈中的'X'） 的W131有義鏈（參見(jiàn)圖5的核苷酸序列）獲得。用于本研究的反義鏈的核酸序列列在圖 4下部（反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。圖5公開(kāi)了 SEQ ID N0:53。
[0018] 圖6 :含有"單體X"（即2'，3' -開(kāi)環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基 因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以含有具有胞嘧啶（sC，從W282序列5'-末端的第一個(gè)X)、腺嘌呤 (sA，從W282序列5' -末端的第二個(gè)X)和胞嘧啶（sC，從W282序列3' -末端的最后一個(gè)X) 作為核堿基的單體D的W282有義鏈（參見(jiàn)圖6的核苷酸序列）獲得。用于本研究的反義 鏈的核酸序列列在圖4下部（反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。 圖 6 公開(kāi)了 SEQ ID NO: 11。
[0019] 圖7 :含有"單體X"（即2'，3' -開(kāi)環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基 因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以W194有義鏈（參見(jiàn)圖7的核苷酸序列）獲得。用于本研究的反義 鏈的核酸序列列在圖4下部（反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。 具有上標(biāo)"L"的單體代表鎖核酸（例如，1^表示胸腺嘧啶鎖核酸或LNA)。圖7公開(kāi)了 SEQ ID N0:55。
[0020] 圖8 :含有"單體X"（即2'，3' -開(kāi)環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基 因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以W181有義鏈（參見(jiàn)圖8的核苷酸序列）獲得。用于本研究的反義 鏈的核酸序列列在圖4下部（反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。 具有上標(biāo)"L"的單體代表鎖核酸（例如，1^表示胸腺嘧啶鎖核酸或LNA)。圖8公開(kāi)了 SEQ ID N0:56。
[0021] 圖9 :含有"單體X"（即2'，3' -開(kāi)環(huán)-RNA單體D)的本發(fā)明的siRNA復(fù)合物的基 因沉默結(jié)果。這些結(jié)果以含有具有尿嘧啶作為核堿基的單體D (顯示為W129有義鏈中的 'X'）的W129有義鏈（參見(jiàn)圖9的核苷酸序列）獲得。本研究中包括的反義鏈列在圖4下 部（反義序列中所有X單體是具有尿嘧啶作為核堿基的單體D)。具有上標(biāo)"L"的單體代表 鎖核酸（例如，T l表示胸腺嘧啶鎖核酸或LNA)。圖9公開(kāi)了 SEQ ID NO: 57。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 在本發(fā)明一方面描述的具體特征也適用于本發(fā)明的其它方面。例如，在適當(dāng)時(shí)，關(guān) 于第一方面的RNA復(fù)合物描述的特征也適用于第九方面的寡核苷酸和第十方面的RNA雙鏈 體。
[0023] 第一方面，RNA復(fù)合物
[0024] siRNA雙鏈體或單鏈RNA形式的RNA復(fù)合物可介導(dǎo)細(xì)胞中對(duì)靶核酸的各種修飾。 這個(gè)過(guò)程中，復(fù)合物的反義鏈作為向?qū)?，因?yàn)榉戳x鏈可雜交于具有與該反義鏈互補(bǔ)的序列 段的靶核酸。
[0025] 靶向靶核酸之前，反義鏈通常被并入RNA引導(dǎo)的蛋白復(fù)合物（RGPC)，這可對(duì)靶核 酸起作用。RNA引導(dǎo)的蛋白復(fù)合物的一個(gè)實(shí)例是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC)。認(rèn)為存在 其它這種RGPC且本發(fā)明的RNA復(fù)合物將也有益處，當(dāng)與這些其它RGPC -起使用或甚至不 與任何RGPC相互作用時(shí)。
[0026] 本發(fā)明的一個(gè)目的是使RNA復(fù)合物對(duì)生物介質(zhì)（血清、體內(nèi)、細(xì)胞培養(yǎng)物中）中的 溶核降解穩(wěn)定。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是改善雙鏈RNA復(fù)合物的基因沉默效應(yīng)。該改善可例如涉及 增加的效力、減少的脫靶效應(yīng)、減少的免疫刺激、增加的儲(chǔ)存穩(wěn)定性、在生物介質(zhì)如血清等 中增加的穩(wěn)定性、增加的作用持續(xù)時(shí)間和改善的藥代動(dòng)力學(xué)特征，所有這些均是相對(duì)于天 然未修飾的RNA復(fù)合物而言。
[0028] 本發(fā)明的又另一個(gè)目的是改善單鏈RNA寡核苷酸的基因沉默效應(yīng)。該改善可例如 涉及增加的效力、減少的脫靶效應(yīng)、減少的免疫刺激、增加的儲(chǔ)存穩(wěn)定性、在生物介質(zhì)如血 清等中增加的穩(wěn)定性、增加的作用持續(xù)時(shí)間和改善的藥代動(dòng)力學(xué)特征，所有這些均是相對(duì) 于天然未修飾的RNA復(fù)合物而言。
[0029] 本發(fā)明的一個(gè)目的是確保只有本發(fā)明SiRNA復(fù)合物的反義鏈而不是信使鏈將介 導(dǎo)對(duì)靶核酸的修飾。這一目的的實(shí)現(xiàn)將提供具有較少脫靶效應(yīng)的RNA復(fù)合物。
[0030] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是確保RNA復(fù)合物在生物介質(zhì)中的足夠的穩(wěn)定性。因此一個(gè) 目的是提供相對(duì)于未修飾的RNA復(fù)合物，在細(xì)胞培養(yǎng)物中或體內(nèi)展示增強(qiáng)的基因調(diào)節(jié)功能 如基因沉默效應(yīng)的RNA復(fù)合物。
[0031] 本發(fā)明的基本理念是將一個(gè)或多個(gè)羥甲基取代的單體并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物。 在siRNA的情況中，這可導(dǎo)致優(yōu)先將復(fù)合物的僅一條鏈并入RISC。將一個(gè)或多個(gè)羥甲基取 代的單體并入RNA復(fù)合物的一條（或多條）RNA鏈將改善RNA復(fù)合物在生物介質(zhì)中和體內(nèi) 的壽命，并因此將導(dǎo)致改善的生物活性，例如改善的基因調(diào)節(jié)活性。
[0032] 本發(fā)明RNA復(fù)合物的RNA鏈可包括天然的RNA核苷酸、已知與基因沉默活性相容 的 RNA 修飾[Nawrot 和 Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925]和羥甲基取代的 單體（圖1)。磷酸二酯鍵合（Phosphordiester linkage)可連接單獨(dú)單體，但可改為使用 修飾的鍵合如硫代磷酸酯鍵合和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它鍵合[Nawrot和Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925]。RNA復(fù)合物可包括兩條鏈，它們一起構(gòu)成包括反義鏈 (反義鏈本文中也稱為引導(dǎo)鏈）和信使鏈（信使鏈本文中也稱為有義鏈）的siRNA雙鏈體， 但單鏈微RNA模擬分子在本文也被認(rèn)為是本發(fā)明的RNA復(fù)合物，如例如可用于靶向微RNA 的單鏈反義分子。
[0033] 在本發(fā)明實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物包括一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單體（參 見(jiàn)圖1)。依此作為一個(gè)這種實(shí)例的是無(wú)環(huán)的核苷酸單體，更優(yōu)選地選自單體D-J組成的組 的無(wú)環(huán)的單體。因此，在第一方面關(guān)于羥甲基修飾的核苷酸單體所述的實(shí)施方案將適用于 關(guān)于無(wú)環(huán)的核苷酸單體的其它實(shí)施方案。
[0034] 出于多種原因，使用羥甲基修飾的核苷酸單體可為有利的。羥甲基修飾的核苷酸 單體可例如用于增加 RNA復(fù)合物的基因沉默效應(yīng)，且將一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單 體并入例如RNA復(fù)合物末端誘導(dǎo)對(duì)溶核降解的顯著穩(wěn)定性。羥甲基修飾的核苷酸單體還可 用于減少siRNA復(fù)合物信使鏈的基因沉默效應(yīng)，從而減少脫靶效應(yīng)的數(shù)目。
[0035] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單體的 RNA復(fù)合物是單鏈RNA構(gòu)建體。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單體的 RNA復(fù)合物是能夠通過(guò)作為單鏈反義分子抑制基因表達(dá)的單鏈RNA構(gòu)建體。
[0037] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單體的 RNA復(fù)合物是功能上模擬微RNA的單鏈RNA構(gòu)建體。
[0038] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單體的 RNA復(fù)合物是siRNA構(gòu)建體。
[0039] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA構(gòu)建體的反義鏈包括一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核 苷酸單體。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，SiRNA構(gòu)建體的信使鏈包括一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷 酸單體。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA構(gòu)建體的帶切口的信使鏈的第一和第二RNA分子 各含有一個(gè)或多個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單體。
[0041] 在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，反義鏈中羥甲基修飾的核苷酸單體的數(shù)目是10。在本 發(fā)明其它實(shí)施方案中，反義鏈中羥甲基修飾的核苷酸單體的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2 或1。
[0042] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義鏈的所有核苷酸是羥甲基修飾的核苷酸單體。
[0043] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義鏈中所有羥甲基修飾的核苷酸單體存在于位置1-8,其中 位置從5'末端計(jì)數(shù)。甚至更優(yōu)選地，反義鏈中羥甲基修飾的核苷酸單體存在于對(duì)應(yīng)于微 RNA的所謂種子區(qū)（seed region)的位置2-7。因此，在前述區(qū)域中存在羥甲基修飾的核苷 酸單體將阻止反義鏈作為微RNA起作用，這減少當(dāng)反義鏈意為作為siRNA起作用時(shí)的脫靶 效應(yīng)。
[0044] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)輕甲基修飾的核苷酸單體存在于位置9-16之一，其 中位置從5'末端計(jì)數(shù)。甚至更優(yōu)選地是，2、3、4、5或6個(gè)羥甲基修飾的核苷酸單體存在于 位置9-16,且在另一實(shí)施方案中，反義鏈中的羥甲基修飾的核苷酸單體存在于位置9-16的 所有位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，輕甲基修飾的核苷酸單體僅存在于區(qū)域9-16且不存在于反 義鏈的其余部分。
[0045] 甚至更優(yōu)選地，反義鏈中羥甲基修飾的核苷酸單體存在于位置9-11，且優(yōu)選地不 存在于寡核苷酸的其余部分。在前述區(qū)域中存在羥甲基修飾的核苷酸單體將誘導(dǎo)反義鏈作 為微RNA起作用，即確保siRNA效應(yīng)將最小且微RNA效應(yīng)更高。該效應(yīng)可能來(lái)自于因存在 無(wú)環(huán)的羥甲基取代的單體例如單體D導(dǎo)致親和力減少而向全長(zhǎng)結(jié)合的趨勢(shì)的減少。
[0046] 類似地，在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈中羥甲基修飾的 核苷酸單體的數(shù)目是10。在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈中羥甲基 修飾的核苷酸單體的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。
[0047] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的所有核苷酸是羥甲基修飾的 核苷酸單體。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈和信使鏈含有一個(gè)或多個(gè)羥甲 基修飾的核苷酸單體。
[0049] -方面，本發(fā)明提供能夠介導(dǎo)對(duì)靶核酸的核酸修飾的RNA復(fù)合物。這種RNA復(fù)合 物可例如為siRNA、微RNA或微RNA前體（前-微RNA，pre-microRNA)。
[0050] 本發(fā)明siRNA復(fù)合物的RNA復(fù)合物包括含有反義鏈和雜交于反義鏈的信使鏈的核 心雙鏈區(qū)。
[0051] 本文上下文中所指的靶核酸是對(duì)復(fù)合物反義鏈具有顯著的互補(bǔ)性的核酸。優(yōu)選 地，互補(bǔ)性對(duì)若干個(gè)核苷酸的段是完全的。
[0052] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，互補(bǔ)性對(duì)25個(gè)核苷酸的段是完全的。
[0053] 在其它實(shí)施方案中，互補(bǔ)性分別對(duì)24個(gè)核苷酸、23個(gè)核苷酸、22個(gè)核苷酸、21個(gè) 核苷酸、20個(gè)核苷酸、19個(gè)核苷酸、18個(gè)核苷酸、17個(gè)核苷酸、16個(gè)核苷酸、15個(gè)核苷酸、14 個(gè)核苷酸、13個(gè)核苷酸、12個(gè)核苷酸、11個(gè)核苷酸、10個(gè)核苷酸、9個(gè)核苷酸、8個(gè)核苷酸、7 個(gè)核苷酸或6個(gè)核苷酸的段是完全的。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，互補(bǔ)性段包括1個(gè)錯(cuò)配。在其它實(shí)施方案中，互補(bǔ)性段分別包 括2個(gè)錯(cuò)配、3個(gè)錯(cuò)配或4個(gè)錯(cuò)配。1個(gè)錯(cuò)配是互補(bǔ)性段中的一個(gè)區(qū)域，其中不能形成堿基 對(duì)，例如當(dāng)G面對(duì)A時(shí)。當(dāng)存在更多錯(cuò)配時(shí)，它們可能彼此相鄰或它們可在互補(bǔ)性段的不同 區(qū)域中間隔開(kāi)。
[0055] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的RNA復(fù)合物包括核心雙鏈區(qū)，其是大致 雙鏈的區(qū)。RNA復(fù)合物中的單鏈區(qū)主要與復(fù)合物的懸端相關(guān)。
[0056] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的雙鏈區(qū)包括1個(gè)錯(cuò)配。在其它實(shí) 施方案中，雙鏈區(qū)分別包括2個(gè)錯(cuò)配、3個(gè)錯(cuò)配和4個(gè)錯(cuò)配。
[0057] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"靶核酸"包涵將經(jīng)受反義鏈引導(dǎo)的調(diào)節(jié)諸如靶向裂解或空間阻 塞（steric blockage)的任何RNA/DNA。靶RNA/DNA可例如是基因組DNA、基因組病毒RNA、 mRNA、前-mRNA或非編碼RNA。
[0058] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"靶核酸修飾"是指對(duì)靶核酸的任何修飾，包括影響靶核酸活性而 不影響靶核酸結(jié)構(gòu)的修飾。
[0059] 本發(fā)明優(yōu)選的靶核酸是mRNA。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物介導(dǎo)的核酸修 飾是RNA干擾（RNAi)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，RNAi介導(dǎo)mRNA的降解。在另一優(yōu)選實(shí)施方案 中，RNAi介導(dǎo)mRNA的翻譯抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNAi介導(dǎo)mRNA的翻譯抑制和降解。
[0060] 在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，靶核酸是非編碼RNA，例如tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA或 rRNA〇
[0061] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸是基因組DNA。在這種實(shí)施方案中，優(yōu)選的核酸修飾 包括DNA甲基化和DNA缺失。
[0062] 本發(fā)明RNA復(fù)合物的大小可改變而仍實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)目的。這在例如當(dāng) 具體目的是減少的脫靶效應(yīng)時(shí)適用。
[0063] 因此，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)可包括選自下組的許多堿基對(duì)：10個(gè)堿 基對(duì)、11個(gè)堿基對(duì)、12個(gè)堿基對(duì)、13個(gè)堿基對(duì)、14個(gè)堿基對(duì)、15個(gè)堿基對(duì)、16個(gè)堿基對(duì)、17個(gè) 堿基對(duì)、18個(gè)堿基對(duì)、19個(gè)堿基對(duì)、20個(gè)堿基對(duì)、21個(gè)堿基對(duì)、22個(gè)堿基對(duì)、23個(gè)堿基對(duì)、24 個(gè)堿基對(duì)和25個(gè)堿基對(duì)、26個(gè)堿基對(duì)、27個(gè)堿基對(duì)、28個(gè)堿基對(duì)、29個(gè)堿基對(duì)、30個(gè)堿基 對(duì)、35個(gè)堿基對(duì)、40個(gè)堿基對(duì)、42個(gè)堿基對(duì)、45個(gè)堿基對(duì)、50個(gè)堿基對(duì)、55個(gè)堿基對(duì)、60個(gè)堿 基對(duì)或62個(gè)堿基對(duì)。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)包括15至40個(gè)堿基對(duì)。
[0065] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)包括18-22個(gè)堿基對(duì)。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)甚至長(zhǎng)于40個(gè)堿基對(duì)，盡 管知道在一些細(xì)胞引入較長(zhǎng)雙鏈RNA復(fù)合物可誘導(dǎo)干擾素依賴性非特異性應(yīng)答。在一個(gè)這 種實(shí)施方案中，預(yù)期復(fù)合物與RGPC接合之前被加工為較短的雙鏈RNA復(fù)合物。RNA酶III 樣酶諸如切丁酶（Dicer)可進(jìn)行加工。切丁酶還加工短于40個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA，且這種 RNA復(fù)合物（稱為切丁酶底物）與不經(jīng)加工進(jìn)入RISC的siRNA相比具有多種益處。因此在 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物是切丁酶底物。
[0067] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物是單鏈，并且沒(méi)有雙鏈區(qū)。
[0068] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物是單鏈但折疊以使其含有一個(gè)或多個(gè)雙鏈區(qū)。 這種實(shí)施方案可用于例如模擬微RNA和其功能。
[0069] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)短于10個(gè)堿基對(duì)且因 此包括一到九個(gè)堿基對(duì)。
[0070] 在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)被多于兩條RNA鏈包括。
[0071] 在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)被三條RNA鏈包括。
[0072] 在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)被四條或更多RNA鏈包括。
[0073] 在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物包括懸端。本文上下文中所用的 懸端是指跟隨雙鏈區(qū)之后的短單鏈區(qū)。
[0074] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈包括3' -懸端。
[0075] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈包括3' -懸端。
[0076] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈包括5' -懸端。
[0077] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈包括5' -懸端。
[0078] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈和信使鏈都包括3' -懸端。
[0079] 本發(fā)明siRNA復(fù)合物的懸端可為不同長(zhǎng)度，而不干擾復(fù)合物的基本功能。因此在 一實(shí)施方案中，懸端選自長(zhǎng)度為1個(gè)核苷酸、2個(gè)核苷酸、3個(gè)核苷酸、4個(gè)核苷酸、5個(gè)核苷 酸、6個(gè)核苷酸、7個(gè)核苷酸和8個(gè)核苷酸的懸端的組。
[0080] 本發(fā)明siRNA復(fù)合物的最優(yōu)選的懸端是長(zhǎng)度分別為1、2和3個(gè)核苷酸的懸端。
[0081] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明SiRNA復(fù)合物的反義鏈的懸端具有與信使鏈懸端相同 的長(zhǎng)度。
[0082] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈的懸端不具有與信使鏈懸端 相同的長(zhǎng)度。
[0083] 在本發(fā)明siRNA復(fù)合物的又另一實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物包括至少一個(gè)平端。"平 端"是指雙鏈核酸不具有任何突出的核苷酸的末端，即雙鏈核酸的兩條鏈在相同位置終止。
[0084] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物在兩個(gè)末端均是平端的。
[0085] 本發(fā)明的優(yōu)選RNA復(fù)合物總體結(jié)構(gòu)上類似于切丁酶加工較長(zhǎng)的雙鏈RNA復(fù)合物的 產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物是如上述的切丁酶底物。
[0086] 本發(fā)明的其它優(yōu)選的RNA復(fù)合物是其中核心雙鏈區(qū)包括18-22個(gè)堿基對(duì)，且其中 反義鏈和信使鏈各包括1-3個(gè)核苷酸的3' -懸端的復(fù)合物。
[0087] 本發(fā)明RNA復(fù)合物的反義鏈可具有不同長(zhǎng)度，而不干擾復(fù)合物的功能。因此在 優(yōu)選實(shí)施方案中，反義鏈分別是 8-mer、9_mer、l〇-mer、ll-mer、12-mer、13-mer、14-mer、 15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、2〇-mer、21-mer、22-mer、23-mer、24-mer、25-mer、 26-mer、27-mer、28-mer、29-mer、30-mer、31-mer、32-mer、33-mer、34-mer、35-mer、36-mer、 37-mer、38-mer、39-mer、40-mer、41-mer、42-mer、43-mer、44-mer、45-mer、46-mer、47-mer、 48-mer、49-mer、5〇-mer、51-mer、52-mer、53-mer、54-mer、55-mer、56-mer、57-mer、58-mer、 59-mer、6〇-mer、61-mer或62-mer。應(yīng)理解，例如19-mer是19個(gè)單體即19個(gè)核苷酸的反 義鏈。
[0088] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物的反義鏈選自下組反義鏈：15-mer、16-mer、 17-mer、18-mer、19-mer、2〇-mer、21-mer、22-mer 和 23-mer。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明 siRNA 復(fù)合物的信使鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。在本發(fā)明siRNA復(fù)合物的一實(shí)施方案中，信使鏈包括若干個(gè) 分開(kāi)的RNA分子。RNA分子的數(shù)目可為1、2、3、4、5或6。
[0089] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的單獨(dú)RNA分子的長(zhǎng)度是多于4 個(gè)單體。在其它實(shí)施方案中，信使鏈的單獨(dú)RNA分子的長(zhǎng)度分別是多于5個(gè)單體、6個(gè)單體、 7個(gè)單體、8個(gè)單體、9個(gè)單體、10個(gè)單體、11個(gè)單體和12個(gè)單體。
[0090] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的單獨(dú)RNA分子的長(zhǎng)度分別是低 于5個(gè)單體、6個(gè)單體、7個(gè)單體、8個(gè)單體、9個(gè)單體、10個(gè)單體、11個(gè)單體和12個(gè)單體。
[0091] 在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明SiRNA復(fù)合物的不連續(xù)的信使鏈包括第一和第 二RNA分子，它們一起形成不連續(xù)的信使鏈，其中第一 RNA分子雜交于反義鏈的下游部分， 而第二RNA分子雜交于反義鏈的上游部分。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。反義鏈的優(yōu)選的 不連續(xù)性與信使鏈的優(yōu)選的不連續(xù)性相同。
[0093] 本發(fā)明siRNA復(fù)合物的一條鏈的不連續(xù)性可以是切口。切口應(yīng)理解為雙鏈核酸的 一條鏈中因缺少磷酸二酯鍵但雙鏈核酸卻沒(méi)有缺少核苷酸而導(dǎo)致的不連續(xù)性。因此，面對(duì) 切口的堿基仍將雜交于帶切口的鏈上的堿基。
[0094] 本發(fā)明siRNA復(fù)合物的一條鏈的另一種不連續(xù)性是可選的切口，這理解為雙鏈核 酸的一條鏈中因糖-磷酸酯主鏈上缺少除了磷酸二酯鍵以外的一個(gè)鍵或多于一個(gè)鍵但雙 鏈核酸卻沒(méi)有缺少核堿基而導(dǎo)致的不連續(xù)性。因此，面對(duì)切口的堿基仍可雜交于帶切口的 鏈上的喊基。
[0095] 當(dāng)本發(fā)明RNA復(fù)合物的RNA鏈可被描述為具有其中雙鏈核酸中缺少至少一個(gè)核苷 酸或核苷或核堿基的不連續(xù)性時(shí)，缺口用作命名。
[0096] 優(yōu)選地，RNA復(fù)合物的5' -末端是磷酸化的或可用于磷酸化?？捎糜诹姿峄侵?5' -羥基基團(tuán)還未被例如通過(guò)直接共軛或通過(guò)與接近5' -羥基基團(tuán)的其它基團(tuán)的其它共軛 封閉，這種封閉將阻止5' -羥基基團(tuán)被磷酸化。
[0097] 因此在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物的RNA分子包括5'-末端磷酸酯和 3'-羥基基團(tuán)。
[0098] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的第二RNA分子包括5' -末端磷酸酯 和3'-羥基基團(tuán)。
[0099] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，反義鏈包括5' -末端磷酸酯和3' -羥基基團(tuán)。
[0100] 在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物包括輕甲基修飾的核苷酸以外的核苷酸類 似物是優(yōu)選的。這種羥甲基修飾的核苷酸以外的核苷酸類似物以下稱為"另外修飾的核苷 酸"。
[0101] 出于多種原因，另外修飾的核苷酸的使用可為有利的。它們可例如用于增加本發(fā) 明siRNA復(fù)合物的核心雙鏈區(qū)的解鏈溫度。
[0102] 另外修飾的核苷酸的使用可有利于增加反義鏈和靶核酸之間形成的雙鏈結(jié)構(gòu)的 解鏈溫度。
[0103] 因此在一個(gè)實(shí)施方案中，反義鏈包括另外修飾的核苷酸。
[0104] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明SiRNA復(fù)合物的信使鏈包括另外修飾的核苷酸。
[0105] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的信使鏈的第一和第二RNA分子各 含有另外修飾的核苷酸。
[0106] 在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物中另外修飾的核苷酸的數(shù)目是10。在本發(fā) 明其它實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物中核苷酸類似物的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。
[0107] 在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，反義鏈中另外修飾的核苷酸的數(shù)目是10。在本發(fā)明其 它實(shí)施方案中，反義鏈中核苷酸類似物的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、4、3、2或1。
[0108] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義鏈的所有核苷酸是另外修飾的核苷酸或是另外修飾的 核苷酸與羥甲基取代的核苷酸的組合。
[0109] 類似地，在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，本發(fā)明SiRNA復(fù)合物信使鏈中核苷酸類似物 的數(shù)目是10。在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，信使鏈中核苷酸類似物的數(shù)目分別是9、8、7、6、5、 4、3、2 或 1。
[0110] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物信使鏈的所有核苷酸是核苷酸類似物 或是另外修飾的核苷酸與羥甲基取代的核苷酸的組合。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA復(fù)合物的反義鏈和信使鏈都含有另外修飾的核 苷酸。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物的另外修飾的核苷酸是相同的，即它們例如都是 LNA或都是2' -Ο-Me-RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，各種不同的另外修飾的核苷酸用于同一 RNA復(fù)合物中。
[0113] 在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物包括硫代磷酸酯鍵（或稱為硫代磷酸酯鍵合， phosphorothioate linkage)〇
[0114] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物包括天然磷酸二酯（phosphordiester)和硫代 磷酸酯鍵合的混合物。
[0115] 本發(fā)明的優(yōu)選的核苷酸類似物是選自下組的核苷酸類似物：2' -0-烷基-RNA單 體、2' -氨基-DNA單體、2' -氟-DNA單體、LNA單體、HNA單體、ANA單體、FANA單體、DNA 單體、PNA單體和INA單體，但還可使用其它單體[Nawrot和Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925]。
[0116] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的羥甲基取代的單體的羥甲基取代基被共軛基團(tuán)官能 化。共軛基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的改變、擴(kuò)大或改善本發(fā)明RNA復(fù)合物的特性的基團(tuán)。 這種基團(tuán)可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞分布、器官分布、組織分布、雙鏈體解鏈溫度、靶親和力、生物穩(wěn)定 性、雜交信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。
[0117] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的羥甲基取代的單體的羥甲基取代基被共軛的基團(tuán)與羥 甲基取代基的亞甲基基團(tuán)之間的醚鍵合官能化。參見(jiàn)圖2(單體F)。
[0118] 在一實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，本發(fā)明的羥甲基取代的單體 的羥甲基取代基在并入本發(fā)明RNA復(fù)合物之前轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛎压倌芏?。參?jiàn)圖2 (單體G)。
[0119] 在另一實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，本發(fā)明的羥甲基取代的單 體的羥甲基取代基在并入本發(fā)明RNA復(fù)合物之前轉(zhuǎn)變?yōu)閹€甲基官能度。參見(jiàn)圖2(單體G， R = H)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，該巰基官能度在RNA合成期間被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)，例 如作為其乙?；苌?。
[0120] 在一實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，本發(fā)明的羥甲基取代的單體 的羥甲基取代基在并入本發(fā)明RNA復(fù)合物之前轉(zhuǎn)變?yōu)榘饭倌芏?。參?jiàn)圖2 (單體I，R = H)。 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，該胺官能度在RNA合成期間被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)，例如作為其 三氟乙酰基或Fmoc衍生物。
[0121] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的羥甲基取代的單體的羥甲基取代基作為柄（handle) 起作用以連接酰胺-連接的共軛基團(tuán)。這包括羥甲基取代基的羥基單元向胺單元的轉(zhuǎn)變， 例如如上所述的，以及使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過(guò)例如共軛基團(tuán)經(jīng)由酰胺鍵形成 的該氨基基團(tuán)的進(jìn)一步衍生化。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，這可發(fā)生在RNA合成之 前或RNA合成之后（圖2,單體H)。
[0122] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的羥甲基取代的單體的羥甲基取代基作為柄起作用以連 接氨基-連接的共軛基團(tuán)。這包括羥甲基取代基的羥基單元向胺單元的轉(zhuǎn)變，例如如上所 述的，以及使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過(guò)例如共軛基團(tuán)經(jīng)由胺鍵形成的該氨基基團(tuán) 的進(jìn)一步衍生化。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，這可發(fā)生在RNA合成之前或RNA合成 之后（圖2,單體I)。
[0123] 在另一實(shí)施方案中，用于共軛的胺基團(tuán)是氨基基團(tuán)、哌嗪基基團(tuán)或二氨基烷基基 團(tuán)。這種單體稱為胺-衍生化的單體。這些基團(tuán)各自可被進(jìn)一步衍生化或共軛（圖2,單體 J)。
[0124] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與天然RNA復(fù)合物相比，本發(fā)明RNA復(fù)合物具有減少的脫靶效 應(yīng)。
[0125] 在一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物在反義鏈中具有至少一個(gè)本發(fā)明的羥甲基取代 的單體。
[0126] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有至少一個(gè)并入或圍繞反義鏈的所謂種子 區(qū)的本發(fā)明的羥甲基取代的單體，即該單體在從反義鏈5' -末端的第1-12號(hào)位置的至少一 個(gè)中。
[0127] 在又另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有至少一個(gè)從反義鏈5' -末端的第2-10 號(hào)位置的至少一個(gè)中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。
[0128] 在又另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有一個(gè)從反義鏈5' -末端的第3-8號(hào)位 置之一中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。
[0129] 在又另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有一個(gè)從反義鏈5' -末端的第7號(hào)或第8 號(hào)位置之一中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。
[0130] 在又另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有一個(gè)從反義鏈5'-末端的第7號(hào)位置 中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。
[0131] 在又另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有一個(gè)從反義鏈5' -末端的第9-16號(hào)位 置中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。
[0132] 在又另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有一個(gè)從反義鏈5' -末端的第9-11號(hào)位 置中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。
[0133] 在又另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物具有一個(gè)從反義鏈'-末端的第9-10號(hào)位 置中并入的本發(fā)明的羥甲基取代的單體。
[0134] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物與天然RNA復(fù)合物相比產(chǎn)生減少的免 疫應(yīng)答。
[0135] 在更另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物與天然RNA復(fù)合物相比具有延長(zhǎng)的 效應(yīng)。
[0136] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物與天然RNA復(fù)合物相比具有增加的 效應(yīng)。因此在優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物比天然RNA復(fù)合物更有效地介導(dǎo)RNAi，例如通過(guò) 靶mRNA的更有效地降解或通過(guò)靶mRNA的更有效地翻譯抑制。
[0137] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物有效地遞送于人類或動(dòng)物的特定器 官或組織。
[0138] 在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物能夠有效地穿透細(xì)胞膜。
[0139] 在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物能夠比（that)天然RNA復(fù)合物更有效 地穿透細(xì)胞膜。
[0140] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA復(fù)合物能夠結(jié)合血漿蛋白，這增加 RNA復(fù)合物在 人體中的滯留。
[0141] 第二方面，RNA復(fù)合物的制備
[0142] 本發(fā)明的另一方面是制備本發(fā)明雙鏈RNA復(fù)合物的方法，所述方法包括在其中形 成包含核心雙鏈區(qū)的RNA復(fù)合物的條件下溫育反義鏈與信使鏈，所述RNA復(fù)合物能夠介導(dǎo) 相應(yīng)細(xì)胞RNA的RNA干擾。
[0143] 在該方面的替代實(shí)施方案中，RNA復(fù)合物被本發(fā)明的RNA雙鏈體代替（第十方 面）。
[0144] 第三方面，介導(dǎo)核酸修飾的方法
[0145] 本發(fā)明的又另一方面是介導(dǎo)細(xì)胞或生物體中靶核酸的核酸修飾的方法，其包括以 下步驟：
[0146] a.在其中可發(fā)生靶核酸修飾的條件下將細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的RNA復(fù)合物接 觸，
[0147] b.從而介導(dǎo)靶核酸的修飾。
[0148] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，介導(dǎo)靶核酸的核酸修飾的方法在體外進(jìn)行。
[0149] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，介導(dǎo)靶核酸的核酸修飾的方法在體內(nèi)進(jìn)行，即在動(dòng)物、人類或 非人類動(dòng)物中。
[0150] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，介導(dǎo)靶核酸的核酸修飾的方法在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行。
[0151] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行。
[0152] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的核酸修飾是RNA干擾，優(yōu)選的是靶mRNA的降解或靶 mRNA的翻譯抑制或其它類型RNA例如非編碼RNA的抑制。
[0153] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸修飾是DNA甲基化。
[0154] 在該方面的替代實(shí)施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸（第九方面）或 本發(fā)明的RNA雙鏈體（第十方面）代替。
[0155] 第四方面，檢查基因功能的方法
[0156] 本發(fā)明的另一方面是檢查細(xì)胞或生物體中基因功能的方法，其包括：
[0157] a.將對(duì)應(yīng)于所述基因的本發(fā)明的RNA復(fù)合物引入細(xì)胞或生物體，從而產(chǎn)生測(cè)試細(xì) 胞或測(cè)試生物體，
[0158] b.將測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試生物體保持在其中可發(fā)生靶核酸修飾的條件下，
[0159] c.觀察測(cè)試細(xì)胞或生物體在步驟b中產(chǎn)生的表型并任選地將觀察到的表型與合 適的對(duì)照細(xì)胞或?qū)φ丈矬w的表型比較，從而提供關(guān)于基因功能的信息。
[0160] 例如使用所附實(shí)施例中列出的轉(zhuǎn)染，本發(fā)明的RNA復(fù)合物可引入細(xì)胞。
[0161] 可觀察生物體或細(xì)胞的表型，例如使用蛋白組學(xué)來(lái)評(píng)價(jià)蛋白水平或使用微陣列來(lái) 評(píng)價(jià)RNA水平。還可使用更精細(xì)的表型，例如一種特定基因的表達(dá)。
[0162] 所獲得的關(guān)于基因功能的信息可用于確定基因產(chǎn)物是否是與特定疾病相關(guān)的治 療干預(yù)的適合的靶。因此，如果證實(shí)某一基因產(chǎn)物在已知在例如具體亞型癌癥中受影響 的某一生化途徑中起作用，那么該基因產(chǎn)物可能是治療前述亞型癌癥的治療干預(yù)的適合的 靶。
[0163] 在檢查細(xì)胞或生物體中基因功能的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法中的核酸修飾 是RNA干擾，優(yōu)選的是靶mRNA的降解或靶RNA的翻譯抑制。
[0164] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸修飾是DNA甲基化。
[0165] 在檢查細(xì)胞或生物體中基因功能的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞培養(yǎng)物 中、體外或體內(nèi)進(jìn)行。
[0166] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行。
[0167] 在該方面的替代實(shí)施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸（第九方面）或 本發(fā)明的RNA雙鏈體（第十方面）代替。
[0168] 第五方面，評(píng)價(jià)藥劑的方法
[0169] 本發(fā)明的另一方面是評(píng)價(jià)一種藥劑是否作用于基因產(chǎn)物的方法，其包括以下步 驟：
[0170] a.將對(duì)應(yīng)于所述基因的本發(fā)明的RNA復(fù)合物引入細(xì)胞或生物體，從而產(chǎn)生測(cè)試細(xì) 胞或測(cè)試生物體，
[0171] b.將測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試生物體保持在其中發(fā)生靶核酸修飾的條件下，
[0172] c.將藥劑引入測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試生物體，
[0173] d.觀察測(cè)試細(xì)胞或生物體在步驟c中產(chǎn)生的表型，并任選地將觀察到的表型與合 適的對(duì)照細(xì)胞或?qū)φ丈矬w的表型比較，從而提供關(guān)于藥劑是否作用于基因產(chǎn)物的信息。 [0174] 步驟d中優(yōu)選的對(duì)照是不具有步驟a中引入的RNA復(fù)合物的測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試生物 體。
[0175] 在評(píng)價(jià)藥劑是否作用于基因或基因產(chǎn)物的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的核酸 修飾是RNA干擾，優(yōu)選的是靶RNA的降解或靶RNA的翻譯抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸 修飾的修飾是DNA甲基化。
[0176] 在評(píng)價(jià)藥劑是否作用于基因產(chǎn)物的方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞培養(yǎng) 物中、體外或體內(nèi)進(jìn)行。
[0177] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行。
[0178] 在該方面的替代實(shí)施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸（第九方面）或 本發(fā)明的RNA雙鏈體（第十方面）代替。
[0179] 第六方面，藥物組合物
[0180] 本發(fā)明的又另一方面是RNA復(fù)合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔助劑。對(duì) 技術(shù)人員明顯的是，本發(fā)明的RNA復(fù)合物可設(shè)計(jì)為靶向特定基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)理解的是， 該RNA復(fù)合物將靶向DNA序列或RNA序列而不是蛋白。然而，基因產(chǎn)物諸如蛋白的水平可 被間接影響，如果其mRNA或非編碼RNA被例如RNA降解或翻譯抑制所修飾。還可影響編碼 該蛋白的基因的表達(dá)，例如因?yàn)镈NA甲基化。
[0181] 在該方面的替代實(shí)施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸（第九方面）或 本發(fā)明的RNA雙鏈體（第十方面）代替。
[0182] 第七方面，使用藥物
[0183] 因此另一方面是本發(fā)明的RNA復(fù)合物用作藥物。驗(yàn)證治療靶后，技術(shù)人員可設(shè)計(jì) 影響靶水平和活性的RNA復(fù)合物，因?yàn)镽NA復(fù)合物的特異性專門地存在于反義鏈序列中。對(duì) 于具有連續(xù)信使鏈的天然RNA復(fù)合物，由于信使鏈作為引導(dǎo)序列起作用，因而仍存在脫靶 效應(yīng)的問(wèn)題。
[0184] 在該方面的替代實(shí)施方案中，該RNA復(fù)合物被本發(fā)明的寡核苷酸（第九方面）或 本發(fā)明的RNA雙鏈體（第十方面）代替。
[0185] 第八方面，單體
[0186] 本發(fā)明的一個(gè)方面是適于并入本發(fā)明的羥甲基取代的單體的單體和從易于獲 得的起始物料制備其的方法。本發(fā)明的羥甲基取代的單體的胸腺嘧啶-1-基衍生物 已被并入DNA鏈，且制備其用于自動(dòng)DNA/RNA合成的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的程序已被報(bào) 道[K. D. Nielsen 等人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493 ;H. Thrane 等人，Tetrahedron 1995, 51，10389 ;P. Nielsen 等人，Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]。
[0187] 最通常地，本發(fā)明的RNA復(fù)合物將由如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的自動(dòng)寡核苷酸 合成制備。將本發(fā)明的羥甲基取代的單體并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物遵循用于a)在 自動(dòng)RNA合成儀上的RNA合成、b) RNA檢查、c) RNA純化和d) RNA分離的標(biāo)準(zhǔn)方法 [F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues (寡核苷酸和類似物），IRL Press, Oxford University Press, 1991]。輕甲基取代的RNA寡核苷酸（=RNA鏈）和RNA復(fù)合物可使用 亞磷酰胺衍生物，使用RNA合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。
[0188] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，制備本發(fā)明的羥甲基取代的單體的亞磷酰胺衍生物的方法開(kāi) 始于核糖核苷，例如核糖核苷的05' -DMT保護(hù)的衍生物，對(duì)于堿基，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶 和5-甲基胞嘧啶含有堿基保護(hù)基團(tuán)，如例如，苯甲?；?、異丁?；?、乙?；?、苯氧乙酰基、叔 丁基苯氧乙酰基或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它標(biāo)準(zhǔn)堿基保護(hù)基團(tuán)。
[0189] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備具有2'，3' -斷開(kāi)的碳-碳鍵（核糖核苷命名 法）的適于并入單體D和E的單體結(jié)構(gòu)單元的方法。
[0190] 在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備具有2'，3' -斷開(kāi)的碳-碳鍵、適于并入 單體如F-J且另外在例如其2'-碳原子（核糖核苷命名法）攜帶羥基基團(tuán)以外的官能度或 基團(tuán)的單體結(jié)構(gòu)單元的方法。
[0191] 在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，制備單體D的亞磷酰胺衍生物的方法的關(guān)鍵步驟 中包括2'，3'-二醇裂解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性02'-保護(hù)和03'-磷酸化 (phosphitylation)〇
[0192] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，以例如高碘酸鈉為試劑使用氧化裂解進(jìn)行2'，3' -二醇裂解。
[0193] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，高碘酸鈉裂解后中間產(chǎn)物的還原被還原為相應(yīng)的二醇， 以例如硼氫化鈉實(shí)現(xiàn)。
[0194] 為了將單體D并入本發(fā)明的RNA復(fù)合物，保護(hù)2' -羥基基團(tuán)（核糖核苷命名法） 是必須的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，這通過(guò)苯甲酰化進(jìn)行。為了優(yōu)化保護(hù)的選擇性，即 02'-苯甲?；鄬?duì)于03'-苯甲酰化的量，僅使用略多于一當(dāng)量的苯甲?；噭ū郊柞Ｂ?或例如苯甲酸酐（benzoyl anhydride))可為有益的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，苯甲?；?在室溫以下進(jìn)行。在另一有用的實(shí)施方案中，苯甲?；讴枴鉉以下或甚至_50°C以下進(jìn)行。
[0195] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，02' -保護(hù)通過(guò)乙?；蛲ㄟ^(guò)使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的?；噭┻M(jìn)行?；瘉?lái)完成。
[0196] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，02'-保護(hù)通過(guò)使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的硅烷化 試劑和方法硅烷化來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選的硅烷化保護(hù)基團(tuán)是叔丁基二甲基甲硅烷基。
[0197] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，隨后的磷酸化（phosphitylation)反應(yīng)使用所謂"PC1"試劑 [PCI(OCH 2CH2Cn) (NQPr)2)]或所謂"bis-amidite"試劑[P(OCH2CH2CN) (N(iPr)2)2]進(jìn)行。
[0198] 在制備單體D的亞磷酰胺衍生物的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，起始物料是核糖核 苷，例如核糖核苷的05' -DMT保護(hù)的衍生物，對(duì)于堿基，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和5-甲基胞 嘧啶含有堿基保護(hù)基團(tuán)如例如苯甲?；?、異丁?；?、乙酰基、苯氧乙?；⑹宥』窖跻阴?基或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它標(biāo)準(zhǔn)堿基保護(hù)基團(tuán)。
[0199] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備單體E的亞磷酰胺衍生物的方法。
[0200] 在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，制備單體E亞磷酰胺衍生物的方法的關(guān)鍵步驟 中包括2'，3'-二醇裂解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性03'-保護(hù)和02'-磷酸化 (phosphitylation)。03' -保護(hù)可例如通過(guò)娃燒化或?；M(jìn)行，或通過(guò)組合如首先02' -苯 甲?；?、然后03' -硅烷化、之后02' -脫苯甲酰化進(jìn)行。如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，還可施 加其它保護(hù)基團(tuán)。
[0201] 在另外優(yōu)選實(shí)施方案中，制備具有2'，3'-斷開(kāi)的碳-碳鍵、適于并入單體 如F-J且另外在其2'-碳原子（核糖核苷命名法）攜帶羥基基團(tuán)以外的官能度的單體 結(jié)構(gòu)單元的方法的關(guān)鍵步驟中包括開(kāi)始于核糖核苷（例如05'-DMT保護(hù)的核糖核苷 (ribonucleosde))2'，3' -二醇裂解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性03' -保護(hù)、2' -輕基基 團(tuán)的轉(zhuǎn)化、03' -脫保護(hù)和03' -磷酸化（phosphitylation)。03' -保護(hù)可例如通過(guò)娃燒化或 ?；M(jìn)行，或如首先02' -苯甲?；?、然后03' -硅烷化、之后02' -脫苯甲?；慕M合進(jìn)行。 如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，還可施加其它保護(hù)基團(tuán)。轉(zhuǎn)化2'-羥基基團(tuán)為另一基團(tuán)如氨基、 ?；被?、烴化氨基、二烴化氨基、氨甲?；被?、哌嗪基、?；哙夯?、烴化哌嗪基、氨甲酰 化哌嗪基、巰基、?；瘞€基、烴化巰基、二硫化物、?；u基、烴化羥基、氨甲?；u基等，或 通過(guò)這些基團(tuán)的取代和/或保護(hù)的衍生物，可使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和程 序進(jìn)行。這種方法和程序包括對(duì)2' -羥基基團(tuán)的活化衍生物的取代反應(yīng)或酰化或氨甲?；?反應(yīng)。這種方法和程序還包括02'-烴化反應(yīng)和并入其它C2'連接基團(tuán)如氨基或巰基后的 烴化反應(yīng)。又另一種可能性是2' -羥基基團(tuán)氧化獲得醛官能度，其可通過(guò)例如與親核試劑 反應(yīng)進(jìn)一步修飾，或獲得羧基官能度，其可在羧基官能度轉(zhuǎn)化為活化的衍生物如活化酯后 通過(guò)例如與親核試劑反應(yīng)進(jìn)一步修飾。
[0202] 在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，制備適于并入單體如F-J、但為"倒置的"（如單體D和 E可認(rèn)為是"倒置的"）以使02'原子被磷酸化（phosphitylated)且3'-羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?另一基團(tuán)以使C3'原子連接于羥基基團(tuán)以外的官能度的單體結(jié)構(gòu)單元的方法的關(guān)鍵步驟 中包括開(kāi)始于核糖核苷（例如05' -DMT保護(hù)的核糖核苷（ribonucleosde))2'，3' -二醇裂 解、所得的中間產(chǎn)物的還原、選擇性02' -保護(hù)、3' -羥基基團(tuán)的轉(zhuǎn)化、02' -脫保護(hù)和02' -磷 酸化（phosphitylation)。02'-保護(hù)可例如通過(guò)娃燒化或?；⒒騼烧叩慕M合來(lái)進(jìn)行。如 本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，還可施加其它保護(hù)基團(tuán)。3'-羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為另一基團(tuán)如氨基、酰 化氨基、烴化氨基、二烴化氨基、氨甲?；被?、哌嗪基、?；哙夯N化哌嗪基、氨甲?；?哌嗪基、巰基、酰化巰基、烴化巰基、二硫化物、?；u基、烴化羥基、氨甲?；u基等，或通 過(guò)這些基團(tuán)的取代和/或保護(hù)的衍生物，可使用有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和程序 進(jìn)行。這種方法和程序包括對(duì)3' -羥基基團(tuán)的活化衍生物的取代反應(yīng)或?；虬奔柞；?應(yīng)。這種方法和程序還包括03'-烴化反應(yīng)和并入其它C3'連接基團(tuán)如氨基或巰基后的烴 化反應(yīng)。又另一種可能性是3' -羥基基團(tuán)氧化獲得醛官能度，其可通過(guò)例如與親核試劑反 應(yīng)進(jìn)一步修飾，或獲得羧基官能度，其可在羧基官能度轉(zhuǎn)化為活化的衍生物如活化酯后通 過(guò)例如與親核試劑反應(yīng)進(jìn)一步修飾。
[0203] 在一個(gè)實(shí)施方案中，2' -C-哌嗪基衍生物通過(guò)轉(zhuǎn)化2' -羥基基團(tuán)為離去基團(tuán)（例 如甲磺酸酯衍生物）、隨后與大量過(guò)量哌嗪反應(yīng)而制備。這例如可作為朝向結(jié)構(gòu)Amidite J 的亞磷酰胺（參見(jiàn)下圖）合成的步驟進(jìn)行。
[0204] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備適于并入本發(fā)明的羥甲基取代的單體、 在C1'原子（核糖核苷命名法）攜帶不同于天然核堿基的基團(tuán)或官能度的單體結(jié)構(gòu)單元的 方法。可含有保護(hù)基團(tuán)的這種基團(tuán)或官能度包括例如天然核堿基以外的芘、茈、熒光團(tuán)、氫、 燒基、反應(yīng)性基團(tuán)和雜環(huán)。
[0205] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備適于并入本發(fā)明的羥甲基取代的單體的 單體結(jié)構(gòu)單元的方法，該羥甲基取代的單體構(gòu)造為H-膦酸酯衍生物而不是亞磷酰胺衍生 物。
[0206] 以下顯示本發(fā)明關(guān)于亞磷酰胺（=amidite)結(jié)構(gòu)單元的一些優(yōu)選的實(shí)施方案的 結(jié)構(gòu)實(shí)例（DMT = 4, 4' -二甲氧基三苯甲基；堿基=天然核堿基；CEtO =氰基乙氧基）：
[0207]

【權(quán)利要求】
1. 一種包含無(wú)環(huán)的2' -3' -開(kāi)環(huán)-核苷酸單體的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是具有第 一和第二RNA鏈的RNA雙鏈體，并且其中所述無(wú)環(huán)單體是單體D
其中喊基是核喊基。
2. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，每條鏈包括15至40個(gè)核苷酸和無(wú)環(huán)單體。
3. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，每條鏈包括1至5個(gè)無(wú)環(huán)單體。
4. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其進(jìn)一步包括選自2' -0-烷基-RNA單體、2' -氨 基-DNA單體、2' -氟-DNA單體、PNA單體、HNA單體、ANA單體、FANA單體、CeNA單體、ENA 單體、DNA單體和INA單體的核苷酸類似物。
5. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)2' -0-燒基-RNA核苷酸類 似物。
6. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其進(jìn)一步包括硫代磷酸酯鍵或硼代磷酸酯鍵。
7. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠介導(dǎo)與部分寡核苷酸互補(bǔ)的 靶核苷酸序列的RISC依賴的翻譯阻遏或降解。
8. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其包括14至26個(gè)堿基對(duì)。
9. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一個(gè)懸端。
10. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其包括1至14個(gè)核苷酸的懸端。
11. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一個(gè)3' -懸端。
12. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一個(gè)1至14個(gè)核苷酸的3' -懸端。
13. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其包括至少一個(gè)平端。
14. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其包括與靶核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
15. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其與具有天然RNA單體而不是無(wú)環(huán)單體的相同寡核 苷酸相比具有減少的脫靶效應(yīng)。
16. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與具有天然RNA單體而不是無(wú)環(huán) 單體的相同寡核苷酸相比具有增加的或延長(zhǎng)的基因沉默的效力。
17. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與具有天然RNA單體而不是無(wú)環(huán) 單體的相同寡核苷酸相比具有改善的對(duì)酶促降解的穩(wěn)定性。
18. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與具有天然RNA單體而不是無(wú)環(huán) 單體的相同寡核苷酸相比具有減少的免疫刺激。
19. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中鏈中的一條是不連續(xù)的信使鏈。
20. -種包括無(wú)環(huán)的2' -3' -開(kāi)環(huán)-核苷酸單體的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是微 RNA，并且其中所述無(wú)環(huán)單體是單體D 其中喊基是核喊基。
21. -種包括無(wú)環(huán)的2' -3' -開(kāi)環(huán)-核苷酸單體的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是靶向 微RNA的單鏈RNA，并且其中所述無(wú)環(huán)單體是單體D 其中喊基是核喊基。
22. -種包括無(wú)環(huán)的2' -3' -開(kāi)環(huán)-核苷酸單體的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是結(jié)合 空間阻塞RNA的RNA，并且其中所述無(wú)環(huán)單體是單體D
其中喊基是核喊基。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104480112SQ201410554369
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2007年5月22日
【發(fā)明者】耶斯佩·溫格爾 申請(qǐng)人:阿克丘勒斯治療公司