具有堿基配對的寡聚體的擴(kuò)增報告子的制作方法
【專利說明】具有堿基配對的寡聚體的擴(kuò)增報告子
[0001] 在先申請的奪叉引用
[0002] 本申請根據(jù)35U. S. C. § 119(e)要求2013年8月12日提交的美國臨時專利申請 系列號61/864, 788的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時專利申請為了所有目的通過引用整體并入本文。
[0003] 其他材料的奪叉引用
[0004] 本申請為了所有目的通過引用整體并入以下材料：美國專利號7,041,481， 2006年5月9日授權(quán)；美國專利申請公開號2010/0173394A1，公開于2010年7月8日； 美國專利申請公開號2011/0217712A1，公開于2011年9月8日；美國專利申請公開號 2012/0152369A1，公開于2012年6月21日；美國專利申請公開號2012/0194805A1，公開于 2012年8月2日；美國專利申請系列號14/171,754,提交于2014年2月3日；和Jos印h R.Lakowicz，PRINCIPLES OF FLUORESCEENCE SPECTROSCOPY (第二版，1999)。
[0005] 介紹
[0006] 數(shù)字測定通常依賴于檢測樣品中單個拷貝的分析物的存在或活性的能力。在一個 示例性數(shù)字測定中，將樣品分成一組一般具有相等體積的分區(qū)，每個平均含有少于約一個 拷貝的分析物。如果分析物的拷貝在分區(qū)中隨機(jī)分布，一些分區(qū)應(yīng)不含有拷貝，其他僅含一 個拷貝，并且如果分區(qū)的數(shù)目足夠大，還有其他分區(qū)應(yīng)含有兩個拷貝、三個拷貝和甚至更高 數(shù)目的拷貝。基于在分區(qū)中分析物的給定平均濃度，在分區(qū)中準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)〇、1、2、3或更多個 拷貝的可能性，可以通過泊松分布描述。反之，在分區(qū)中（及由此在樣品中）的分析物的濃 度可以從在分區(qū)中發(fā)現(xiàn)給定數(shù)目的拷貝的可能性來估計。
[0007] 沒有發(fā)現(xiàn)拷貝和發(fā)現(xiàn)一個或更多個拷貝的可能性的估計可以在數(shù)字測定中測量。 能夠測試每個分區(qū)以確定分區(qū)是含有至少一個拷貝的分析物的陽性分區(qū)，還是不含有分析 物拷貝的陰性分區(qū)。在分區(qū)中沒有發(fā)現(xiàn)拷貝的可能性可以通過測試的陰性的分區(qū)比例（"陰 性比例"）來估計，且發(fā)現(xiàn)至少一個拷貝的可能性通過測試的陽性的分區(qū)比例（"陽性比例"） 估計。陽性比例或，同等地，陰性比例隨后可以被用于通過泊松統(tǒng)計確定在分區(qū)中分析物的 濃度。
[0008] 數(shù)字測定常常依賴于分區(qū)中的核酸靶標(biāo)的擴(kuò)增以能夠檢測單個拷貝的分析物。靶 標(biāo)的擴(kuò)增可以經(jīng)由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)進(jìn)行，以實現(xiàn)數(shù)字PCR測定。靶標(biāo)的擴(kuò)增可以從被 包含在反應(yīng)中的探針光學(xué)地檢測。該探針可以包括綴合到熒光團(tuán)和猝滅劑的寡核苷酸。寡 核苷酸可以在靶標(biāo)被擴(kuò)增時被切割，以將熒光團(tuán)與猝滅劑分離。作為結(jié)果，在靶標(biāo)擴(kuò)增不存 在時（陰性分區(qū)），來自熒光團(tuán)的光發(fā)射可以比在靶標(biāo)擴(kuò)增存在時（陽性分區(qū)）更有效地被 猝滅劑猝滅。然而，陰性分區(qū)和陽性分區(qū)之間熒光的不同可能隨測定配置（configuration) 而變化，這常減弱可靠地區(qū)分兩種類型的分區(qū)的能力。
[0009] 需要簡單且經(jīng)濟(jì)有效的方法以最小化在基于探針的擴(kuò)增測定諸如在數(shù)字PCR測 定中的噪音。
[0010] 概沭
[0011] 本公開內(nèi)容提供了一種包括方法、設(shè)備和組合物的系統(tǒng)，用于使用擴(kuò)增報告子進(jìn) 行擴(kuò)增測定，該擴(kuò)增報告子包含能夠在低于報告子的解鏈溫度彼此堿基配對的第一寡聚體 和第二寡聚體。報告子可以具有可檢測的光致發(fā)光，該光致發(fā)光受第一寡聚體和第二寡聚 體彼此的堿基配對影響，如被降低?？梢栽诟哂诮怄湝囟仍谥辽僖粋€體積內(nèi)諸如多個分區(qū) 內(nèi)擴(kuò)增靶標(biāo)諸如核酸靶序列，并且可以在低于解鏈溫度從至少一個體積內(nèi)檢測報告子的光 致發(fā)光。靶標(biāo)的性質(zhì)，諸如靶標(biāo)的濃度，可以基于檢測到的光致發(fā)光確定。
[0012] 附圖概沐
[0013] 圖1是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面的示例性報告子的示意圖，該報告子包含堿基配對 的寡聚體（"探針"和"接納體（sink)"），他們共同提供光致發(fā)光團(tuán)和光致發(fā)光團(tuán)的能量傳 遞伴侶，諸如猝滅劑。
[0014] 圖2是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，比較由在堿基配對形式時的圖1的報告子、從接納 體分離的圖1的報告子的探針、和由靶標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)生的降解（切割）形式的探針產(chǎn)生的熒光 水平不意圖。
[0015] 圖3是說明根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用圖1的報告子進(jìn)行的示例性測定的選擇的 步驟和構(gòu)造的流程示意圖。
[0016] 圖4是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用包含堿基配對的寡聚體的報告子進(jìn)行的示例性 測定的流程示意圖。
[0017] 圖5是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用于進(jìn)行圖4的測定的示例性系統(tǒng)的示意圖。
[0018] 圖6是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，比較來自以下的熒光的水平的示意圖：(a)包含與 探針堿基配對的接納體的示例性報告子，所述探針被配置成被標(biāo)記光致發(fā)光團(tuán)的引物，和 (b)通過引物延伸并入擴(kuò)增子的探針，所述擴(kuò)增子將接納體排除在與探針堿基配對相互作 用之外。
[0019] 圖7是圖示根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用圖6的報告子進(jìn)行示例性測定的選擇的步 驟和構(gòu)造的流程示意圖。
[0020] 圖7A是顯示根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，圖6和7的測定的階段的示例性熱曲線，以 及在每個階段的至少一部分期間報告子的示例性狀態(tài)的圖。
[0021] 圖8是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，比較由以下產(chǎn)生的熒光的水平的示意圖：(a)又另 一個示例性報告子，其包含彼此堿基配對的探針和接納體，和（b)報告子的因靶標(biāo)擴(kuò)增而 被降解的探針。
[0022] 圖9是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，比較來自以下的熒光的水平的示意圖：(a)圖6的 較高解鏈溫度形式的報告子，和（b)聚合酶延伸形式的來自報告子的探針，所述探針形成 擴(kuò)增子的一部分且報告子的接納體因靶標(biāo)擴(kuò)增而被切割。
[0023] 圖9A是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面的示例性報告子的示意圖，所述示例性報告子包 含具有猝滅劑且與探針堿基配對的接納體，所述接納體被配置成作為用于擴(kuò)增的聚合酶可 延伸引物發(fā)揮作用。
[0024] 圖10是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面的示例性報告子的示意圖，所述示例性報告子包 含與探針堿基配對的接納體，所述探針被布置為因與接納體結(jié)合而分子內(nèi)猝滅光致發(fā)光 團(tuán)。
[0025] 圖11是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面的示例性報告子的示意圖，所述示例性報告子包 含與探針結(jié)合的接納體，所述探針被布置為因與接納體結(jié)合而分子間猝滅光致發(fā)光團(tuán)。
[0026] 圖12是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面的示例性報告子的示意圖，所述報告子包含與探 針結(jié)合的接納體，所述探針的光致發(fā)光團(tuán)和所述接納體的猝滅劑各自被置于探針或接納體 的相對的末端中間。
[0027] 圖13是圖示根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，使用至少兩種不同的探針測定靶標(biāo)區(qū)域的 策略的流程示意圖，所述探針的至少一種是在室溫下被接納體結(jié)合的引物，且所述探針的 另一種是分子內(nèi)自猝滅的。
[0028] 圖14是圖示根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，使用至少兩種不同的探針測定靶標(biāo)區(qū)域的 另一個策略的另一個流程示意圖，所述探針的每個是在室溫下被不同的接納體結(jié)合的引 物。
[0029] 圖14A是圖示根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，使用至少兩種不同的探針測定靶標(biāo)區(qū)域的 又另一個策略的又另一個流程示意圖，所述探針的每個是在室溫下被不同的接納體結(jié)合的 正向引物或反向引物。
[0030] 圖15是圖示根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，在用標(biāo)記光致發(fā)光團(tuán)的引物作為探針?biāo)M(jìn) 行的擴(kuò)增測定中，相對于期望的擴(kuò)增子，選擇性地猝滅從引物二聚體發(fā)射的光的策略的流 程不意圖。
[0031] 圖16是對于多種靶標(biāo)且具有不同水平的測定多重化，在微滴中進(jìn)行的一系列測 定所測量的熒光幅度的圖，并且該圖顯示了陰性微滴的基礎(chǔ)熒光的變化，以及在陰性微滴 和陽性微滴之間熒光幅度的差異。
[0032] 圖17是對于多種測定組合、不同水平的測定多重化、和/或從測定去除不同的引 物對，在微滴中進(jìn)行的一系列測定所測量的熒光幅度的圖，并且該圖顯示了陰性微滴的基 礎(chǔ)熒光的變化。
[0033] 圖18是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，理想的單重測定中的探針與不理想的單重或多 重測定中的探針的示意視圖，其示出了在兩種測定中探針的光致發(fā)光團(tuán)和猝滅劑之間的平 均間隔的可能的變化。
[0034] 圖19是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，在接納體的存在和不存在下在分別具有五種探 針或一種探針的微滴中進(jìn)行的一系列測定所測量的熒光幅度的圖，所述接納體被設(shè)計為使 一種探針的拷貝位于彼此鄰近處，以使得一個探針拷貝的光致發(fā)光團(tuán)被另一個探針拷貝的 猝滅劑猝滅。
[0035] 圖20是圖示根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用于測定分區(qū)（例如，微滴）中的重疊的靶 標(biāo)序列的一對不同的策略的流程示意圖，左側(cè)的策略利用充當(dāng)引物且在室溫下被接納體結(jié) 合的探針，且右側(cè)的策略利用位于一對引物中間的自猝滅的探針。
[0036] 圖21是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，從微滴收集的熒光數(shù)據(jù)以及比較在用于對微滴 熱循環(huán)的不同退火溫度下圖19的兩種策略的圖。
[0037] 圖22是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，對于每種測定策略的每個微滴組，從圖21的數(shù)據(jù) 確定的靶標(biāo)濃度的圖。
[0038] 圖23是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，在微滴中進(jìn)行K-Ras靶標(biāo)的野生型和突變型等 位基因的多重測定的策略的示意圖，其中探針、擴(kuò)增引物和接納體與野生型（WT)和突變型 (MUT)模板中的它們的預(yù)期結(jié)合位點(diǎn)對齊。
[0039] 圖24是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，從根據(jù)圖23的策略在微滴中進(jìn)行的K-Ras靶標(biāo) 的多重測定收集的熒光數(shù)據(jù)的一系列散點(diǎn)圖，在所述微滴中存在不同的量的接納體。
[0040] 圖25是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用于在微滴中進(jìn)行K-Ras基因的野生型和突變型 等位基因的多重測定的另一個策略的示意圖，其中探針、擴(kuò)增引物和接納體與野生型（WT) 和突變型（MUT)模板中的它們各自的結(jié)合位點(diǎn)對齊。
[0041] 圖26是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，由根據(jù)圖25的策略在微滴中進(jìn)行的K-Ras靶標(biāo) 的多重測定收集的熒光數(shù)據(jù)的一系列散點(diǎn)圖，在所述微滴中存在兩種不同的量的接納體。
[0042] 圖27是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用于進(jìn)行靶標(biāo)序列的雙重的、等位基因特異的測 定的策略的示意圖。
[0043] 圖28是各自包含堿基配對的寡聚體（"探針"和"引物"）的一對示例性報告子的 示意圖，所述堿基配對的寡聚體共同地提供光致發(fā)光團(tuán)和光致發(fā)光團(tuán)的能量傳遞伴侶，諸 如猝滅劑。
[0044] 圖29是根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，在圖28的報告子的存在下通過靶標(biāo)的擴(kuò)增所產(chǎn) 生的示例性構(gòu)造的示意圖。
[0045] 圖30是從使用兩種報告子的多重測定收集的熒光數(shù)據(jù)的一對散點(diǎn)圖，所述兩種 報告子諸如圖28的報告子，一種報告子具有用FAM焚光團(tuán)標(biāo)記的探針，并且另一種報告子 具有用HEX報告子標(biāo)記的探針。圖A顯示了來自包含靶標(biāo)DNA的"陽性"樣品的結(jié)果。圖 B顯示了來自"陰性"樣品或無靶標(biāo)樣品的結(jié)果。
[0046] 圖31是熒光數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖，通過允許來自陽性微滴的信號（空白簇）占據(jù)環(huán)繞陰 性樣品的信號360度的空間示出圖28的報告子可如何被用于設(shè)計多重測定。
[0047] 詳細(xì)描沐
[0048] 本公開內(nèi)容提供了一種包括方法、設(shè)備和組合物的系統(tǒng)，用于使用擴(kuò)增報告子進(jìn) 行擴(kuò)增測定，所述擴(kuò)增報告子包含能在低于報告子的解鏈溫度彼此堿基配對的第一寡聚體 和第二寡聚體。報告子可以具有可檢測的光致發(fā)光，該光致發(fā)光受第一和第二寡聚體彼此 的堿基配對影響，諸如被降低?？梢栽诟哂诮怄湝囟仍谥辽僖粋€體積諸如多個分區(qū)內(nèi)擴(kuò)增 靶標(biāo)諸如核酸靶序列，并且可以在低于解鏈溫度從所述至少一個體積檢測報告子的光致發(fā) 光。靶標(biāo)的性質(zhì)，諸如靶標(biāo)的濃度，可以基于檢測到的光致發(fā)光來確定。
[0049] 本公開內(nèi)容使能夠降低不包含感興趣的產(chǎn)物的分區(qū)（陰性分區(qū)）的光致發(fā)光背 景，以增加陰性和陽性分區(qū)在信號的量級上的差異?？梢詫瑝A基配對寡聚體對的報告 子包含在分區(qū)內(nèi)。該報告子可以包含形成鄰近依賴的能量傳遞對（proximity-dependent energy transfer pair)的能量供體和能量受體。可以使該能量供體包含在寡聚體的一個 中，且使能量受體包含在另一個中，或可使兩者包含在同一個寡聚體中。寡聚體的一個，第 一（或第二）寡聚體，可以是發(fā)射待檢測的光的"探針"。寡聚體的另一個，第二（或第一） 寡聚體，可以被描述為"接納體"。當(dāng)探針和接納體彼此堿基配對時，相對于當(dāng)探針不與接納 體堿基配對時，該接納體影響（例如，除其他之外，減少、增加和/或光譜移動）從探針/報 告子可檢測的光致發(fā)光。例如，探針可以包含充當(dāng)能量供體的光致發(fā)光團(tuán)，且接納體可以包 含充當(dāng)光致發(fā)光團(tuán)的能量受體的猝滅劑，以減少在分區(qū)中的探針的基礎(chǔ)光致發(fā)光。
[0050] 接納體可以包含至少部分地或完全地與探針互補(bǔ)的寡核苷酸，允許所述接納體與 所述探針結(jié)合。例如，寡核苷酸可以與探針結(jié)合以促進(jìn)光致發(fā)光團(tuán)被猝滅劑分子內(nèi)和/或 分子間猝滅。在一些實例中，探針可以或可以不包含猝滅劑，且接納體可以包含這樣的猝滅 劑：當(dāng)接納體結(jié)合探針時減少光致發(fā)光團(tuán)的光致發(fā)光發(fā)射。在任何事件中，在一些情況下， 探針和/或接納體的猝滅劑可通過接觸猝滅（可互換地稱為靜態(tài)猝滅）來猝滅探針的光致 發(fā)光團(tuán)。
[0051] 在一些實施方案中，接納體可基于測定的熱曲線被配置為僅在測定的一部分期間 結(jié)合探針。接納體可在較低的檢測溫度下結(jié)合完整形式的探針，但在一個或更多個較高的 擴(kuò)增溫度下基本上不結(jié)合完整形式的探針。所述檢測溫度（也被稱為讀取溫度）可以低 于，除其他之外，約50、45、40、35或30攝氏度，或不高于約室溫（約20-25攝氏度）。接納 體可在一個或更多個（或每個）擴(kuò)增溫度（例如，退火溫度和/或延伸溫度）下基本上不 與探針結(jié)合和/或可在用于擴(kuò)增/熱循環(huán)的最小溫度下基本不與探針結(jié)合。因此，接納體 可在檢測期間增加光致發(fā)光團(tuán)的猝滅，而基本上不干擾擴(kuò)增，從而降低檢測到的陰性分區(qū) 的光致發(fā)光幅度。接納體能夠被容易地設(shè)計并能夠被方便地添加到測定混合物中。在其他 的實例中，所述接納體可被配置為在每個擴(kuò)增循環(huán)期間和/或之后與探針結(jié)合，以允許在 至少一個液體體積中動態(tài)分析（例如，實時測定）擴(kuò)增。
[0052] 本公開內(nèi)容可提供一種通過在讀取溫度下檢測光來區(qū)分成功的PCR反應(yīng)和不成 功的PCR反應(yīng)的方法。可以在熱循環(huán)之前將探針和互補(bǔ)的寡聚體（接納體）與擴(kuò)增試劑混 合。接納體可在讀取溫度下影響探針的光致發(fā)光，但無論擴(kuò)增是否發(fā)生，在熱循環(huán)期間可不 影響探針的光致發(fā)光。接納體可以具有在低于標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)條件、但大于讀取溫度的與探針 堿基配對的解鏈溫度。探針和接納體可以在讀取溫度下相互作用以在擴(kuò)增不存在下提供猝 滅。在擴(kuò)增存在下，由于與擴(kuò)增子競爭結(jié)合探針，而并非由于在擴(kuò)增期間接納體與探針的錯 配，接納體可與探針較少相互作用。
[0053] 本公開內(nèi)容的另外的方面呈現(xiàn)為以下部分：（I)包含堿基配對寡聚體的報告子的 概述、（II)測定、（III)組合物，和（IV)實施例。
[0054] I.包含堿基配對寡聚體的報告子的概沭
[0055] 該部分提供了包含堿基配對寡聚體的報告子的概述，并例證了在擴(kuò)增測定中使用 示例性報告子以降低背景信號；參見圖1-3。
[0056] 圖1示出了示例性報告子50,其具有通過探針52與接納體54經(jīng)由一系列堿基對 56結(jié)合而形成的堿基配對構(gòu)造。該堿基對意圖是示意性的，并且可以不（或可以）代表在 本公開內(nèi)容的此處或其它處形成的堿基對的實際數(shù)目。報告子可被可互換地描述為報告系 統(tǒng)，并且可具有在圖1中顯示的堿基配對形式和至少一種分開的形式。分開的形式可以通 過使堿基配對形式解鏈（也被稱為變性）來產(chǎn)生。其他的分開的形式可以通過修飾探針和 /或接納體，諸如通過延伸或降解來至少部分地產(chǎn)生。
[0057] 探針和接納體各自可以是不同的寡聚體。寡聚體可以具有由綴合的各自包含堿基 (例如，核堿基）的單元的鏈（例如，寡核苷酸）形成的主體，所述單元諸如核苷酸或核苷酸 類似物。每個寡聚體的主體可以被附連至如下所描述的能量傳遞對的至少一個能量供體和 /或至少一個能量受體。
[0058] 探針52可以包含由寡核苷酸58 (或寡核苷酸類似物）形成的主體、至少一個能量 供體諸如光致發(fā)光團(tuán)60、和可選地至少一個能量受體諸如猝滅劑（例如，猝滅劑62a)。（在 一些實例中，可以將猝滅劑從探針省略（例如，參見部分IV)。）光致發(fā)光團(tuán)和猝滅劑各自 可沿著寡核苷酸在任何合適的位置與寡核苷酸58連接（例如，綴合，被可互換地稱為共價 連接），諸如在寡核苷酸各自的彼此相反的末端。例如，在描述的實施方案中，光致發(fā)光團(tuán) 60被附連到寡核苷酸58的5'端，且猝滅劑62a被附連到寡核苷酸58的3'端。在其他的 情況中，至少一個猝滅劑可被內(nèi)部放置在寡核苷酸的5'端和3'端之間（例如，如在來自 Integrated DNA Technologies 的 ZEN?探針形式中）。
[0059] 探針52可以或可以不充當(dāng)用于靶標(biāo)擴(kuò)增的引物。如果該探針充當(dāng)引物，則可以將 該探針配置成在擴(kuò)增期間通過聚合酶（和/或連接酶）的作用被延伸，且可以限定由靶標(biāo) 擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子的末端之一。例如，探針可以是用于靶標(biāo)擴(kuò)增的引物對的正向引物或反 向引物。（除非另行說明，用于引物的術(shù)語"正向"和"反向"是任意的、可互換的設(shè)計物。） 如果不意圖使探針充當(dāng)引物，則探針可以被修飾以阻斷其延伸和/或可以在或接近其3'端 處具有與模板的一個或更多個錯配，以阻止被聚合酶（或連接酶）延伸。相應(yīng)地，探針可以 與靶標(biāo)/擴(kuò)增子的末端結(jié)合，或可以在用于靶標(biāo)擴(kuò)增的正向引物和反向引物的結(jié)合位點(diǎn)中 間的位置處結(jié)合。
[0060] 光致發(fā)光團(tuán)60可以是能夠?qū)τ眉ぐl(fā)光照射響應(yīng)而發(fā)射光（光致發(fā)光）的任何部 分。光致發(fā)光的不例性形式包括，除其他之外，焚光和磷光。因此，光致發(fā)光團(tuán)可以是例如 熒光團(tuán)或磷光團(tuán)。合適的光致發(fā)光團(tuán)可以包括染料，諸如FAM、VIC、HEX、ROX、TAMRA或JOE 染料等。在一些實例中，光致發(fā)光團(tuán)可以被能夠化學(xué)發(fā)光或任何其它形式的發(fā)光的發(fā)光團(tuán) 代替。
[0061] 接納體54可以包括由接納體寡核苷酸64 (或寡核苷酸類似物）形成的主體，所述 接納體寡核苷酸64至少基本上與探針寡核苷酸58互補(bǔ)并與探針52特異性地結(jié)合，這至少 部分經(jīng)由堿基對56進(jìn)行。所述接納體可以（或可以不）包括彼此形成能量傳遞對的至少 一個能量供體和/或至少一個能量受體。例如，所述接納體可以包括沿著寡核苷酸在任何 合適的位置處與接納體寡核苷酸64連接（例如，綴合）的至少一個猝滅劑（例如，猝滅劑 62b)。接納體54的每個供體/受體可以在寡核苷酸64的3'端（如所示的）、在5'端、或 在3端'和5'端中間被連接。在報告子50中，猝滅劑62b可以位于非?？拷庵掳l(fā)光團(tuán)60 處，諸如以允許接觸猝滅。例如，可以將猝滅劑62b和光致發(fā)光團(tuán)60綴合到各自的核苷酸， 所述核苷酸彼此堿基配對（即，所述核苷酸彼此對齊），或沿著堿基配對的報告子偏移不多 于兩個核苷酸或不多于一個核苷酸。
[0062] 寡核苷酸58和64的每個可以具有任何合適的性質(zhì)。寡核苷酸可以具有任何合適 的長度，諸如，除其他之外，至少6、8、10、15或20個核苷酸，和/或少于約200、100或50個 核苷酸。寡核苷酸可以是常規(guī)寡核苷酸或其類似物或衍生物。示例性類似物/衍生物包括 肽核酸、鎖核酸、硫代磷酸等。寡核苷酸58和64可具有相同長度或不同長度。如果寡核苷 酸具有不同長度，寡核苷酸64可以比寡核苷酸58短（或長）。在一些情況中，接納體寡核 苷酸64比探針寡核苷酸58短的報告子可