專利名稱：：6-修飾的雙環(huán)核酸類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明才是供了6-修飾的雙環(huán)核香及由其制備的寡聚化合物和組合物。更具體而言，本發(fā)明提供了具有2'-0-C(H)(R)-4，橋的核苷以及由其制備得到的寡聚物和組合物。在優(yōu)選的實施方案中，R具有形成(R)或(S)異構(gòu)體的特定構(gòu)型。在一些實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物和組合物與耙標(biāo)RNA的一部分雜交以使該靶標(biāo)RNA喪失正常的功能。
背景技術(shù)：
：反義技術(shù)是用于減少一種或多種特定基因產(chǎn)物表達(dá)的有效手段，因而被證明在治療、診斷和研究應(yīng)用中具有獨特的用途?；瘜W(xué)修飾的核苷常用于整合入反義序列以增強(qiáng)一種或多種屬性，例如核酸酶抗性。一類這樣的化學(xué)修飾包括雙環(huán)核苷，其中該核苷的呋喃糖部分包含了連接咬響糖上兩個原子以形成雙環(huán)狀環(huán)系統(tǒng)的橋。該種雙環(huán)核苷具有各種名稱，包括對于雙環(huán)核酸或鎖核酸分別具有BNA和LNA的名稱。li各種BNA已得到制備，并報道于專利文獻(xiàn)和科技文獻(xiàn)，例如參見Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456;Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54，3607-3630;Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000,97,5633-5638;Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998，8,2219-2222;Wengel等人，PCT國際申請WO98-DK39319980914;Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039,各文獻(xiàn)的全文在此引用作為參考。已授權(quán)的美國專利和公布的申請的實例包括，例如美國專利7,053,207、6,770,748、6,268,490和6,794,499以及公布的美國申請20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、20030224377、20040143114和20030082807;各文獻(xiàn)的全文在此引用作為參考。許多LNA具有毒性。例如，參見Swayze，E.E.;Siwkowski，A.M.;Wancewicz,E.V.;Migawa，M.T.;Wyrzykiewicz,T.K.;Hung,G.;Monia,B.P.;Bennett,C.F.,Antisenseoligonucleotidescontaininglockednucleicacidimprovepotencybutcausesignificanthepatotoxicityinanimals.Nucl.AcidsRes.,doi:10.1093/nar/gkll071(2006年12月，提前在線出版)因此，對通過反義機(jī)制特異性調(diào)節(jié)基因表達(dá)的藥劑仍有著長期需求。本文公開了可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)通路的6-取代的BNA和由其制備得到的反義化合物，包括依賴于RNA酶H、RNAi和dsRNA酶等作用機(jī)制，以及基于耙標(biāo)降解或靶標(biāo)占用的其它反義機(jī)制的調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在獲知本公開內(nèi)容后將能夠在不進(jìn)行過度實驗的情況下鑒定、制備反義化合物和開發(fā)其用途。發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有下式的雙環(huán)核苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中Bx是雜環(huán)》咸基部分；1是H或羥基保護(hù)基團(tuán)；T2是H、羥基保護(hù)基團(tuán)或活性磷基團(tuán)；Z是C廣C6烷基、CVC6烯基、CVC6炔基、取代的C廣C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、或取代的酰胺。在一實施方案中，各被取代的基團(tuán)獨立地被任選被保護(hù)的取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自鹵素、氧代、羥基、OJi、NJ山、SL、N3、OC(^X)Ji、OC(-X)NJA、NJ3C(-X)NJ山和CN,其中各J"_12和13獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或Nh。在一實施方案中，各#:取代的基團(tuán)獨立地祐:取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OL、NJ口2、SJi、N3、OQ^X)Ji和NJ3C(=X)NJjJ2的，其中各JhJ2和J3獨立地為H、CrQ烷基或取代的d-Q烷基，X是O或Nl。在一實施方案中，Z是CrQ烷基或取代的CVQ烷基。在另一實施方案中，Z是C廣C6烷基。在另一實施方案中，Z是甲基(CHr)。在另一實施方案中，Z是乙基(CH3CH2-)。在另一實施方案中，Z是取代的C廣C6烷基。在另一實施方案中，Z是取代的甲基。在另一實施方案中，Z是取代的乙基。在一實施方案中，該取代基為C廣C6烷氧基(例如，Z是被一或多個C廣C6烷氧基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，該C廣C6烷氧基取代基為CH30-(例如，Z是CH30CH2-)。在另一實施方案中，該C廣C6烷氧基取代基可被進(jìn)一步取代，例如N(W2)CH20-(例如，Z是N(Jj2)CH20CH2-)。在另一實施方案中，該取代基團(tuán)為卣素(例如，Z是被一或多個卣素取代的C!-C6烷基)。在另一實施方案中，該卣素取代基為氟(例如，Z為CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。在另一實施方案中，該取代基為鞋基(例如，Z是被一或多個鞋基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，Z是HOCH2-。在另一實施方案中，Z是CHr、CH3CH2-、-CH2OCH3、-CH2F或HOCH2-。在一實施方案中，Z基團(tuán)為被一個或多個xx取代的C!-C6烷基，其中各xx獨立為OJ"NJ山、SJ!、N3、OC(二X)h、OC(=X)NJltT2、NJ3C(-X)NJ山或CN;其中各Ji、h和J3獨立為H或C廣C6烷基，X是O、S或NJ!。在另一實施方案中，Z基團(tuán)為被一或多個xx取代的d-C6烷基，其中各XX獨立為卣素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)、取代的烷氧基或疊氮基。在一實施方案中，Z基團(tuán)為-CH2XX,其中Xx為OJ!、NJJ2、SJ"N3、OQ^X)L、OC—X)NJ^2、NJ3C^X)NJJ2或CN;其中各^、2和3獨立為11或C廣Q烷基，X是O、S或NJ!。在另一實施方案中，Z基團(tuán)為-CH2XX,其中xx為鹵素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)或疊氮基。在一實施方案中，Z基團(tuán)呈(R)-構(gòu)型在另一實施方案中，Z基團(tuán)呈(S)-構(gòu)型:在一實施方案中，T!和T2分別為雍基保護(hù)基團(tuán)。幾基保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選列表包括苯甲基、苯甲酰基、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、甲磺酸、甲苯磺酸、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃噪呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。在一實施方案中，T!為羥基保護(hù)基團(tuán)，該基團(tuán)選自乙酰、苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基和二甲氧基三苯甲基，其中更優(yōu)選的羥基保護(hù)基團(tuán)T！為4,4，-二甲氧基三苯甲基。在一實施方案中，T2為活性磷基團(tuán)，其中優(yōu)選的活性磷基團(tuán)包括二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺和H-磷酸酯。在一優(yōu)選的實施方案中，T!為4,4，-二甲氧基三苯甲基且丁2為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺。本發(fā)明還提供了寡聚化合物，其具有至少一個具有下式的單體或下式:或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中Bx是雜環(huán)》咸基部分；T3為H、羥基保護(hù)基團(tuán)、聯(lián)接的共軛基團(tuán)或與核普、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核脊間聯(lián)接基團(tuán)；l為H、羥基保護(hù)基團(tuán)、聯(lián)接的共軛基團(tuán)或與核苷、核苷酸、寡核脊、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核普間聯(lián)接基團(tuán)；其中T3和T4中至少一個為與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)；且Z是C廣C6烷基、C2-CV歸基、C2-C6炔基、取代的d-Q烷基、取代的CrC6烯基、取代的CVC6炔基、?；?、取代的?；?、取代的酰胺、疏醇或取代的疏。在一實施方案中，各被取代的基團(tuán)被任選被保護(hù)的取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OJ!、NJ!J2、SJ"N3、OC(-X)JbOC(-X)NJ卩2、NJ3Q^X)NJJ2和CN，其中各^、J2和J3獨立地為H或d-C6烷基，X是O、S或NJi。在一實施方案中，各^皮取代的基團(tuán)獨立地被取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OJ^NJ,J2、SJbN3、OC^X)J!、OC(二X)NJ!J2、和NJ3CtX)NJ^2，其中各h、h和h獨立地為H或C廣C6烷基，X是O或NJlo在一實施方案中，至少一個Z為C!-C6烷基或取代的d-C6烷基。在另一實施方案中，各Z獨立地為d-C6烷基或取代的C廣C6烷基。在另一實施方案中，至少一個Z為C廣C6烷基。在另一實施方案中，各Z獨立地為C廣C6烷基。在另一實施方案中，至少一個z為甲基。在另一實施方案中，各z均為甲基。在另一實施方案中，至少一個z為乙基。在另一實施方案中，各z均為乙基。在另一實施方案中，至少一個Z為取代的C!-C6烷基。在另一實施方案中，各Z分別獨立為取代的d-C6烷基。在另一實施方案中，至少一個z為取代的甲基。在另一實施方案中，各z均為取代的甲基。在另一實施方案中，至少一個z為取代的乙基。在另一實施方案中，各z均為取代的乙基。在一實施方案中，至少一個取代基為CVC6烷氧基(例如，至少一個z是被一或多個C廣C6烷氧基取代的d-Q烷基)。在另一實施方案中，各取代基獨立為C廣C6烷氧基(例如，各Z獨立地為被一或多個C廣C6烷氧基取代的d-C6烷基)。在一實施方案中，至少一個CVQ烷氧基取代基為CH30-(例如，至少一個Z是CH3OCH2-)。在另一實施方案中，各d-C6烷氧基取代基均為CH30-(例如，各Z均為CH3OCH2-)。在一實施方案中，至少一個取代基為卣素(例如，至少一個Z是;^皮一或多個囟素取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，各取代基獨立地為卣素(例如，各Z獨立地為被一或多個鹵素取代的d-C6烷基)。在另一實施方案中，至少一個鹵素取代基為氟(例如，至少一個Z為CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CHr)。在另一實施方案中，各鹵素取代基均為氟(例如，各Z獨立地為CH2FCH2-、CHF2CH24CF3CH2-)。在一實施方案中，至少一個取代基為羥基(例如，至少一個Z是被一或多個羥基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，各取代基獨立地為羥基(例如，各Z獨立地為被一或多個鞋基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，至少一個Z為HOCH2-。在另一實施方案中，各Z均是HOCHr。在一實施方案中，至少一個Z是CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。在另一實施方案中，各Z獨立地為CHr、CH3CHr、CH2OCHr、CH2F畫或HOCH2-。在一實施方案中，至少一個Z基團(tuán)為被一或多個xx取代的d-C6烷基，其中各Xx獨立地為OJ!、J2、SL、N3、OC(二X)h、OC(二X)NJiJ2、N3C(二X)NJ！J2或CN;其中各J!、L和J3獨立地為H或C廣Q烷基，X是O、S或N^。在另一實施方案中，至少一個Z基團(tuán)為被一或多個xx取代的C廣C6烷基，其中各xx獨立地為囟素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH3(D-)或疊氮基。在一實施方案中，各Z基團(tuán)獨立地為被一或多個xx取代的C廣C6烷基，其中各Xx獨立地為OJ!、NJtJ2、SJ!、N3、OC(二X)J！、OC(二X)NJ！J2、NJ3C(二X)NJ！J2或CN;其中各J,、J2和h獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或N^。在另一實施方案中，各Z基團(tuán)獨立地為被一或多個xx取代的C廣Q烷基，其中各XX獨立地為鹵素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)或疊氮基。在一實施方案中，至少一個Z基團(tuán)為-CH2XX,其中Xx為Oh、NJ山、SJ,，、N3、OC(:X)Ji、OC(^X)NJj2、NJ3C(二X)NJJ2或CN;其中各h、2和13獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或NL。在另一實施方案中，至少一個Z基團(tuán)為-CH2XX,其中XX為鹵素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)或疊氮基。在一實施方案中，各Z基團(tuán)獨立地為-CH2XX，其中各xx獨立地為OJi、NJ山、SJ!、N3、OCex)h、OQ^X)NJ,J2、NJ3C(二X)NJ山或CN;其中各J、J2和J3獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或NL。在另一實施方案中，各Z基團(tuán)獨立地為-CH2XX，其中各xx獨立地為鹵素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH3(D-)或疊氮基。在一實施方案中，至少一個Z為CH3-。在另一實施方案中，各Z均是CH3-。在一實施方案中，至少一個單體的Z基團(tuán)是由下式表示的(R)-構(gòu)型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>或下式:或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>在另一實施方案中，具有所述式的各單體的Z基團(tuán)均為(R)-構(gòu)型。在一實施方案中，至少一個單體的Z基團(tuán)是由下式表示的(S)-構(gòu)型:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>或下式:或下式:或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在另一實施方案中，具有所述式的各單體的Z基團(tuán)為(S)-構(gòu)型。在一實施方案中，T3是H或羥基保護(hù)基團(tuán)。在另一實施方案中，T4是H或羥基保護(hù)基團(tuán)。在進(jìn)一步的實施方案中，T3是與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核普間聯(lián)接基團(tuán)。在另一實施方案中，T4是與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。在另一實施方案中，T3是與寡聚核苷或寡聚核苷酸連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。在進(jìn)一步的實施方案中，T4是與寡聚核苷或寡聚核苷酸連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。在一實施方案中，T3是與寡聚化合物連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。在進(jìn)一步的實施方案中，T4是與寡聚化合物連接的核脊間聯(lián)接基團(tuán)。在更進(jìn)一步的實施方案中，T3和T4中至少一個包含了選自磷酸二酯或疏代磷酸酯的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。在一實施方案中，寡聚化合物具有至少一個由至少兩個具有下式的相鄰單體構(gòu)成的區(qū)域或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>或下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>在另一實施方案中，寡聚化合物包含至少兩個由至少兩個具有上式的相鄰單體構(gòu)成的區(qū)域。在另一實施方案中，該寡聚化合物包含了有間隙的(gapped)寡聚化合物。在另一實施方案中，該寡聚化合物包含至少一個由約8至約14個相鄰P-D-2，-脫氧核糖基核苷構(gòu)成的區(qū)域。在進(jìn)一步的實施方案中，該寡聚化合物包含至少一個由約9至約12個相鄰P-D-2'-脫氧核糖基核香構(gòu)成的區(qū)。在一實施方案中，該寡聚化合物包含至少一個由2至3個具有上式的相鄰單體構(gòu)成的區(qū)，任選的由具有上式的1或2個相鄰單體構(gòu)成的第二區(qū)以及由8至14個p-D-2，-脫氧核糖基核苷構(gòu)成的第三區(qū)，其中所述第三區(qū)位于該第一和該第二區(qū)之間。在另一實施方案中，該寡聚化合物包含8至10個(3-D-2，-脫氧核糖基核苷。在本發(fā)明的另一實施方案中，才是供了具有長度為約8至約40個核苷和/或修飾的核苷或模擬物的寡聚化合物。在進(jìn)一步的實施方案中，寡聚化合物包含了約8至約20個核苷和/或修飾的核普或模擬物。在更進(jìn)一步的實施方案中，寡聚化合物包含了約10至約16個核香和/或修飾的核苷或模擬物。在另一實施方案中寡聚化合物包含了約10至約14個核苷和/或修飾的核香或模擬物。本發(fā)明還提供了抑制基因表達(dá)的方法，其包括將一種或多種細(xì)胞、組織或動物與本發(fā)明的寡聚化合物接觸。本發(fā)明提供了6-修飾的雙環(huán)核苷、由其制備的寡聚化合物及組合物、新的合成中間體，以及該核苷、寡聚化合物、組合物和新合成中間體的制備方法。更特定地，本發(fā)明提供了核香，其在具有式2，-0-C(H)(Z)-4，的核糖部分的4，和2'位之間具有橋，以及由該核香制備的寡聚體和組合物。在優(yōu)選的實施方案中，Z具有可形成(R)或(S)異構(gòu)體的特定構(gòu)型。在一些實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物和組合物經(jīng)設(shè)計與靶標(biāo)RNA的部分雜交。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物可用于設(shè)計適體，該適體為能夠在體內(nèi)環(huán)境中結(jié)合異常蛋白的寡聚化合物。本發(fā)明的雙環(huán)核苷可用于增強(qiáng)整合了它們的寡聚化合物的所需性質(zhì)。本發(fā)明的寡聚化合物還可用作診斷應(yīng)用中的引物和探針。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的6-修飾的雙環(huán)核苷具有如下顯示的結(jié)構(gòu)一方面，本發(fā)明提4共了具有式I的雙環(huán)核苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>發(fā)明詳述其中:Bx是雜環(huán)堿基部分;Ti是H或羥基保護(hù)基團(tuán)；T2是H、羥基保護(hù)基團(tuán)或活性磷基團(tuán)；以及Z是C廣C6烷基、C2-C6烯基、CVC6炔基、C廣C6烷基茚基、C3-C6烯基茚基、取代的C廣C6烷基、取代的C2-Q烯基、取代的C2-C6炔基、取代的d-C6烷基茚基、取代的C3-C6烯基茚基、?；?、取代的?；?、取代的酰胺、疏醇、或取代的疏。在一實施方案中，各被取代的基團(tuán)獨立地被任選被保護(hù)的取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自鹵素、氧代、羥基、OJ"NJ山、S^、N3、OC(二X)J!、0Q^X)NJJ2、NJ3C(-X)NJ山和CN，其中各^、2和^獨立地為H或d-C6烷基，X是O、S或N^。在本發(fā)明的一方面中，制備的雙環(huán)核香具有正交保護(hù)的活性基團(tuán)并進(jìn)一步包含活性磷基團(tuán)。該種雙環(huán)核香可用作寡聚體合成的單體。該種雙環(huán)核香單體的示范性例子具有下式其中由虛線框圍繞的基團(tuán)是可變的。在6位的基團(tuán)還可制備為S構(gòu)型(注意，根據(jù)基團(tuán)的不同位置，對R和S的指定可因之而變化)。所顯示的雙環(huán)核脊單體一般被稱為二甲氧基三苯甲基亞磷酰胺，或者更正式地采用IUPAC系統(tǒng)命名法為(18，311，411,611,78)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦酰基]-1-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚坑。本發(fā)明的6-修飾的雙環(huán)核香可用于在一個或多個位置修飾除此以外未經(jīng)修飾的寡聚化合物。該種修飾的寡聚化合物可描述為具有特定的基序。適用于本發(fā)明的基序包括但不限于有間隙的基序、半修飾(hemimer)基序、阻斷修飾(blockmer)基序、全修飾基序、定點修飾基序以及交替基序。結(jié)合這些基序，還可采用多種聯(lián)接方式，包括但不限于統(tǒng)一或組合使用磷酸二酯和疏代磷酸酯聯(lián)接?？珊唵蝺?yōu)化6-修飾的雙環(huán)核苷的定位和聯(lián)接策略的使用以針對特定靶標(biāo)形成最佳活性。指導(dǎo)制備代表性基序的代表性美國專利包括但不限于，5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;以及5,700,922，某些專利為與本申請共同擁有的申請或?qū)＠淙姆謩e在此引用作為參考。基序還披露于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公布為WO2005/121371的國際申請PCT/US2005/019219以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公布為WO2005/121372的PCT/US2005/019220;其全文分別在此引用作為參考。術(shù)語"穩(wěn)定的化合物"和"穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)"指具有足夠穩(wěn)固性可從反應(yīng)混合物分離至有用的純度，并制成有效的治療劑的化合物。本發(fā)明僅預(yù)期穩(wěn)定的化合物。此處描述的化合物中選定的取代基以遞歸度表示。上下文中的"遞歸取代基"指一個耳又代基可以引用其本身的另一實例。由于該種3f又代基的遞歸性，理論上，在任意給定權(quán)利要求中可出現(xiàn)大量取代基。醫(yī)藥化學(xué)和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可理解該種取代基的總數(shù)受到靶標(biāo)化合物的預(yù)期屬性的合理限定。該種屬性包括，例如但不限于，分子量、溶解性或logP等物理屬性，靶向目的靶標(biāo)的活性等應(yīng)用屬性，以及合成容易度等操作屬性。遞歸取代基為本發(fā)明的目標(biāo)方面。醫(yī)藥和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解這樣的取代基的多功能性。在本發(fā)明的權(quán)利要求所示的遞歸取代基的程度下，可根據(jù)上文所述確定其總數(shù)。此處所用的術(shù)語"烷基"指含有最多二十四個碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基。烷基基團(tuán)的實例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基團(tuán)通常包含l至約24個碳原子，更通常包含1至約12個碳原子(C廣C,2烷基)，更優(yōu)選包含1至約6個碳原子。此處所用的術(shù)語"低級烷基"包含1至約6個^5友原子。此處所用的烷基可任選地包含一個或多個進(jìn)一步的耳又代基。此處所用的術(shù)語"蜂基"指含有最多二十四個碳原子并至少具有一個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基。烯基基團(tuán)的實例包括，但不限于，乙烯基、丙烯基、丁烯基、l-甲基-2-丁烯-l-基、如1,3-丁二烯的二烯等。烯基基團(tuán)通常包含2至約24個^_原子，更通常包含2至約12個碳原子，更優(yōu)選包含2至約6個碳原子。此處所用的烯基可任選地包含一個或多個進(jìn)一步的取代基。此處所用的術(shù)語"炔基"指含有最多二十四個^_原子并至少具有一個石炭-石友三鍵的直鏈或支鏈烴基。炔基基團(tuán)的實例包括，但不限于，乙炔基、l-丙炔基、l-丁炔基等。炔基基團(tuán)通常包含2至約24個^5友原子，更通常包含2至約12個碳原子，更優(yōu)選包含2至約6個碳原子。此處所用的炔基可任選地包含一個或多個進(jìn)一步的取代基。此處所用的術(shù)語"氨烷基"指氨基取代的烷基。該術(shù)語包括了在任何位置具有氨基取代基的CVd2烷基基團(tuán)，其中該烷基基團(tuán)將氨烷基連接至母體分子。氨烷基基團(tuán)的烷基和/或氨基部分可以被取代基進(jìn)一步取代。此處所用的術(shù)語"脂肪族"指最多包含二十四個^f友原子的直鏈或支鏈烴基，其中任意兩個碳原子之間的飽和度為單、雙或三鍵。脂肪族基團(tuán)優(yōu)選包含1至約24個碳原子，更通常包含1至約12個碳原子，更優(yōu)選包含1至約6個碳原子。脂肪族基團(tuán)的直鏈或支鏈可被包括氮、氧、硫和磷等的一個或多個雜原子所中斷。該種被雜原子中斷的脂肪族基團(tuán)包括但不限于聚烷氧基，例如聚亞烷基二醇、聚胺和聚亞胺。此處所用的脂肪族基團(tuán)可任選地包括其它取代基。術(shù)i吾"脂環(huán)族的"指環(huán)狀的環(huán)系統(tǒng)，其中該環(huán)為脂肪族環(huán)。該環(huán)系統(tǒng)可包含一個或多個環(huán)，其中至少一個環(huán)為脂肪族環(huán)。優(yōu)選的脂肪環(huán)包括環(huán)中具有約5至約9個碳原子的環(huán)。此處所用的脂肪環(huán)可任選地包括其它取代基團(tuán)。此處所用的術(shù)i吾"烷氧基"指在烷基基團(tuán)和氧原子之間形成的基，其中該氧原子用于連接烷氧基基團(tuán)和母體分子。烷氧基基團(tuán)的實例包括，但不限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。此處所用的烷氧基基團(tuán)可任選地包括其它取代基團(tuán)。此處所用的術(shù)語"卣素"指選自氟、氯、溴和碘的原子。此處所用的術(shù)語"芳基"和"芳香族的"指具有一個或多個芳環(huán)的單或多環(huán)碳環(huán)系統(tǒng)的基團(tuán)。芳基基團(tuán)的例子包括，但不限于，苯基、萘基、四氫化萘基、茚滿基、茚基等。優(yōu)選的芳基環(huán)系統(tǒng)在一個或多個環(huán)中具有約5至約20個^_原子。此處所用的芳基基團(tuán)可任選地包括其它取代基團(tuán)。此處所用的術(shù)語"芳烷基"指在烷基基團(tuán)和芳基基團(tuán)之間形成的基，其中該烷基基團(tuán)可用于連接芳烷基基團(tuán)和母體分子。例子包括，但不限于，苯甲基、苯乙基等。此處所用的芳烷基基團(tuán)可任選地包括與烷基、芳基或兩者連接以形成基團(tuán)的取代基。此處所用的術(shù)語"雜環(huán)基"指包括至少一個雜原子并且是不飽和、部分飽和或完全飽和的單或多環(huán)的環(huán)系統(tǒng)基團(tuán)，因而包括了雜芳基。雜環(huán)還包括融合環(huán)系統(tǒng)，其中一種或多個融合環(huán)包含至少一個雜原子而其它環(huán)可包含一個或多個雜原子或任選地不包含雜原子。雜環(huán)基團(tuán)通常包括至少一個選自石克、氮或氧的原子。雜環(huán)基團(tuán)的實例包括，[1，3]二惡茂烷、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唾啉基、。米唾烷基、哌啶基、哌噪基、噪唾烷基、異噪唾烷基、嗎啉基、四氫噻唑基、異四氫噻唑基、喹喔啉基、噠溱酮基、四氫呋喃基等。此處所用的雜環(huán)基團(tuán)可任選地包括其它取代基。此處所用的術(shù)i吾"雜芳基"和"雜芳香族的"指包含單或多環(huán)芳環(huán)、環(huán)系統(tǒng)或融合環(huán)系統(tǒng)的基，其中至少一個環(huán)為芳環(huán)且包括一個或多個雜原子。雜芳基還包括例如融合環(huán)系統(tǒng)，其包含一個或多個不含雜原子的融合環(huán)的系統(tǒng)。雜芳基通常包括選自疏、氮或氧的一個環(huán)原子。雜芳基的例子包括，但不限于，吡啶基、吡。秦基、嗜啶基、吡p各基、吡唑基、。米唑基、瘞唑基、噪唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯疏基、呋喃基、四氬喹啉基、異四氫唾啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。雜芳基可直接或通過脂肪族基團(tuán)或雜原子等連接部分連接至母體分子。此處所用的雜芳基任選地包括其它取代基。此處所用的術(shù)語"雜芳烷基"指具有可將雜芳烷基基團(tuán)連接至母體分子的烷基的如前文定義的雜芳基。例子包括，但不限于，吡啶甲基、嗜啶乙基、27萘啶基丙基等。此處所用的雜芳烷基基團(tuán)可在雜芳環(huán)或烷基部分的一個或兩者上任選地包括其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中采用的術(shù)語"單或多環(huán)結(jié)構(gòu)"包括具有融合或聯(lián)接的環(huán)的單或多環(huán)的所有環(huán)系統(tǒng)，并包括獨立選自脂肪族、脂環(huán)族族、芳基、雜芳基、芳烷基、雜環(huán)、雜芳基、雜芳香族、雜芳烷基的單環(huán)和混合環(huán)系統(tǒng)。該種單或多環(huán)結(jié)構(gòu)可包含一致或變化的飽和度(包括完全飽和、部分飽和或完全不飽和)的環(huán)。各個環(huán)可包含選自C、N、O和S的環(huán)原子以形成雜環(huán)以及僅含有C環(huán)原子的環(huán)，其可表示為混合基序，例如，苯并咪唑，其中一個環(huán)僅具有石友環(huán)原子而融合環(huán)具有兩個氮原子。單或多環(huán)結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步被取代基取代，例如，具有連接至其中一個環(huán)的兩個=0基的鄰苯二甲酰亞胺。在另一方面，單或多環(huán)結(jié)構(gòu)可直接通過環(huán)原子，通過取代基或雙功能連接部分連接到母體分子。此處所用的術(shù)語"?；?指從有機(jī)酸去除羥基基團(tuán)并具有通式-C(O)-X的基團(tuán)，其中X通常為脂肪族、脂肪環(huán)族或芳香族。例子包括脂肪族羰基、芳香羰基、脂肪磺?；?、芳香亞磺?；?、脂肪族亞磺酰基、芳香磷酸酯、脂肪族磷酸酯。此處所用的?；鶊F(tuán)可任選地包括其它取代基。術(shù)語"烴基"包括包含C、O、H的基團(tuán)。包括具有任意飽和度的直鏈、支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。這樣的烴基基團(tuán)可包括一個或多個選自N、O和S的雜原子并可進(jìn)一步被一或多個取代基單或多取代。此處所用的術(shù)語"取代基"包括通常添加至其它基團(tuán)或母體化合物以增強(qiáng)所需性質(zhì)或產(chǎn)生所需效果的基團(tuán)。取代基可以是保護(hù)的或未保護(hù)的，并可添加至母體化合物的一個或多個可能的位點。取代基還可進(jìn)一步被其它取代基所取代并且可以直接或通過聯(lián)接基團(tuán)(例如烷基或烴基基團(tuán))連接至母體化合物。該種基團(tuán)包括但不限于卣素、羥基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂肪族基團(tuán)、脂肪環(huán)族基團(tuán)、烷氧基、取代的氧代(-O-Raa)、芳基、芳烷基、雜環(huán)基、雜芳基、雜芳烷基、氨基(-NRbbRce)、亞氨基(-NRbb)、氨基(-C(O)N-RbbRcc或-N(Rbb)C(O)Raa)、疊氮基(-化)、硝基(-N02)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O)NRbbRee或-N(Rbb)C(0)ORJ、脲基(-N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、疏脲基(-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、胍基(-N(Rbb)C—NRbb)NRbbRcc)、amidinyl(-C(=NRbb)NRbbRce或-N(Rbb)C(NRbb)Raa)、硫醇(-SRbb)、亞磺酰基(-S(0)Rbb)、磺?；?-S(0)2RH)、磺酰氨基(-S(0)2NRbbR^或-N(RHbb)-S(0)2Rbb)以及共軛基團(tuán)。其中Raa、Rbb和Rcc分別獨立為H，任選聯(lián)接的化學(xué)功能基團(tuán)或進(jìn)一步的取代基，其優(yōu)選列表包括但不限于H、烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、?；?、芳基、芳烷基、雜芳環(huán)、脂環(huán)族、雜環(huán)基和雜芳烷基。術(shù)語"氧代"指基團(tuán)(=0)。此處所述的化合物(例如，雙環(huán)核苷)可通過例如，如下文實施例所示的任意有機(jī)合成的適用技術(shù)進(jìn)行制備。眾多該類技術(shù)已為本領(lǐng)域公知。多種已知技術(shù)歹'J舉于CompendiumofOrganicSyntheticMethods(JohnWiley&Sons,NewYork)第1巻,IanT.Harrison和ShuyenHarrison(1971);第2巻,IanT.Harrison和ShuyenHarrison(1974);第3巻,LouisS.Hegedus和LeroyWade(1977);第4巻，LeroyG.WadeJr.,(1980);第5巻，LeroyG.WadeJr.(1984);和第6巻，MichaelB.Smith;以及March,J.,AdvancedOrganicChemistry,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork(1985);ComprehensiveOrganicSynthesis.Selectivity,Strategy&EfficiencyinModernOrganicChemistry,第9巻中,BarryM.Trost主編,PergamonPress,NewYork(1993);AdvancedOrganicChemistry,PartB:ReactionsandSynthesis,第4版；Carey和Sundberg;KluwerAcademic/PlenumPublishers:NewYork(2001);AdvancedOrganicChemistry,Reactions,Mechanisms,andStructure,第2版,March,McGrawHill(1977);ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,第2版,Greene,T.W.，和Wutz，P.G.M.,JohnWiley&Sons,NewYork(1991);以及ComprehensiveOrganicTransformations,第2版，Larock,R.C.,JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。在本發(fā)明的一方面中，寡聚化合物可通過共價連接一個或多個共軛基團(tuán)進(jìn)行修飾。一般而言，共軛基團(tuán)可修飾所連接的寡聚化合物的一種或多種屬性，包括但不限于，藥效動力學(xué)、藥代動力學(xué)、結(jié)合、吸收、細(xì)胞分布、細(xì)胞攝取、儲存和清除。共軛基團(tuán)常用于化學(xué)領(lǐng)域并直接或通過任選聯(lián)接部分或聯(lián)接基團(tuán)聯(lián)接至諸如寡聚化合物等的母體化合物。共軛基團(tuán)的優(yōu)選列表包括但不限于，嵌入劑、報告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、疏醚、聚醚、膽固醇、疏膽固醇、膽酸部分、葉酸、脂肪、磷脂、生物素、吩溱、菲啶、蒽醌、金剛烷、吖啶、熒光素、若丹明、香豆素和染料。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的聯(lián)接基團(tuán)或雙功能聯(lián)接部分可適用于本發(fā)明。聯(lián)接基團(tuán)可用于將化學(xué)功能基團(tuán)、共軛基團(tuán)、報告基團(tuán)和其它基團(tuán)連接至如寡聚化合物等母體化合物的選擇性位點。一般而言，雙功能聯(lián)接部分包含具有兩個功能基團(tuán)的烴部分。功能性基團(tuán)之一被選擇用于結(jié)合母體分子或乾標(biāo)化合物，而另一基團(tuán)被選擇用于主要結(jié)合任意選定基團(tuán)，例如化學(xué)功能性基團(tuán)或共軛基團(tuán)。在一些實施方案中，該接頭包含重復(fù)單元例如乙二醇或氨基酸單元的鏈結(jié)構(gòu)或寡聚體。在雙功能聯(lián)接部分中常用的功能基團(tuán)的實例包括，但不限于，用于與親核基團(tuán)反應(yīng)的親電試劑以及用于與親電基團(tuán)反應(yīng)的親核試劑。在一些實施方案中，雙功能聯(lián)接部分包括氨基、鞋基、羧酸、疏醇、不飽和性(例如，雙或三鍵)等。雙功能聯(lián)接部分的部分非限制性實例包括8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-l-羧酸(SMCC)以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它的聯(lián)接基團(tuán)包括但不限于，取代的Q-do烷基、取代的或未取代的C2-Cu)烯基或取代的或未取代的C2-C10炔基，其中優(yōu)選取代基的非限制性列表包括羥基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、疏醇、疏烷氧基、囟素、烷基、芳基、烯基以及炔基。此處所用的術(shù)i吾"保護(hù)性基團(tuán)"指如下所述的化學(xué)部分，其在本領(lǐng)域中已知可針對合成過程中不希望出現(xiàn)的反應(yīng)來保護(hù)反應(yīng)性基團(tuán)(包括但不限于幾基、氨基和疏醇基等)。保護(hù)性基團(tuán)通?？梢赃x擇性和/或正交采用以在其它活性位點的反應(yīng)中保護(hù)位點，并可隨后去除以留下不受保護(hù)的基團(tuán)或供進(jìn)一步反應(yīng)。本領(lǐng)i或已知的4呆護(hù)性基團(tuán)一般描述于Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版，JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。基團(tuán)可作為前體選擇性地結(jié)合至本發(fā)明的寡聚化合物。例如氨基基團(tuán)可作為疊氮基團(tuán)結(jié)合進(jìn)本發(fā)明的化合物，并可在合成中理想的時間點被化學(xué)轉(zhuǎn)化為氨基基團(tuán)。一般來說，基團(tuán)可被保護(hù)或作為前體存在，其對于修飾母體分子其它部位的反應(yīng)呈現(xiàn)惰性，以在適當(dāng)?shù)臅r間轉(zhuǎn)化成為其最終的基團(tuán)。其它代表性保護(hù)或前體基團(tuán)的討論參見Agrawal,等人，ProtocolsforOligonucleotideConjugates,Eds,HumanaPress;NewJersey,1994;第26巻，第1-72頁。羥基保護(hù)基團(tuán)的實例包括，但不限于，乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、對氯苯基、2,4-二硝基苯基、苯甲基、2,6-二氯苯甲基、二苯基甲基、對硝基苯甲基、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基硅烷基乙基、三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三苯甲基硅烷基、[(三異丙基硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰甲酸鹽、氯乙?；?、三氯乙酰基、三氟乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基、對苯基苯甲酰基、9-剪甲基碳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三苯甲基(trityl)、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。其中優(yōu)選的羥基保護(hù)基團(tuán)包括但不限于，苯甲基、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、苯甲?；?、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃噤呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃噤呤-9-基(MOX)。氨基保護(hù)基團(tuán)的實例包括但不限于，氨基甲酸鹽保護(hù)基團(tuán)，例如，2-三甲基硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、l-甲基-l-(4-聯(lián)苯基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴甲基甲基氧基羰基(Fmoc)、以及苯甲基氧基羰基(Cbz);酰胺保護(hù)基團(tuán)，例如甲?；?、乙?；⑷沾阴；?、苯甲?；?、以及硝基苯基乙酰基；磺酰胺保護(hù)基團(tuán)，例如2-硝基苯磺?；灰约皝啺泛铜h(huán)狀酰亞胺保護(hù)基團(tuán)，例如苯二甲酰亞胺和二石克琥珀?；Ｊ璐急Ｗo(hù)基團(tuán)的實例包括，但不限于，三苯甲基(trityl)、苯甲基(Bn)等。在一些優(yōu)選的實施方案中，可以用任選被保護(hù)的含磷核苷間聯(lián)接來連接核苷從而制備寡聚化合物。含磷核香間聯(lián)接(例如磷酸二酯和硫代磷酸酯聯(lián)接)的代表性保護(hù)基團(tuán)包括P-氰乙基、二苯基硅烷基乙基、S-氰丁烯基、氰對二甲苯基(CPX)、N-甲基-N-三氟乙酰乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE)以及丁烯-4-基基團(tuán)。例如參見美國專利號4,725,677以及Re.34,069(p-氰乙基);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,49No.10,第1925-1963頁(1993);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,49No.46,第10441-10488頁(1993);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,48No.12，第2223-2311頁(1992)。此處所用的術(shù)語"正交保護(hù)"指以不同類別的保護(hù)性基團(tuán)保護(hù)的功能基團(tuán)，其中各類保護(hù)性基團(tuán)可以按任意順序并在所有其它類別存在的情況下去除(例如，Barany,G.和Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc,1977,99,7363;idem,1980,102,3084.)。正交保護(hù)已在例如自動寡核普酸合成等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。功能基團(tuán)可在一種或多種不受去阻斷過程影響的其它被保護(hù)功能基團(tuán)的存在下被去阻斷。該被去阻斷的功能基團(tuán)以某種形式反應(yīng)，且在某一時間點另一正交保護(hù)性基團(tuán)在一組不同反應(yīng)條件下被去除。這使得可以用選擇性化學(xué)法獲得所需的化合物或寡聚化合物。本發(fā)明提供了具有可用于形成核香間聯(lián)接(包括例如磷酸二酯和疏代磷酸酯核苷間聯(lián)接)的活性磷基團(tuán)的化合物。該種活性磷基團(tuán)已為本領(lǐng)域所知并包含處于Pin或Pv價態(tài)的磷原子，包括但不限于亞磷酰胺、H-磷酸酯、磷酸三酯和含磷手性助劑。優(yōu)選的合成的固相合成采用亞磷酰胺(P111化學(xué))作為反應(yīng)性亞磷酸。在優(yōu)選的實施方案中，中間體亞磷酸化合物隨后通過已知的方法被氧化至pv狀態(tài)以獲得磷酸二酯或疏代磷酸酯核苷酸間聯(lián)接。其它的活性磷酸酉旨牙口亞石粦酸才皮露于TetrahedronReportNumber309(Beaucage牙口Iyer,Tetrahedron,1992，48,2223-2311)。可用于本發(fā)明的寡聚化合物的特定實例包括含有修飾的例如非天然的核要類別。具有磷原子的修飾的核苷間聯(lián)接包括，但不限于，疏代磷酸酯、手性疏代磷酸酯、二疏代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯包括3，-亞烴基磷酸酯、5，-亞烴基磷酸酯以及手性磷酸酯、亞磷酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基碌酸酯、疏羰基氨基磷酸酯、疏羰基烷基磷酸酯，疏羰基烷基磷酸三酯、具有正常3，-5，鍵的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、它們的2'-5'聯(lián)接的類似物，以及具有反轉(zhuǎn)極性的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其中一種或多種核香酸間聯(lián)接為3'至3'、5'至5'或2'至2'聯(lián)接。具有反轉(zhuǎn)極性的寡核脊酸可在3'-最末端核普酸間聯(lián)接包含單個3，至3'聯(lián)接，即，可能是無堿基(核苷堿基缺失或該位置被鞋基取代)的單個反轉(zhuǎn)核苷殘基?？砂ǘ喾N鹽、混合鹽和游離酸的形式。指導(dǎo)制備上述含磷聯(lián)接的代表性美國專利包括但不限于，美國專利號3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5，399，676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;5,194,599;5,565,555;5,527,899;5,721,218;5,672,697以及5,625,050，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。不具有磷原子的修飾的核苷間聯(lián)接包括但不限于，由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間聯(lián)接、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間聯(lián)接，或者一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間聯(lián)接構(gòu)成的核苷間聯(lián)接。這包括具有硅氧烷骨架；疏化物，亞砜和砜骨架；甲縮醛和辟u甲縮醛骨架;亞甲基甲縮醛和石克甲縮醛骨架;核糖乙酰骨架;含烯烴骨架；氨基磺酸鹽骨架;亞甲基亞胺和亞甲基肼基骨架;磺酸鹽和磺酰胺骨架;酰胺骨架;和其它具有混合的N，O，S和CH2的組成部分的核苷間聯(lián)接。指導(dǎo)制備上述寡核苷酸的代表性美國專利包括但不限于，美國專利號5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269以及5，677,439，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。此處描述的化合物包含一個或多個不對稱中心，并因此形成了對映體、非對映體以及其它立體異構(gòu)形式，其從絕對立體化學(xué)的角度可定義為(R)-或(S)-、a或p、或(D)-或(L)-(如氨基酸)。本發(fā)明意在包括所有這些可能的異構(gòu)體，以及它們的外消旋和光學(xué)純形式。光學(xué)異構(gòu)體可通過上述的過程由其相應(yīng)的光學(xué)活性前體制備，或通過拆分外消旋混合物進(jìn)行制備。該種拆分可在拆分劑的存在下，通過色譜或重復(fù)結(jié)晶或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些技術(shù)的組合進(jìn)行。有關(guān)拆分進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可參見Jacques,等人，Enantiomers，Racemates,andResolutions(JohnWiley&Sons,1981)。當(dāng)此處所述的化合物包含烯烴雙鍵、其它不飽和性或其它幾何不對稱中心時，除非另行指明，該化合物意在同時包括E和Z幾何異構(gòu)體或順式-和反式-異構(gòu)體。同樣地，同樣意在包括所有的互變異構(gòu)形式。此處所示的任意碳-碳雙鍵的構(gòu)型僅為便利目的選擇，若非文中指明，并非意在指定特定的構(gòu)型；因此，此處任意描述的碳-碳雙鍵或碳-雜原子雙鍵可以是順式、反式或任意比例的兩者的混合物。本發(fā)明的上下文中的術(shù)語"寡聚化合物"指具有至少一個能與核酸分子雜交的區(qū)域的聚合物。術(shù)語"寡聚化合物"包括寡核苷酸、寡核苷酸類似物和寡核苷以及核苷酸模擬物和/或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。寡聚化合物通?？删€性制備，但可連接或以其它方式制備成環(huán)狀，且還可包括分支。寡聚化合物可形成雙鏈構(gòu)建4本，例如，雜交形成雙鏈組合物的雙鏈。該雙Mi旦合物可連接或分離并可在末端包含懸端(overhangs)。一般而言，寡聚化合物包含聯(lián)接的單體亞基的骨架，其中每個聯(lián)接的單體亞基直接或間接地連接至雜環(huán)堿基部分。寡聚化合物還可包括未聯(lián)接至雜環(huán)堿基部分的單體亞基，從而提供非堿基位點。這些聯(lián)接連接單體亞基、糖部分或替代物，且該雜環(huán)堿基部分可被獨立修飾。包括或不包括雜環(huán)堿基的聯(lián)接-糖單元可被肽核酸單體等模擬物取代。在寡聚化合物的各個位點修飾或取代部分或全部單體的能力可形成大量可能的基序。如本領(lǐng)域所知，核苷是堿基-糖組合。核普的堿基部分通常為雜環(huán)堿基部分。該種雜環(huán)堿基最常見的兩種類別為噤呤和嘧啶。核苦酸為進(jìn)一步包括了共價聯(lián)接至核苷糖部分的磷酸基團(tuán)的核苷。對于包含了呋喃戊糖的核香，該磷酸基團(tuán)可被聯(lián)接至糖的2'、3'或5'羥基部分。在形成聚核苷酸時，該磷酸基團(tuán)共價聯(lián)接彼此相鄰的核苷以形成線性聚合化合物。該線性聚合結(jié)構(gòu)的相應(yīng)末端可被連接以通過雜交或通過形成共價鍵得到環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然而，通常希望開放的線性結(jié)構(gòu)。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)中，磷酸基團(tuán)通常形成寡核苷酸的核苷間聯(lián)接。RNA和DNA的常見核香間聯(lián)接為3'至5'磷酸二酯聯(lián)接。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"寡核苷酸"指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或聚合物。該術(shù)語包括由天然存在的核苷堿基、糖和共價核香間聯(lián)接構(gòu)成的寡核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸類似物"指具有一個或多個非天然存在部分的寡核苷酸。該種非天然存在的寡核普酸由于其具有理想的性質(zhì)而通常比天然存在的形式更理想，例如，提高的細(xì)胞攝取，對核酸耙標(biāo)增強(qiáng)的親和力以及在核酸酶存在下提高的穩(wěn)定性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"寡核苷，，指由不帶磷原子的核普間聯(lián)接連接的核苷序列。該種類型的核普間聯(lián)接包括短鏈烷基、環(huán)烷基、混合雜原子烷基、混合雜原子環(huán)烷基、一或多種短鏈雜原子以及一或多種短鏈雜環(huán)。這些核苷間聯(lián)接包括，但不限于，硅氧烷、疏化物、亞砜、砜、乙?；?、甲縮醛、疏甲縮醛、亞甲基甲縮醛、碌u甲縮醛、烯基、氨基磺酸鹽、亞甲基亞胺基、亞甲基肼基、磺酸鹽、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、O、S和CH2的組成部分的核普間聯(lián)接。指導(dǎo)制備上述寡核苷酸的代表性美國專利包括但不限于，美國專利號5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269以及5,677,439，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。此處所用的術(shù)語"核香堿基"或"雜環(huán)堿基部分"意在與"核酸堿基或其模擬物"同義。一般而言，核苷堿基為含有一個或多個能與核酸堿基氫聯(lián)接結(jié)合的原子或原子組合的任意結(jié)構(gòu)。此處所用的"未修飾的"或是"天然的"核苷堿基包括噤呤堿基腺噤呤(A)和鳥嘌呤(G),以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嗜啶(U)。修飾的核苷堿基包括其它合成的和天然的核苷堿基，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃噤呤、2-氨基腺噤呤、腺噤呤和鳥噤呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺噤呤和鳥噤呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-疏代尿嘧啶、2J克代胸腺嘧啶和2J克代胞嘧啶、5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C^C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嗜啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-疏代尿嘧啶、8-卣代、8-氨基、8-疏醇、8-疏代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺噤呤和鳥噤呤、5-卣代特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥噤呤和7-甲基腺噤呤、2-F-腺噤呤、2-氨基-腺"票呤、8-氮雜鳥噪呤和8-氮雜腺噪呤、7-去氮鳥噤呤和7-去氮腺噤呤、3-去氮鳥噪呤和3-去氮腺噤呤、通用i威基、疏水》威基、混雜堿基、大小擴(kuò)增堿基以及此處定義的氟化堿基。其它修飾的核脊堿基包括三環(huán)嘧啶如吩噁嗪胞啶(lH-嘧啶并[5，4-b][l,4]苯并噁"秦-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(lH-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻喚-2(3H)-酮)、G型夾(G-clamps)例如取代的吩噁嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、呼唑胞啶(2H-嘧啶并[4,5-b]"引咮-2-酮)、吡啶吲哚胞啶(H-吡啶[3，,2，:4,5]吡咯并[2,3-d]嗜啶-2-酮)。修飾的核苷堿基還可包括以其它雜環(huán)取代噤呤或嘧啶堿基的核苷堿基，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核苷堿基包括披露于美國專利3,687,808的核苷堿基，披露于TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,第858-859頁,Kroschwitz,J丄編，JohnWiley&Sons,1990的核普石威基；披露于Englisch等人，AngewandteChemie,InternationalEdition,1991，30,613的才亥苦石威基；以及才皮露于Sanghvi,Y.S.,第15章，AntisenseResearchandApplications,第289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編，CRCPress,1993的核苷堿基。修飾的核普堿基包括，但不限于，此處定義的通用堿基、疏水堿基、混雜堿基、大小擴(kuò)增堿基以及氟化堿基。這些核普堿基中部分可特別用于提高本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力。這包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的噤呤，包括2-氨基丙基腺噤呤、5-丙炔基尿嘧咬和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已顯示可以提高核酸雙鏈穩(wěn)定性0.6誦1.2。C(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.牙口Lebleu,B.編,AntisenseResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993,第276-278頁)并且是目前優(yōu)選的石威基取代基，特別是在與2，-0-甲氧基乙基糖修飾組合時。38指導(dǎo)制備某些上述提到的修飾核苷堿基以及其它修飾的核普堿基的代表性美國專利包括，但不限于，上述美國專利3,687,808以及美國專利4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;5,645,985;5,830,653;5,763,588;6,005,096;以及5,681,941,其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考；以及美國專利5,750,692，其為與本申請共同擁有的專利，并在此引用作為參考。本發(fā)明的寡聚化合物還可包含一種或多種具有修飾糖部分的核苷。呋喃基糖環(huán)可以多種方式修飾，包括以取代基取代，橋連形成BNA以及以S或N(R)等雜原子取代4'-0。指導(dǎo)該種修飾糖的制備的部分代表性美國專利包括，但不限于，美國專利4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;5,792,747;5,700,920;6,600,032以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22曰公布為WO2005/121371的國際申請PCT7US2005/019219,其中一部分為與本申請共同擁有的申請或?qū)＠魑墨I(xiàn)全文在此引用作為參考。優(yōu)選的修飾糖的代表性列表包括但不限于具有2'-F、2，-OCH2或2，-0(CH2)2-OCH3取代基的取代糖；4，-疏代修飾的糖以及雙環(huán)修飾的糖。此處所用的術(shù)語"核苷模擬物"意在包括那些用于替換寡聚化合物的一個或多個位點的糖或非聯(lián)接的糖和堿基的結(jié)構(gòu)，例如，具有嗎啉或雙環(huán)[3丄0]己基糖模擬物(例如，具有磷酸二酯聯(lián)接的非呋喃糖)的核香模擬物。術(shù)語"糖替代物"與含義更廣的術(shù)語"核苷模擬物"略微重疊，但僅指糖單元(呋喃糖環(huán))的替換。術(shù)語"核苷酸模擬物"意在包括用于替換寡聚化合物的一個或多個位點的核香和聯(lián)接的結(jié)構(gòu)，例如，肽核酸或嗎啉(被-N(H)-C^O)-0-或其它非-磷酸二酯聯(lián)接的嗎啉)。如本發(fā)明所述的寡聚化合物可包含長度從約8至約80個的核普和/或修飾核苷或模擬物。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將可理解本發(fā)明包含長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為長度8至40個的核普和/或修飾核普或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將可理解其可具體為長度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為長度8至20個的核苦和/或修飾核苷或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將可理解其可具體為長度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或其中任意范圍的核普和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為長度10至16個的核普和/或修飾核苷或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將可理解其可具體為長度是IO、11、12、13、14、15或16或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為長度10至14個的核苷和/或修飾核苷或模擬物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將可理解其可具體為長度是IO、11、12、13或14個或其中任意范圍的核苷和/或修飾核香或模擬物的寡聚化合物。嵌合寡聚化合物在兩個或多個位置具有不同的修飾的核苷并通常定義為具有基序。本發(fā)明的嵌合寡聚化合物可形成上述兩個或多個寡核脊酸、寡核苷酸類似物、寡聚核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。指導(dǎo)制備這樣雜交結(jié)構(gòu)的代表性美國專利包括，但不限于，美囯專利5,013,830;5，149，797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;以及5,700,922，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。本發(fā)明的一方面中，修飾和未修飾的核苷及其模擬物可參照文獻(xiàn)描述的針對DNA(ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,Ed.Agrawal(1993),HumanaPress)和/或RNA(Scaringe,Methods(2001),23,206-217;Gait等人,ApplicationsofChemicallysynthesizedRNAinRNA:ProteinInteractions,Ed.Smith(1998),1-36;Gallo等人，Tetrahedron(2001),57,5707-5713)合成的適當(dāng)方法進(jìn)行寡聚。固相合成的其它方法可參見Caruthers的美國專利4,415,732;4,458,066;4,500,707;4,668,777;4,973,679;和5,132,418;以及Koster的美國專利4,725,677和Re.34,069。常規(guī)用于基于支持基質(zhì)合成寡聚化合物和相關(guān)化合物的的商業(yè)可獲取設(shè)備已由多家供應(yīng)商出售，包括，例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。本領(lǐng)域已知的任何其它該類合成方法均可另外或替代性采用。適用的固相技術(shù)(包括自動合成技術(shù))的描述可見F.Eckstein(編)，OligonucleotidesandAnalogues,aPracticalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork(1991)。隨著對RNAi-投入的增加，RNA和相關(guān)類似物的合成相對于DNA和相關(guān)類似物的合成也逐漸增加。目前在商業(yè)上采用的初級RNA合成策略包括5'-0-DMT-2，-0-叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、5，-0-DMT-2，-0-[l(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP)、2，-0-[(三異丙基硅烷基)氧基]甲基(2，-0-CH2-0-Si(iPr)3(TOM)、以及5'-0-硅醚-2，-ACE(5，-0-二(三甲基硅氧基)環(huán)十二烷氧基硅醚(DOD)-2，-0-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前提供RNA產(chǎn)品的主要的公司包括PierceNucleicAcidTechnologies、DharmaconResearch乂〉司、AmeriBiotechnologies乂>司禾口IntegratedDNATechnologies乂>司。PrincetonSeparations公司正在推廣RNA合成活化劑，該活化劑才居宣傳可以特別針對TOM和TBDMS化學(xué)法減少偶合次數(shù)。該種活化劑也適用于本發(fā)明。用于商業(yè)RNA合成的初級基團(tuán)為TBDMS=5'-0-DMT-2，-0-叔丁基二甲基硅烷基；TOM=2'-0-[(三異丙基硅烷基)氧基]甲基；DOD/ACE=(5，-0-二(三甲基硅氧基)環(huán)十二烷氧基硅醚-2，-0-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基FPMP=5，-0-DMT-2，-0-[l(2-氟苯基)-4-甲氧基派啶-4-基]。所有前述的RNA合成策略均適用于本發(fā)明。上述策略的混合(例如，采用一種策略中的5'-保護(hù)基團(tuán)和另一策略中的2，-0-保護(hù)基團(tuán))通?？筛鶕?jù)本發(fā)明而調(diào)整。在本發(fā)明的上下文中，"雜交"指寡聚化合物互補(bǔ)鏈的配對。在本發(fā)明中，一種配對機(jī)制涉及寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷堿基)之間的氫4建結(jié)合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氳鍵結(jié)合。例如，腺噪呤和胸腺嘧啶為通過形成氫鍵進(jìn)行配對的互補(bǔ)核普堿基。雜交可在多種條件下進(jìn)行。當(dāng)寡聚化合物與耙標(biāo)核酸的結(jié)合干擾耙標(biāo)核酸的正常功能引起活性損失，且當(dāng)具有足夠程度的互補(bǔ)性以在希望產(chǎn)生特定結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療時在生理條件下，以及在進(jìn)行體外測定時在測定條件下)避免寡聚化合物和非靶標(biāo)核酸序列的非特異性結(jié)合時，寡聚化合物具有特異可雜交性。此處所用的"互補(bǔ)性"指兩個核苷堿基無論其所在位置精確配對的能力。例如，如果在寡聚化合物某位置的核苷堿基能夠與耙標(biāo)核酸(該耙標(biāo)核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子)某位置的核苷堿基氫鍵結(jié)合，則寡核普酸和靶標(biāo)核酸之間的氬鍵結(jié)合的位置被認(rèn)為是互補(bǔ)性位置。當(dāng)各分子中的互補(bǔ)性位置被可以彼此以氫鍵結(jié)合的核苷堿基占據(jù)時，該寡聚化合物和該DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此具有互補(bǔ)性。術(shù)語"特異可雜交性"和"互補(bǔ)性"是用于表示足夠數(shù)量的核苷堿基中有足夠精確的配對或互補(bǔ)程度、由此在寡核苷酸和耙標(biāo)核酸之間形成穩(wěn)定和特異性結(jié)合的術(shù)語。在本領(lǐng)域中可以理解寡聚化合物的序列不需要對其耙標(biāo)核酸具有100%的互補(bǔ)性以達(dá)到特異可雜交性。此外，寡核苷酸可在一個或多個片段上雜交從而使中間的或鄰近的片段不參與雜交(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物對其耙向的耙標(biāo)核酸序列中的耙標(biāo)區(qū)域具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，當(dāng)寡聚化合物中20個核苷中有18個與靶標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)，因而該寡聚化合物具有特異雜交性，則該寡聚化合物具有90%互補(bǔ)性。在該實例中，剩余的非互補(bǔ)性核苷堿基可以成簇或散布在互補(bǔ)性核苷堿基中，不需要彼此鄰近或與互補(bǔ)性核苷堿基鄰近。同樣地，具有4(四)個非互補(bǔ)性核脊堿基(其側(cè)翼連接兩個與把標(biāo)核酸完全互補(bǔ)的區(qū)域)的長度為18個核苷堿基的寡聚化合物對靶標(biāo)核酸具有77.8%的總體互補(bǔ)性，并因此在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。寡聚化合物與耙標(biāo)核酸區(qū)域的互補(bǔ)性百分比可通過本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)測定(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990,215,403-410;Zhang和Madden,GenomeRes"1997,7，649-656)。本發(fā)明進(jìn)一步包括了如反義寡聚化合物、反義寡核普酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、選擇性剪切體、引物、探針等寡聚化合物，以及與靶標(biāo)核酸的至少一個部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些寡聚化合物可以以單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物的形式引入，并可包含例如內(nèi)部或末端突起或環(huán)的結(jié)構(gòu)元件。本發(fā)明的寡聚化合物在引入系統(tǒng)后可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)對#巴標(biāo)核酸的修飾。該種酶的非限制性實例之一為RNA酶H，一種裂解RNA:DNA雙鏈的RNA鏈的細(xì)胞內(nèi)切酶。本領(lǐng)域已知"類DNA"單鏈寡聚化合物引發(fā)RNA酶H。RNA酶H的激活可導(dǎo)致RNA耙標(biāo)的裂解，從而大大增強(qiáng)寡核苷酸-介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制的效率。其它的核糖核酸酶(例如屬于RNA酶III和核糖核酸酶L酶家族的核糖核酸酶)也假定具有類似的作用。盡管寡聚化合物的一種形式為單鏈反義寡核香酸，在許多物種中已顯示引入雙鏈結(jié)構(gòu)(例如雙鏈RNA(dsRNA)分子)可以導(dǎo)致基因或其相關(guān)基因產(chǎn)物功能的強(qiáng)效和特異性反義介導(dǎo)的減少。該現(xiàn)象同時存在于植物和動物，并被認(rèn)為與病毒防御和轉(zhuǎn)座子沉默具有進(jìn)化聯(lián)系。在一些實施方案中，在篩選可以調(diào)節(jié)所選定蛋白表達(dá)的其它寡聚化合物中可采用"適當(dāng)?shù)陌袠?biāo)片段"。"調(diào)節(jié)劑"為降低或提高編碼蛋白的核酸分子表達(dá)、并且至少包含與適當(dāng)靶標(biāo)片段互補(bǔ)的8-核苷堿基部分的寡聚化合物。該篩選方法包括將編碼蛋白的核酸分子的適當(dāng)靶標(biāo)片段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，并選擇一種或多種提高或降低編碼蛋白的核酸分子表達(dá)的候選調(diào)節(jié)劑的步驟。一旦顯示候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如，提高或降低)編碼肽的核酸分子表達(dá)，該調(diào)節(jié)劑可進(jìn)一步用于肽功能的研究，或如本發(fā)明所述用作研究、診斷或治療劑。本發(fā)明的適當(dāng)靶標(biāo)片段還可與其相應(yīng)的本發(fā)明互補(bǔ)性反義寡聚化合物組合形成穩(wěn)定的雙鏈寡核苦酸。本領(lǐng)域已顯示該種雙鏈寡核苷酸部分可通過反義機(jī)制調(diào)節(jié)單巴標(biāo)表達(dá)并調(diào)節(jié)翻譯和RNA加工。此外，對該雙鏈部分還可進(jìn)行化學(xué)修飾(Fire等人，Nature,1998,391,806-811;Timmons和Fire,Nature1998，395,854;Timmons等人，Gene,2001,263,103-112;Tabara等人，Science,1998,282,430-431;Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998，95，15502-15507;Tuschl等人，GenesDev.,1999,13,3191-3197;Elbashir等人,Nature,2001，411,494-498;Elbashir等人，GenesDev.2001,15,188-200)。例如，這種雙鏈部分已顯示可通過雙鏈的反義鏈與耙標(biāo)進(jìn)行經(jīng)典雜交從而引發(fā)耙標(biāo)的酶降解來抑制耙標(biāo)(Tijsterman等人，Science,2002,295,694-697)。本發(fā)明的寡聚化合物還可用于藥物開發(fā)和靶標(biāo)確證領(lǐng)域。本發(fā)明包含了在藥物開發(fā)中使用本發(fā)明的寡聚化合物和耙標(biāo)以闡明蛋白和疾病狀態(tài)、表型或癥狀之間存在的關(guān)系。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)乾標(biāo)肽，包括將樣本、組織、細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的寡聚化合物接觸，在處理后一定時間檢測耙標(biāo)核酸或蛋白水平和/或相關(guān)的表型或化學(xué)終點，并任選地將測量值與未處理樣本或以本發(fā)明其它寡聚化合物處理的樣本進(jìn)行比較。這些方法可以平行進(jìn)行或與其它實驗組合進(jìn)行，以確定靶標(biāo)確證過程中未知基因的功能，或者測定特定基因產(chǎn)物作為治療或預(yù)防特定疾病、癥狀或表型的耙標(biāo)的有效性。核苷修飾對RNAi活性的作用參照現(xiàn)有文獻(xiàn)進(jìn)行了評估(Elbashir等人，Nature(2001),411,494-498;Nishikura等人，Cell(2001)，107，415-416;以及Bass等人，Cell(2000),101,235-238)。本發(fā)明的寡聚化合物可用于診斷、治療、預(yù)防，并可作為研究試劑和試劑盒。此外，能特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸也常被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員用來闡明特定基因的功能或區(qū)分生物通路各種組分的功能。對于試劑盒或診斷應(yīng)用，單獨或與其它寡聚化合物或治療劑聯(lián)合使用的本發(fā)明寡聚化合物可用作差異性和/或組合分析的工具，以闡明在細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)的基因的部分或完整互補(bǔ)體的表達(dá)模式。作為一個非限制性實例，以一種或多種寡聚化合物處理的細(xì)胞或組織的表達(dá)模式可與未以寡聚化合物處理的對照細(xì)胞或組織進(jìn)行比較，并分析各模式基因表達(dá)的差異水平，它們與例如疾病關(guān)聯(lián)性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、以及所檢測基因的表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能有關(guān)。這些分析可在影響表達(dá)模式的其它化合物和/或寡聚化合物存在或不存在的情況下對刺激或未刺激細(xì)胞進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析方法的實例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo,FEBSLett.,2000,480,17-24;Celis等人,FEBSLett,2000,480，2-16)、SAGE(基因表達(dá)系列分析)(Madden等人，DrugDiscov.Today,2000,5,415-425)、READS(消化的cDNA的限制性酶擴(kuò)增)(Prashar和Weissman,MethodsEnzymol"1999,303,258-72)、TOGA(總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe等人,Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A"2000,97,1976-81)、蛋白陣列和蛋白組學(xué)(Celis等人，F(xiàn)EBSLett"2000,480,2-16;Jungblut等人，Electrophoresis,1999,20,2100-10)、表達(dá)序列標(biāo)記(EST)序列(Celis等人，F(xiàn)EBSLett"2000,480,2-16;Larsson等人,J.Biotechnol.,2000,80,143-57)、消減RNA指紋(SuRF)(Fuchs等人，Anal.Biochem.,2000,286,91-98;Larson等人，Cytometry,2000,41,203-208)、消減克隆、差異展示(DD)(Jurecic和Belmont,Curr.Opin.Microbiol.,2000,3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli等人，J.CellBiochem.Suppl.，1998,31,286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going和Gusterson,Eur.J.Cancer,1999,35,1895-904)以及質(zhì)譜方法(To,Comb.Chem.HighThroughputScreen,2000,3,235-41)。本發(fā)明的寡聚化合物可用于研究和診斷，因為這些寡聚化合物可與編碼蛋白的核酸雜交。例如，可在此處披露的條件下以在此披露的效率雜交從而成為有效蛋白抑制劑的寡核苷酸將在有利于基因擴(kuò)增或檢測的條件下分別作為有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測編碼蛋白的核酸分子的方法，并可用于核酸分子擴(kuò)增以供檢測或在進(jìn)一步研究中使用。本發(fā)明的反義寡核苷酸，特別是引物和探針與核酸的雜交可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行檢測。該種方法可包括將酶偶聯(lián)至寡核苷酸，對該寡核香酸放射性標(biāo)記或任何其它適用的檢測方法。還可制備使用這些檢測手段檢測樣本中選定蛋白水平的試劑盒。本發(fā)明已根據(jù)其一些實施方案進(jìn)行了具體描述，以下實施例僅用于闡述本發(fā)明，并非意在對其進(jìn)行限制。實施例1尿苷6-(R)-甲基BNA亞磷酰胺,(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-l-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(15)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>示意圖1(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，來自3的產(chǎn)率為59%;(b)Swern氧化(c)MeMgBr,CeCl3，THF,-78°C，來自3的產(chǎn)率為80%;(d)MsCl,Et3N，DMAP，CH2C12，室溫，16小時，91%;(e)AcOH,Ac20,H2S04,室溫，16小時，88%;(f)尿嗜啶,BSA，TMSOTf,CH3CN,回流，2小時；(g)K2C03,MeOH,室溫，16小時；(h)TBDPSCI,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，來自8的產(chǎn)率為79%;(i)BC13,CH2C12,-15°C,60%;(j)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(k)DMTCl，嘧啶，室溫，16小時，來自12的產(chǎn)率為89%;(1)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唾，NMI,DMF。A)5-0-(叔丁基二甲基硅烷基)-3-0-苯甲基-1，2-0-異亞丙基-4-C-幾甲基-a-D-赤式-戊呋喃糖(3)通過加料漏斗在10分鐘內(nèi)向含有二醇2(12g,38.8mmol,參照Moffatt等人，J.Org.Chem.1979,44,1301,參考1的方法進(jìn)行制備)、三乙胺(l1.44mL,81.5mmol)以及4-二甲基氨乙基嘧啶(0.47g,3.9mmol)的CH2C12(184mL)冷(0"C)溶液中添加叔丁基二甲基硅烷基氯(6.24g,40.7mmol)的二氯甲烷(lOmL)溶液。添加完成后，將反應(yīng)逐漸加熱至室溫，并繼續(xù)攪拌16小時。用CH2Cl2稀釋反應(yīng)物，依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHCCb、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以10%至30%的EtOAc/己烷洗脫)純化產(chǎn)生白色固體的醇3(11.53g,59%)和醇4(3.93g,22%)。B)醇(6)將二甲基亞砜(3.36mL,47.5mmol)逐滴加入含有草酰氯(2.08mL,23.7mmol)的CH2C12冷(-78。C)溶液(130mL)。攪拌30分鐘后，向反應(yīng)中添加醇3(6.7g,15.8mmol)的CH2Cl2溶液(20mL)。在-78。C繼續(xù)攪拌45分鐘并向反應(yīng)中添加三乙胺(10.0mL,71.2mmo1)。在-78。C下將反應(yīng)物攪拌15分鐘，隨后取走冰浴，并在45分鐘內(nèi)對反應(yīng)物逐漸加溫。然后將反應(yīng)物倒入CH2Cl2中，有機(jī)相先后以5。/qHC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供醛5，其在不作進(jìn)一步純化下使用。將氯化鈰ni(5.84g,23.7mmol)的THF(130mL)懸浮液在室溫下攪拌90分鐘。在冰浴中冷卻反應(yīng)物，在5分鐘內(nèi)添加甲基溴化鎂(17.0mL的1M甲基溴化鎂的THF溶液)，繼續(xù)攪拌90分鐘。將含有粗制醛5(由前面獲得)的THF(20mL)加入反應(yīng)物中。繼續(xù)攪拌90分鐘后，以飽和NH4C1溶液淬滅反應(yīng)并將反應(yīng)物倒入EtOAc。依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以15。/。的EtOAc/己烷洗脫)純化提供醇6(5.52g,來自3的產(chǎn)率為80%)。C)甲磺酸(7)向含有醇6(2.77g，6.4mmol)、三乙胺(l.lmL,7.7mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(84mg，0.7mmol)的CH2C12(14mL)冰(0。C)溶液添加甲烷磺酰氯(0.55mL,7.0mmo1)。室溫攪拌l小時后，將反應(yīng)物倒入CHCl3，有機(jī)層依次以5Q/。HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以15%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供甲磺酸7(2.97g,91%)。D)三乙酸酯(8)將濃H2S04(3滴)加入甲磺酸7(2.97g,5.8mmol)的水醋酸(29mL)和乙酸肝(5.8mL)溶液。室溫攪拌l小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，有機(jī)層依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以33%至50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供三乙酸酯8(2.48g,88%)。NMR(CDC13，|3異頭體)57.39-7.30(m,5H),6.23(s,1H),5.37(d,1H),5.19(q,1H)，4.62(d，1H),4.52(d,1H),4.38(s,1H),4.34(d，1H),3.98(d,1H),2.91(s，3H),2.12(s,3H),2.08(s,3H),2.06(s,3H),1.55(d，3H)。LCMS:保留時間1.35分鐘；M+23計算值511.1，實測值511.0。E)核苷(ll)向三乙酸酯8(2.47g,5.0mmol)和尿嘧啶(0.70g，6.3mmol)的CH3CN(15mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(4.9mL，20.0mmol)。在40。C下加熱15分鐘以獲得澄清溶液，向反應(yīng)中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸鹽(1.18mL，6.5mmol)?；亓?小時后，將反應(yīng)冷卻至室溫并倒入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗制核香9，其可在不作任何純化下使用。向核苷9(由前面獲得)的MeOH(50mL)溶液添加K2CO3(2.07g，15mmol)。在室溫下攪拌16小時后，真空去除溶劑并在25。/o嘧啶/EtOAc和鹽水中分配殘留物。收集有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮提4共10，其在不作進(jìn)一步純化下使用。！H雇R(MeOD):57.74(d,2H),7.29-7.14(m，5H),5,53(d,1H),5.38(s,1H),4,48(s，2H)，4.18(s,1H)，4.14(sm,1H)，3.92(s,1H),3.66(s，2H),1.08(d,3H)。LCMS:保留時間2.40分鐘；M+H計算值360.1，實測值361.0。向核苷10(由前面獲得)、三乙胺(1.4mL,10.0mmol)和4-二曱基氨基嘧啶(80mg,0.7mmol)的CH2C12(9mL)冰((TC)溶液中添加叔丁基二苯基硅烷基氯(1.73mL,6.7mmol)。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，依次以5%HC1水溶液、飽和NaHC03洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02,以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷11(2.02g,來自8的產(chǎn)率為79%)。F)核苷(12)將三氯化硼(1M三氯化硼的16.7mLCH2Cl2溶液)小心加入核苷11(2.0g,3.3mmol)的CH2C12(40mL)冷(-15。C)溶液。在-15。C下攪拌1小時后，將反應(yīng)物冷卻至-78。C并通過添加MeOH/CH2Cl2(l:l,10mL)小心淬滅反應(yīng)。繼續(xù)攪拌10分鐘后，將反應(yīng)物倒入CH2Cl2,依次以5n/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50%至80%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷12(1.02g，60%)。G)核苷(13)在聚丙烯管中向核苷12(1.86g,3.7mmol)和三乙胺(1.03mL,7.3mmol)的THF(36mL)溶液中添加三乙胺三氫氟酸鹽(2.98mL，18.3mmol)。室溫攪拌16小時后，真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以15%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷13(1.31g，產(chǎn)物中摻雜了三乙胺)。H)核普(14)向核苷13(由前面獲得)的嘧啶(18mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTC1)(1.23g,3.7mmol)。室溫攪拌16小時后，向反應(yīng)添加額外的DMTC1(0.12g)，繼續(xù)攪拌8小時。然后將反應(yīng)物倒入EtOAc，隨后以鹽水萃取有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以15。/。的丙酮/CHCl3洗脫)純化^是供白色泡沫狀的核苷14(1.85g,89%)。^麗R(CDC13):S8.03(d，1H)，7.44-2.28(m,14H),6.86(d,4H),5.63(d,1H),5.60(s,1H),4.32(m,1H)，4.13(s,1H),3.81(s,6H),3.49(d,1H),3.37(d,1H)，1.18(d,3H)。I)亞磷酰胺,(lS,3R,4R,6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]_1_(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(15)的制備將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(0.69mL,2.2mmol)加入核苷14(0.83g,1.4mmol)、四唑(80mg,1.2mmol)和N-甲基咪哇(29|iL,0.36mmol)的DMF(7.2mL)溶液中。室溫攪拌8小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。將殘留物溶解于最少量的EtOAc中，將該溶液添加至己烷中。收集所得的沉淀物，進(jìn)一步通過柱層析(Si02,以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺15(1.04g,94%)。31PNMR(CDC13)S:149.21,149.79。實施例2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>示意圖2(a)TBSCI,咪唑，DMF，室溫，16小時，99%;(b)P0C13,1,2,4-三唑,Et3N，CH3CN,室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1,4-二惡坑，室溫，16小時；(d)Bz20,DMF，室溫，16小時，來自15的產(chǎn)率為90%;(e)Et3N.3HF，Et3N,THF,室溫，16小時，93%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾,NMI,DMF,95%。A)核苷(16)將叔丁基二甲基硅烷基氯(0.79g，5.2mmol)添加至核苷14(1.0g,1.7mmol)和咪唑(0.70g,10.4mmol)的DMF(3.5mL)溶液。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc,以鹽水萃取有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷16(1.17g，99%)。B)核苷(19)將三氯氧磷(1.27mL,13.6mmol)添加至1,2,4-三唑(4.0g，58.0mmol)的CH3CN(21mL)冷((TC)懸浮液中。攪拌15分鐘后，向反應(yīng)中添加三乙胺(9.57尿普N-Bz-胞嘧啶-6-(R)-甲基BNA亞磷酰胺,(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶_1_基)_6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(21)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>mL,68mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘。在0。C下向反應(yīng)中添加核苷16(1.17g,1.7mmol)的CH3CN(10mL)溶液。攪拌10分鐘后，去除冰浴并在室溫下攪拌反應(yīng)物4小時。真空去除溶劑，在EtOAc和水之間分配殘留物。然后以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗產(chǎn)物17，其可在不作任何純化下使用。將氨水(4mL)添加至核普17(由前面獲得)的二惡烷(20mL)溶液中。在室溫下攪拌16小時，真空濃縮反應(yīng)物并在高度真空下干燥8小時以提供核苷18,其可在不作任何純化下使用。向核普18(由前面獲得)的DMF(3mL)溶液添加苯甲酸酐(0.65g，2.9mmol)。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc,以飽和NaHC03、鹽水萃取有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02,以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷19(1.2g,來自16的產(chǎn)率為90%)。C)核苷(20)在聚丙烯管中向核苷19(1.86g,3.7mmol)和三乙胺(1.03mL,7.3mmol)的THF(15mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(1.48mL,9.1mmo1)。室溫下攪拌16小時后，真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc，依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02,以5%MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷20(0.91g,90%)。&NMR(MeOD)S:8.62(d,1H),8.02(d.IH),7.63(m,6H)，7.38(m,7H),6.96(d，4H),6.65s，1H),4.49(s,1H),4.36(s,1H),4.25(m,1H),3.53(d,1H),3.41(d，1H),1.18(d,3H)。D)(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-l-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(21)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(0.63mL,2.0mmol)加入含有核苷20(0.89g,1.3mmol)、四哇(73mg,l.lmmol)和N-甲基咪哇(26^L,0.33mmol)的DMF(6.6mL)溶液中。室溫攪拌8小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。將殘留物溶解于最少量的EtOAc，將該溶液添加至己烷。收集所得的沉淀物，進(jìn)一步通過柱層析(Si02，以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺21(1.1g,95%)。31P麗R(CDC13)5:149.34,149.77。實施例3尿苷-6-(S)-甲基BNA亞磷酰胺,(lS，3R，4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(38)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>示意圖3(a)NaH，溴化萘，DMF,室溫，2h,98%;(b)醋酸，H20,室溫，16小時；(c)NaI04,二惡烷，H20,室溫，90分鐘；(d)HCHO,NaOH，THF,H20,室溫，16小時，由22為80%;(e)TBDPSC1,Et3N,DMAP,CH2C12，室溫，16小時，61%;(f)草酰氯，DMSO,Et3N,-78°C;(g)MeMgBr,CeCl3，來自26的產(chǎn)率為89%;(h)草酰氯,DMSO，Et3N,-78°C;(i)DiBAL，CH2C12,隱78。C;(j)MsCl,Et3N,DMAP，CH2C12,室溫，1小時；(k)Ac20，AcOH,H2S04,由28為58%;(1)BSA,尿嘧啶，TMSOTf,MeCN,回流，2小時；(m)K2C03，MeOH，室溫，16小時，來自34的產(chǎn)率為76%;(n)DDQ,CH2C12,H20,室溫，8小時，80%;(o)Et3N.3HF,Et3N,THF,定量;(p)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時，86%;(q)CN(CH2)2OP(NiPr2)2,四唑，NMI,DMF，97%。A)醇(22)將氬化鈉(2.39g,59.8mmol)小心添加至可從市場購得的1,2:5,6-二-O-異亞丙基-a-D-呋喃阿洛糖1(12.0g,46mmol)的DMF(75mL)冷(0。C)溶液中。攪拌20分鐘后，向反應(yīng)中添加溴化萘(11.12g，50.8mmol)并繼續(xù)攪拌2小時。以H20小心淬滅反應(yīng)并將其倒入EtOAc，以水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥并濃縮。柱層析(Si02，以10%至33%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體醇22(18.1g,98%)。B)二醇(25)將醇22(18g,46mmol)溶解于冰醋酸(150mL)和H20(60mL)。在室溫下攪拌反應(yīng)物16小時，然后將其真空濃縮。然后將殘留物溶解于EtOAc，以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥并濃縮得到粗品23,其在不作進(jìn)一步純化下使用。將高碘酸鈉(48mmol,10g)水溶液(350mL)添加至上面獲得的粗產(chǎn)品二醇23的1,4-二惡烷(140mL)的溶液。室溫攪拌90分鐘后，以EtOAc萃取反應(yīng)物，以水、鹽水進(jìn)一步洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮得到醛24，其可不作進(jìn)一步純化下使用。將由前面獲得的粗品醛24溶解于THF:H20(1:1,100mL)混合物，并將反應(yīng)物在冰浴中冷卻。向反應(yīng)中添加甲^(25mL,35。/。w/w)和1NNaOH(100mL)。室溫攪拌16小時后，向反應(yīng)添加甲醛(5mL)并繼續(xù)攪拌32小時。將反應(yīng)物濃縮至干燥，在EtOAc和水之間分配殘留物。分層并以另外的1NNaOH、水、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥并濃縮得到白色固體二醇25(12.96g,80%,三步)。C)醇(26)將叔丁基二苯基硅烷基氯(0.75mL,2.9mmol)添加至二醇25(1g,2.8mmol)和三乙胺(0.45mL,3.2mmol)的冷(0。C)溶液。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，并依次用5%HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2SOzt)并濃縮。柱層析(Si02，以10%至40%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供油狀的醇26(1.02g，61。/o)(還分離得到0.42g區(qū)域異構(gòu)硅保護(hù)的二醇)。D)醇(28)將二甲基亞砜(1.6mL,22.4mmol)逐滴加入草酰氯(0.98mL,11.2mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78。C)溶液。攪拌30分鐘后，向反應(yīng)中添加醇26(4.8g,8.0mmol)的CH2C12(20mL)溶液。在-78。C繼續(xù)攪拌45分鐘并向反應(yīng)中添加三乙胺(4.72mL,33.7mmo1)。在-78。C下將反應(yīng)物攪拌15分鐘，隨后取走冰浴，并在45分鐘內(nèi)對反應(yīng)物逐漸加溫。然后將反應(yīng)物倒入CH2C12，依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮以^是供醛27，其可在不作進(jìn)一步純化下使用。將氯化鈰111(2.96g,12.0mmol)的THF(50mL)懸浮液在室溫下攪拌90分鐘。在冰浴中冷卻反應(yīng)物，歷經(jīng)5分鐘添加甲基溴化鎂(1.4M甲基溴化鎂的8.6mLTHF的溶液，12mmol)，繼續(xù)攪拌90分鐘，然后將反應(yīng)冷卻至-78'C。將粗醛27(由前面獲得)的THF(20mL)溶液加入反應(yīng)物。繼續(xù)攪拌90分鐘后，以飽和NH4C1溶液淬滅反應(yīng)并倒入EtOAc。依次以5%HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02,以20%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供醇28(4.37g,來自26的產(chǎn)率為89%)。E)二乙酸(32)將二甲基亞砜(1.41mL,19.9mmol)逐滴加入草酰氯(0.87mL，10.0mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78。C)溶液。攪拌30分鐘后，向反應(yīng)中添加醇28(4.35g，7.1mmol)的CH2C12(20mL)溶液。在-78。C繼續(xù)攪拌45分鐘并向反應(yīng)中添加三乙胺(4.20mL，30.0mmo1)。在-78。C下將反應(yīng)物攪拌15分鐘，隨后取走冰浴，并在45分鐘內(nèi)對反應(yīng)物逐漸加溫。然后將反應(yīng)物倒入CH2Cl2，先后以5。/oHCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮以才是4共醛29，其可在不作進(jìn)一步純化下使用。將二異丁基氫化鋁(13.7mL1M二異丁基氫化鋁的CH2C12溶液，13.7mmol)添加至酮29(由前面獲得)的CH2C12(15mL)冷溶液。在-78"C下攪拌2小時后，添加飽和NH4C1淬滅反應(yīng)并將其倒入CHC13。然后以5%HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供醇30，其可在不作任何純化下^f吏用。向含有醇30(由前面獲得)、三乙胺(1.77mL,10.5mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(85mg，0.7mmol)的CH2C12(21mL)冷(0。C)溶液添加曱烷磺酰氯(O.llmL，1.4mmo1)。室溫攪拌1小時后，將反應(yīng)物倒入CHCl3,依次以5%HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供甲磺酸31，其在不作任何純化下使用。將濃H2S04(2滴)加入甲磺酸31(由前面獲得)的冰醋酸(15mL)和乙酸酐(3.0mL)溶液。室溫攪拌1小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，千燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以20%至33%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供二乙酸32(3.0g,由28為58%)。F)核苷(34)向二乙酸32(3.0g，4.1mmol)和尿嘧咬(0.57g,5.1mmol)的CH3CN(20mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(3.45mL,14.0mmol)。在40。C下加熱15分鐘以獲得澄清溶液后，向反應(yīng)中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸鹽(0.95mL,5.3mmol)?；亓?小時后，將反應(yīng)冷卻至室溫并倒入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗制核苷33,其可在不作任何純化下使用。向核香33(由前面獲得)的MeOH(40mL)溶液添加K2C03(1.66g,12.0mmol)。室溫下攪拌16小時后，真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于25%嘧啶/EtOAc,以鹽水萃取，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以40%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷34(2.0g,來自32的產(chǎn)率為76%)。G)核苷(35)向核苷34(2.0g,3.1mmol)的二氯甲烷(30mL)和H20(1.5mL)溶液添加2,3-二氯-5,6-二氰-l,4-苯醌(DDQ)(1.4g,6.2mmo1)。室溫下攪拌3小時，再次向反應(yīng)添加DDQ(0.5g)。再攪拌10分鐘后，真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc。依次以水、水:飽和NaHC03(l:l)、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，80%的EtOAc/己烷)純化提供白色固體核苷35(1.25g，80%)。H)核普(36)在聚丙烯管中向核苷35(1.25g，2.5mmol)和三乙胺(l,OmL,7.4mmol)的THF(25mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(2.4mL,14.7mmol)。室溫攪拌24小時后，真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥并濃縮(Na2S04)。柱層析(Si02，以5%至10%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷36(0.88g)(產(chǎn)物混有Et3N)。I)核苷(37)向核苷36(由前面獲得)的嘧啶(12mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(0.91g,2.7mmo1)。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc,以鹽水洗滌有機(jī)層，干燥并濃縮。柱層析(Si02,以90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核香37(1.28g，來自36的產(chǎn)率為86%)。J)(lS，3R,4R,6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(38)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(0.46mL,1.5mmol)加入含有核普37(0,59g,1.0mmol)、四唾(57mg，l.lmmol)和N-甲基咪峻(20|iL，0.25mmol)的DMF(5mL)溶液。室溫攪拌8小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺38(0.75g,97%)。31PNMR(CDC13)5:149.36,149.53。實施例4N-Bz-胞嘧啶-6-(11)-甲基BNA亞磷酰胺,(1S,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二曱氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯曱酰胞嘧啶_1-基)_6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(44)的制備A)核苷(39)將叔丁基二甲基硅烷基氯(0.45g,5.2mmol)添加至核苷37(0.59g,1.0mmol)和咪唑(0.41g,6.0mmol)的DMF(2mL)溶液中。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，隨后以鹽水萃取有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50o/o的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核香39(0.68g,97%)。B)核苷(42)將三氯氧化磷(0.74mL,8.0mmol)添加至1,2，4-三唾(2.35g,34.0mmol)的CH3CN(16mL)冷(0。C)懸浮液。攪拌15分鐘后，向反應(yīng)添加三乙胺(5.6mL,40mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘。在(TC下向反應(yīng)添加核苷39(0.68g,1.0mmol)的CH3CN(7mL)溶液。攪拌10分鐘后，去除冰浴并在室溫下攪拌反應(yīng)物4小時。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>示意圖4(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時97%;(b)P0C13,1,2,4陽三唑，Et3N,CH3CN,室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1,4-二惡烷，室溫，16小時；(d)Bz20,DMF,室溫，16小時，來自39的產(chǎn)率為91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF，室溫，16小時，87%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四峻，NMI,DMF,90%。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>真空去除溶劑，在EtOAc和水之間分配殘留物。然后以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗產(chǎn)物40，其可在不作任何純化下使用。將氨水(2.5mL)添加至核苷40(由前面獲得)的二惡烷(12mL)溶液。在室溫下攪拌16小時，真空濃縮反應(yīng)物并在高度真空下千燥8小時以提供核苷41,其可在不作任何純化下使用。向核苷41(由前面獲得)的DMF(25mL)溶液添加苯甲酸酐(0.38g，1.7mmol)。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc,以飽和NaHC03、鹽水萃取有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化4是供白色固體的核苷42(0.72g,來自39的產(chǎn)率為91%)。C)核苷(43)在聚丙燁管中向含有核苷42(0.72g,0.91mmol)和三乙胺(0.30mL,2.2mmol)的THF(9mL)溶液添加三乙胺三氬氟酸鹽(0.89mL,5.5mmol)。室溫下攪拌16小時后，真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc,依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以25%至40%的丙酮/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核普43(0.53g,87%)。&NMR(CDC13):58.34(s,br，1H),8.33(d,1H),7.83(d，1H),7.57-7.26(m,16H)，6.89(d,4H),5.72(s,1H),4.75(s,1H)，4.22(s,1H),4,14(m,1H),3.83(s,6H),3.63(d,1H),3.46(s，1H),1.20(d,3H)。D)(lS，3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基曱基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(44)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(0.37mL,1.2mmol)加入含有核苷43(0.89g,1.3mmo1)、四唑(43mg，0.63mmol)和N-甲基口米唾(16(iL,0.20mmol)的DMF(4mL)溶液。室溫攪拌8小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc,依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺44(0.61g,90%)。實施例5(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(51)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>示意圖5(a)6-N-苯甲酰腺嘌呤,BSA,TMSOTf,DCE,回流，8小時；(b)K2C03，MeOH,室溫,16小時,來自32的產(chǎn)率為73%;(c)Bz20,DMF,室溫；(d)DDQ,CH2C12,H20,室溫；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(f)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四峻,NMI,DMF。A)核)和6-N-苯甲酰腺噪呤(0.48g，2.0mmol)的二氯乙烷(14mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(l.lmL,4.50mmol)。反應(yīng)混合物在回流45分鐘后變澄清，并在冰浴中冷卻，添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸鹽(0.49mL,2.7mmol)?；亓?小時后，將反應(yīng)冷卻至室溫并倒入EtOAc。以飽和NaHC03和鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗制核苷45，其可在不作純化下使用。向核苦45(由前面獲得)的MeOH(14mL)溶液添加K2CO3(0.38g,2.7mmol)。室溫攪拌24小時后將反應(yīng)物真空濃縮。將殘留物懸浮于EtOAc，用水和鹽水萃取，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02,以1%至2.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷46(0.69g,來自32的產(chǎn)率為73%)。B)核苦47核苷47可由核苷46通過與干DMF中的苯甲酸酐(1.5-2當(dāng)量)反應(yīng)進(jìn)行制備。C)亞磷酰胺51亞磷酰胺51可通過實施例3所示的由核苷34得到亞磷酰胺38的方法由核苷47進(jìn)行制備。實施例6(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺噤呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(60)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>鉍示意圖6(a)MsCl,Et3N，DMAP,CH2CI2,室溫，4小時;(b)Ac20,AcOH,催化量H2S04,室溫，3小時，來自28的產(chǎn)率為87%;(c)6-N-苯甲酰腺噤呤，BSA，TMSOTf，DCE,回流，2小時；(d)K2C03，MeOH，室溫，16小時；(e)Bz20,DMF,室溫；(f)DDQ，CH2C12，H20,室溫；(g)Et3N.3HF,Et3N，THF,室溫，16小時；(h)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(i)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI,DMF。A)二乙酸(52)向含有醇28(7.37g,12.0mmol)、三乙胺(2.82mL,20.2mmol)和DMAP(0.20g,Ummol)的二氯甲烷(25mL)冷溶液(0。C)逐滴添加甲烷磺酰氯(1.33mL，16.8mmol)。室溫下攪拌2小時后，以二氯甲烷稀釋反應(yīng)物，以5%HC1、飽和碳酸氫鈉溶液、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。由此獲得粗品甲磺酸52,其可在不作純化下使用。B)二乙酸(53)將濃石克酸(IO滴)加入甲磺酸52(由前面獲得)的乙酸酐(7.2mL)和醋酸(36mL)溶液。室溫攪拌2小時后將反應(yīng)物在高度真空下濃縮。將殘留物溶解于乙酸乙酯，以水、飽和碳酸氬鈉溶液(直至pH〉8)和鹽水小心洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。以柱層析(Si02,以25。/。至35Q/。EtOAc/己烷洗脫)純化殘留物以才是供粘性油二乙酸53(7.66g，來自28的產(chǎn)率為87%)。C)亞磷酰胺(60)亞磷酰胺60可通過實施例3所示的由二乙酸32得到亞磷酰胺51的方法由二乙酸53進(jìn)行制備。實施例7(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁酰鳥嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(67)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>示意圖7(a)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA，TMSOTf,DCE,回流，2小時；(b)3-羥基丙腈,NaH,THF,4小時，來自32的產(chǎn)率為82%;(c)異丁酸酐，DMAP,DMF,60C,24小時，71%;(d)DDQ，CH2C12,H20,室溫，16小時，91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時，97%;(f)DMTCl，嘧啶，室溫，16小時，85%;(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI,DMF。A)核苷(61)向二乙酸32(3.44g，4.7mmol)和2-氨基-6-氯噤呤(1.18g,7.0mmol)的二氯乙烷(46mL)懸浮液添加N,0-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(3.8mL，15.5mmol)?；亓?5分鐘得到澄清溶液后，在冰浴中冷卻反應(yīng)物并添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸鹽(1.69mL,9.4mmol)。回流8小時后，將反應(yīng)冷卻至室溫并倒入氯仿。以飽和NaHC03和鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以摘供粗制核普61，其可在不作純化下使用。B)核苷(62)向氫化鈉(1.07g,27.0mmol,60%w/w)的干THF(10mL)攪拌懸浮液逐滴添加3-羥基丙腈(1.67mL,24.5mmol)。攪拌20分鐘后，添加粗品核苷61(由前面獲得)的千THF(25mL)溶液。室溫下繼續(xù)攪拌5小時，然后通過添加飽和氯化銨溶液小心淬滅反應(yīng)。然后將反應(yīng)物倒入乙酸乙酯，以鹽水萃取有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。以柱層析(Si02,以CHC13至2.5%MeOH/CHCl3洗脫)純化殘留物以提供淺棕色固體的核苷62(3.18g,來自32的產(chǎn)率為82%)。C)核苷(63)將異丁酸酐(1.5mL,9.3mmol)添加至核苷62(3.19g,4.6mmol)和4-二甲氨基甲基嘧啶(0.11g,0.93mmol)的DMF(27mL)溶液。在60°C下攪拌14小時后，向反應(yīng)再加入異丁酸酐(1.5mL，9.3mmol),繼續(xù)在60。C下攪拌12小時。將反應(yīng)冷卻至室溫，以EtOAc稀釋，并以水、飽和^炭酸氫鈉溶液、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以5%至15Q/。的丙酮/CHCl3洗脫)純化才是供黃色泡沫狀的核苷63(2.5g，71%)。D)核苷(64)向核苷63(2.5g,3.3mmol)的二氯甲烷(33mL)和H20(1.7mL)溶液添加DDQ(1.12g,5.0mmol)。在室溫下攪拌2小時后再次添加DDQ(1.0g)。繼續(xù)在室溫下攪拌6小時，然后將反應(yīng)物在冰箱(4'C)中儲存16小時。然后真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于乙酸乙酯。以水、10Q/。亞辟L酸氫鈉溶液(2x)、飽和碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以5%MeOH/CHCl3洗脫)純化提供核苷64(1.84g,91%)。E)核苷(65)在聚丙烯管中向核普64(1.84g,3.0mmol)和三乙胺(1.25mL,8.9mmol)的THF(30mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(2.88mL,17.9mmo1)。室溫攪拌24小時后，真空濃縮反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以5%至10%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體的核苷65(1.05g，97%)。F)核苷(66)向核苷65(1.00g，2.7mmol)的嘧啶(13mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(1.07g,3.2mmol)。室溫攪拌16小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，以鹽水洗滌有機(jī)層，干燥并濃縮。柱層析(Si02，以2.5%至5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色泡沫狀的核苷66(1.52g,85%)。G)(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁酰鳥嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(67)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(1.06mL,3.4mmol)加入含有核苷66(1.52g,2.2mmol)、四唾(0.12g,1.7mmol)和N-甲基咪唾(45pL,0.56mmol)的DMF(l1mL)溶液。室溫攪拌8小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc,依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以2.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺67(1.65g,84%)。31PNMR(CDC13)S:148.70,145.81。實施例8(lS，3R，4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁酰鳥噤呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(74)9ONap79國、,cl..iTBDPSOMe'HO、M錢^*<I72DMTO、7374示意圖8(a)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA,TMSOTf,DCE,回流,2小時；(b)3-羥基丙腈,NaH,THF,4小時；(c)異丁酸酐，DMAP,DMF,60C,24小時；(d)DDQ,CH2C12,H20,室溫，16小時；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(f)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF。亞磷酰胺74可通過與所示的由二乙酸32得到亞磷酰胺67的相同方法由二乙酸53進(jìn)行制備。實施例9(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(83)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>示意圖9(a)草酰氯，DMSO，Et3N，CH2C12，-78°C;(b)MeOCH2Br,Mg,HgCl2，THF，-20°C,由26為>95%;(c)MsCl,Et3N,DMAP,CH2C12,85%;(d)Ac20，AcOH,H2S04,室溫，3小時,84%;(e)尿嘧啶,BSA，TMSOTf,MeCN,回流，2小時；(f)K2C03,MeOH,來自77a-b的產(chǎn)率為89%;(g)DDQ,CH2C12,H20,8小時，室溫，80a和80b的聯(lián)合產(chǎn)率為98%;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF，室溫，16小時；(i)DMTCl,嘧啶，16小時，室溫，90%;(J)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI，DMF,96%。A)醇(75a-b)在-78。C下向草酰氯(2.2mL,25.0mmol)的二氯甲烷(130mL)溶液添加二甲亞砜(3.5mL,50.0mmol)。攪拌30分鐘后，在10分鐘向反應(yīng)中添加醇26(10.0g,16.7mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液。繼續(xù)攪拌45分鐘后，向反應(yīng)中緩慢添加三乙胺(10.5mL，75.0mmol)。添加完成后，去除冰浴并將反應(yīng)逐漸升溫至(TC(約1小時)并轉(zhuǎn)移至分液漏斗。先后以5。/。HCl、飽和碳酸氪鈉溶液和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮以提供醛27，其在高度真空下干燥(18小時)并可在不作純化下4吏用。以干THF(5mL)覆蓋鎂帶(2.5g,102.8mmol)和氯化汞(11)(93mg,0.34mmol)的混合物，并將反應(yīng)物冷卻至-20。C。滴入數(shù)滴純甲氧基甲基溴以起始反應(yīng)。等待數(shù)分鐘后，經(jīng)大約3小時向反應(yīng)加入甲氧基甲基溴(9.33mL，102.8mmol)的THF(12mL)溶液(lmL/10分鐘，通過注射器)。在添加過程中外部浴的溫度小心維持在-20和-25。C之間。間歇(在3小時內(nèi))加入少量的干THF(5mL)以促進(jìn)攪拌。添加溴化物完畢后，在-25。C下攪拌反應(yīng)物100分鐘，然后添加粗品醛(27)的THF(30mL)溶液。在-20。C下攪拌45分鐘后，通過TLC未檢測到起始材料趁27。以飽和氯化銨溶液小心淬滅反應(yīng)并用乙酸乙酯稀釋。以5。/。HCl、飽和)碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以25%至30%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供混合物醇75a-b(定量)(約1:1的異構(gòu)體)。B)甲磺酸(76a-b)向溶于三乙胺(5.3mL,37.9mmol)的醇75a-b(13.38g,20.8mmol)和DMAP(0.36g,2.9mmol)的二氯甲烷(42mL)冷溶液(0。C)添加甲烷磺酰氯(2.3mL,29.2mmol)。攪拌2小時后另外加入甲烷磺酰氯(0.5mL)。繼續(xù)攪拌1小時，以氯仿稀釋反應(yīng)物。先后以5。/qHC1、飽和)瞍酸氪鈉溶液和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以20y。的EtOAc/己烷洗脫)純化提供粘性油狀的甲磺酸76a-b(12.8g,85%)。C)二乙酸(77a醫(yī)b)將濃石克酸(6滴)加入甲磺酸76a-b(12.8g,17.8mmol)的醋酸(50mL)和乙酸酐(10mL)溶液。室溫下攪拌3小時后以LCMS對反應(yīng)物進(jìn)行完全鑒定，并在高度真空下?lián)]發(fā)掉大部分溶劑。用乙酸乙酯稀釋濃縮的混合物，以水、飽和碳酸氫鈉溶液(直至pH〉10)和鹽水洗滌有機(jī)相，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以20%的EtOAc/己烷洗脫)純化^是供祐性油狀的二乙酸77a-b的異頭體混合物(11.44g,84%)。D)核苷(79a-b)向二乙酸77a-b(11.44g,15.0mmol)和尿嘧啶(3.35g,29.9mmol)的CH3CN(75mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(14.76mL,59.9mmol)。40。C加熱15分鐘得到澄清溶液后，在水浴中冷卻反應(yīng)物并添加三甲基珪烷基三氟甲基磺酸鹽(4.06mL，22.5mmol)?；亓?小時后，將反應(yīng)冷卻至室溫并倒入EtOAc。以半飽和石友酸氫鈉和鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗品核苷78a-b，其可在不作純化下使用。向核普78a-b(由前面獲得)的甲醇(130mL)溶液添加石炭酸鉀(5.30g，38.4mmo1)。室溫攪拌16小時后將反應(yīng)物真空濃縮。將殘留物溶劑于乙酸乙酯，用水和鹽水萃取，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以5至7.5%的丙酮/氯仿洗脫)純化提供白色固體的核苷79a-b(9.0g,來自77a-b的產(chǎn)率為89%)。E)核苦(80a和80b)向核普79a-b(9.0g,13.3mmol)的二氯甲烷(130mL)和水(6.5mL)溶液添加DDQ(20.0mmol，4.5g)。將兩相反應(yīng)物在室溫下攪拌2小時，然后再次添加DDQ(向反應(yīng)添加2.75g)。另外2小時后再次向反應(yīng)添加DDQ(l.lg)，繼續(xù)攪拌4小時，然后將反應(yīng)物在冰箱中貯存16小時。第二日早，LCMS顯示了痕量的核脊79a-b，因此再次向反應(yīng)中加入DDQ(0.9g),繼續(xù)攪拌2小時，此時通過TLC和LCMS再未檢測到核苷79a-b。真空揮發(fā)溶劑，并在乙酸乙酯和水之間分配殘留物。以亞4t酸氫鈉溶液(2x)、々包和石友酸氫鈉溶液和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10至20%的丙酮/氯仿洗脫)純化分別提供核脊80a(洗脫較慢的點)和80b(洗脫較快的點)(7.0g，聯(lián)合產(chǎn)率為98%)。F)核苷(81)向核苦80a(6.7g，12.5mmol)和三乙胺(5.2mL,37.4mmol)的THF(120mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(12.2mL,74.8mmol)。室溫攪拌16小時后將反應(yīng)物真空濃縮至干燥。柱層析(Si02,以7.5至12.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供核苷81(混有三乙胺.氫氟酸鹽，產(chǎn)率>100%)，其可在不作進(jìn)一步純化下使用。G)核苷(82)向核普81(約12.5mmol)的嘧啶(75mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl,4.8g,14.3mmol)。在室溫下攪拌16小時后再次向反應(yīng)添加DMTC1(2.4g)。繼續(xù)攪拌4小時后添加MeOH(10mL)。攪拌30分鐘后，以乙酸乙酯稀釋反應(yīng)物，并以水和鹽水洗滌有機(jī)相，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(83)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(1.58mL,5.0mmol)加入核苷82(2.0g,3.3mmo1)、四唾(0.19g,2.6mmol)和N隱甲基咪唾(68(iL,0.83mmol)的DMF(16mL)溶液。室溫攪拌8小時后將反應(yīng)物倒入EtOAc。依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺83(2.54g，96%)。31PNMR(CDC13)S:149.78，149.44。實施例10(lS,3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(86)DMTO9、嶋"0，、8$示意圖10(a)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(i)DMTC1,嘧啶，16小時，室溫，91%;(j)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF，96%。A)核苷(84)向核苷80b(6.43g,12.0mmol)和三乙胺(5.0mL,35.7mmol)的THF(125mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(11.6mL,71.5mmol)。室溫攪拌16小時后將反應(yīng)物真空濃縮至干燥。柱層析(Si02，以7.5至12.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化殘留物提供核苦84(混有三乙胺.氫氟酸鹽，產(chǎn)率>100%),其可在不作進(jìn)一步純化下使用。B)核苷(85)向核苷84(約12.0mmol)的嘧啶(72mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl,4.6g,13.8mmo1)。在室溫下攪拌16小時后再次向反應(yīng)添加DMTC1(2.3g)。繼續(xù)攪拌4小時后添加MeOH(10mL)。攪拌30分鐘后，以乙酸乙酯稀釋反應(yīng)物，并以水和鹽水洗滌有機(jī)相，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析C)(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(86)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(1.58mL,5.0mmol)加入核苷85(2.0g,3.3mmo1)、四唑(0.19g,2.7mmol)和N-甲基咪唑(68(iL,0.83mmol)的DMF(17mL)溶液。室溫攪拌8小時后將反應(yīng)物倒入EtOAc。依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺86(2.55g，96%)。31PNMR(CDC13)5:149.97，149.78。實施例11(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-l-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(92)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>示意圖11(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時98%;(b)POCl3,1，2,4-三唑,Et3N,CH3CN,室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1，4-二惡烷，室溫，16小時；(d)Bz20,DMF，室溫，16小時，來自82的產(chǎn)率為91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF，室溫，16小時，94%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四哇，NMI，DMF,84%。A)核苷(87)將叔丁基二甲基硅烷基氯(2.40g,15.9mmol)添加至核苷82(3.20g,5.3mmol)和咪唑(2.16g，31.8mmol)的DMF(10.6mL)溶液。室溫攪拌16小時后將反應(yīng)物倒入EtOAc。以鹽水萃取有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷87(3.70g,98%)。B)核苷(90)將三氯氧磷(3.86mL,41.4mmol)添加至1,2,4-三哇(12.15g,176.1mmol)的CH3CN(80mL)冷懸浮液(0。C)。攪拌15分鐘后加入三乙胺(29.0mL,207.2mmol),繼續(xù)攪拌30分鐘。在0°C下向反應(yīng)混合物添加核普87(3.70g,5.2mmol)的CH3CN(20mL)溶液。攪拌10分鐘后，去除冰浴并在室溫下攪拌反應(yīng)物4小時。然后真空去除溶劑，在EtOAc和之間分配殘留物。然后以飽和NaHC03和鹽水洗滌有機(jī)相，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮以才是供粗產(chǎn)物88,其可在不作任何純化下使用。將氨水(10mL)添加至核苷88(由前面獲得)的二惡烷(50mL)溶液。在室溫下攪拌16小時后，真空濃縮反應(yīng)物并在高度真空下干燥8小時以^是供核脊89，其可在不作純化下使用。向核苷89(由前面獲得)的DMF(IOmL)溶液添加苯甲酸酐(1.99g,8.8mmol)。室溫攪拌16小時后將反應(yīng)物倒入EtOAc。依次以飽和NaHC03和鹽水萃取有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷90(3.86g，來自87的產(chǎn)率為91%)。C)核苷(91)在聚丙烯管中向核苷90(3.81g,4.7mmol)和三乙胺(1.56mL,11.2mmol)的THF(46mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(4.54mL，27.9mmol)。室溫攪拌16小時后，真空干燥反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc。依次以水、飽和NaHC03和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02,以5%MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷91(3.07g,94%)。D)(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(92)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(0.90mL,4.3mmol)加入核苷91(2.0g,2.8mmo1)、四唑(0.16g，2.3mmol)和N-甲基。米唾(58(iL,0.71mmol)的DMF(14mL)溶液。室溫攪拌8小時后將反應(yīng)物倒入EtOAc。依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并濃縮。將殘留物溶解于最小量的EtOAc，將該溶液添加至己烷。收集所得的沉淀物，進(jìn)一步通過柱層析(Si02,以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺92(2.14g,84%)。31PNMR(CDC13)S:149.82。實施例12(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(98)示意圖12(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，97%;(b)POCl3，1,2,4-三唑,Et3N，CH3CN，室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1，4-二惡烷,室溫，16小時；(d)Bz20,DMF,室溫，16小時，來自93的產(chǎn)率為89%;(e)Et3N.3HF,Et3N，THF,室溫，16小時，89%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四。坐，NMI，DMF,84%。A)核苷(93)將叔丁基二甲基硅烷基氯(2.25g,15.0mmol)添加至核苷85(3.0g,5.0mmol)和咪唑(2.03g，29.9mmol)的DMF(IOmL)溶液。室溫攪拌16小時后將反應(yīng)物倒入EtOAc。以鹽水萃取有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核普93(3.45g,97%)。B)核苷(96)將三氯氧磷(3.59mL,38.5mmol)添加至1,2，4-三唾(11.3g，163.9mmol)的CH3CN(80mL)冷懸浮液(0。C)。攪拌15分鐘后向反應(yīng)中加入三乙胺(27.0mL,192.8mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘。在(TC下向反應(yīng)中添加核苷93(3.45g,4.82mmol)的CH3CN(20mL)溶液。攪拌10分鐘后，去除冰浴并在室溫下攪拌反應(yīng)物4小時。真空去除溶劑，在EtOAc和之間分配殘留物。然后以NaHC03飽和溶液和鹽水洗滌有機(jī)相，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮以纟是供粗產(chǎn)物94，其在不作任何純化下使用。將氨水(10mL)添加至核香94(由前面獲得)的二惡烷(50mL)溶液。在室溫下攪拌16小時，真空濃縮反應(yīng)物并在高度真空下干燥8小時以才是供核香95,其在不作純化下使用。向核苷95(由前面獲得)的DMF(9mL)溶液添加苯甲酸酐(1.63g,7.2mmol)。室溫攪拌16小時后將反應(yīng)物倒入EtOAc。依次以飽和NaHC03和鹽水萃取有機(jī)層，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷96(3.53g,來自93的產(chǎn)率為89%)。C)核苷(97)在聚丙烯管中向核苷96(3.53g,4.3mmol)和三乙胺(1.43mL,10.3mmol)的THF(43mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(4.20mL，25.8mmol)。室溫攪拌16小時后，真空干燥反應(yīng)物并將殘留物溶解于EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，然后干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以25%至40%的丙酮/CHCl3洗脫)純化^是供白色固體的核苦97(2.87g,95%)。D)(lS,3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯曱基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)庚烷(98)將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(1.35mL,4.3mmol)加入核苷97(2.0g,2.8mmo1)、四唑(0.16mg，2.3mmol)和N-甲基咪唑(58nL,0.71mmol)的DMF(14mL)溶液。室溫攪拌8小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc,依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷98(2.15g,84%)。31PNMR(CDC13)5:150.33。實施例13(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(105)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage82</formula>示意圖13(a)6-N-苯甲酰腺嘌呤，BSA,TMSOTf,CH3CN,回流，8小時；(b)K2C03,MeOH，室溫，16小時；(c)Bz20，DMF,室溫；(d)DDQ,CH2C12,H20,室溫；(e)Et3N.3HF，Et3N,THF,室溫，16小時；(f)DMTCl,嘧啶，室溫，16小時；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF。亞磷酰胺105通過所示的由二乙酸混合物77a-b合成亞磷酰胺83的方法由二乙酸77a-b制備。實施例14(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(雨)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>示意圖14(a)Et3N.3HF,Et3N，THF，室溫，16小時；(b)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI,DMF。亞磷酰胺108通過所示的由80b合成亞磷酰胺86的方法由核脊102b制備c實施例15(lS,3R，4R，6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲&)-3-(2-N-異丁酰鳥嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷(114)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage84</formula>示意圖15(a)2-氨基-6-氯嘌呤，BSA，TMSOTf，CH3CN,回流，2小時；(b)3-幾基丙腈，NaH,THF,4小時；(c)異丁酸酐，DMAP,DMF,60°C,24小時；(d)DDQ，CH2C12，H20，室溫，16小時；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫；(f)DMTC1,嘧啶，室溫；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI，固F。亞磷酰胺114通過所示的由二乙酸混合物77a-b合成亞磷酰胺83的方法由二乙酸77a-b制備。實施例16(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁酰鳥嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環(huán)庚烷(in)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage85</formula>示意圖16(a)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(b)DMTC1,嗜啶，室溫，16小時；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI,DMF。亞磷酰胺117通過所示的由80b合成亞磷酰胺86的方法由核苦11lb制備。實施例176-CH2OHBNA合成A)核普118將二甲基亞砜(1.77mL,25.0mmol)逐滴加入草酰氯(1.10mL，12.5mmol)的二氯甲烷(60mL)冷溶液(-78。C)。攪拌30分鐘后，向反應(yīng)中添加醇26(5.0g,8.4mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液。在78。C下繼續(xù)攪拌45分鐘，然后逐滴向反應(yīng)中添加三乙胺(5.05mL,37.5mmo1)。攪拌10分鐘后，去除冰浴并將反應(yīng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage86</formula>示意圖17(a)草酰氯，DMSO,Et3N,CH2C12,-78至0°C;(b)Ph3PCH2Br,nBuLi,THF,-78。C至室溫，來自26的產(chǎn)率為97%;(c)TBAF，THF，室溫，16小時，97%;(d)NaH,BnBr，DMF,室溫，1小時，定量；(e)Os04,NMO，95%丙酮水溶液，室溫，48小時，87%;(f)TBSCI,嘧啶,0°C,4小時，定量；(g)MsCl,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，分別為44%和40%收率;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF,定量；(i)PivCl,DIPEA,DMAP,CH2C12,室溫，16小時；(j)AcOH,Ac20,催化量H2S04,來自125的產(chǎn)率為92%;(k)BSA,尿嘧啶,TMSOTf,CH3CN,回流2小時；(I)K2C03,MeOH,來自127的產(chǎn)率為74%。逐漸升溫至約Or，此時TLC顯示沒有起始醇。以二氯甲烷稀釋反應(yīng)物，并先后以10Q/qHC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮以提供醛27,其不經(jīng)純化用于下一步驟。B)核苷118向三苯基溴化磷(3.88g,10.9mmol)的干THF(60mL)冷攪拌溶液(0。C)逐滴添加nBuLi(2.5M,4.34mL,10.9mmol)。攪拌1小時后，將紅色溶液冷卻至-78°C,并逐滴向反應(yīng)中添加由前面獲得的醛27(8.4mmol)的干THF(15mL)溶液。將反應(yīng)物逐漸加熱至室溫，繼續(xù)攪拌16小時。使用飽和NH4C1小心淬滅反應(yīng)，且反應(yīng)物在EtOAc和水之間分配。然后以鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化^是供無色油狀的烯烴118(4.84g，由26為97%)。C)核苷119將氟化四丁基銨(1M存在于THF中，10,00mL,10.0mmol)添加至烯烴118(4.83g,8.1mmol)的THF(35mL)溶液。室溫攪拌反應(yīng)物16小時后，真空去除溶劑并將殘留物溶解于EtOAc。然后以水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,以40。/。EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的醇119(2.79g，97%)。D)核苷120將氫化鈉(60%w/w存在于礦物油中，0.4g，10mmol)添加入醇119(1.44g,4.1mmol)和苯甲基溴(0.71mL,6.0mmol)的DMF(16mL)冷溶液(0。C)。在0°C下攪拌l小時后，用水小心淬滅反應(yīng)并在EtOAc和水之間分配。以鹽水分離并洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10至25%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化3是4共無色油狀的烯經(jīng)120(1.84g，定量)。E)核苷121將四氧化鋨(25%Os04的iPrOH溶液，lmL)添加至烯烴120(1.80g，4.0mmol)和N-甲基嗎砵畫N畫氧化物(NMO，0.94g,8.0mmol)的95%丙酮/水(25mL)溶液。在室溫下攪拌16小時后，向反應(yīng)中再度添加OsO4溶液(0.5mL)和NMO(0.40g)。攪拌總計48小時后，以EtOAc稀釋反應(yīng)物并以10%NaHS03、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以40%至50%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的二醇121(1.68g，87%,約1:1的異構(gòu)體混合物)。F)核香122和123將TBSC1(0.66g,4.4mmol)添加至二醇121(1.63g,3.4mmol)的嘧咬(17mL)冷溶液((TC)。在0。C下攪拌4小時后，以EtOAc稀釋反應(yīng)物，以水、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥并濃縮。柱層析(Si02,以10至20%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的醇122和123(0.90g和L117g,未指定絕對立體化學(xué))。G)核苷124向醇123(未指定絕對立體化學(xué),0.9g,1.5mmol)、三乙胺(0.46mL,3.3mmol)和二甲基氨基嘧啶(37mg,0.3mmol)的二氯甲烷(5mL)冷溶液(0。C)添加甲烷磺酰氯(0.24mL,3.0mmo1)。在室溫下7小時后，再向反應(yīng)中添加甲基磺酰氯(0.12mL)和三乙胺(0.23mL)。室溫下攪拌9小時后，將反應(yīng)物倒入EtOAc，以10。/。HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10%至15%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供甲磺酸124(0.44g,44%)和起始的二醇123(0.32g,40%)。H)核苷125向甲磺酸124(0.44g,0.6mmol)和三乙胺(0.23mL,1.7mmol)的THF(7mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(0.64mL，4.0mmol)。室溫下攪拌16小時后，以EtOAc稀釋反應(yīng)物，并以飽和NaHCOs、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以50Q/oEtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供醇125(0.40g,定量)。I)核苷127向醇125(0.72mmol,0.4g)、二異丙基乙基胺(DIPEA，0.17mL,1.0mmol)和二甲基氨基嘧啶(12mg,0.1mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液((TC)逐滴添加特戊酰氯(0.12mL，l.Ommol)。去除冰浴，在室溫下攪拌反應(yīng)物2小時，然后再向反應(yīng)中添加DIPEA(0.17mL)和新戊酰氯(0.12mL)，并在室溫下攪拌16小時。然后以EtOAc稀釋反應(yīng)物，以10%HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮得到粗品pivaloate126，其在不作進(jìn)一步純化下^吏用。將濃疏酸(2滴)加入斗且品pivaloate126(由前面獲得)的冰醋酸(2.5mL)和乙酸酐(0.5mL)溶液。在室溫下攪拌2小時后在高度真空下去除溶劑并將殘留物溶解于EtOAc,以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10至15%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的二乙酸127(0.45g，來自125的產(chǎn)率為92%)(異構(gòu)體混合物)。J)核苷129a向二乙酸127(0.45g,0.65mmol)和尿嘧咬(0.15g,1.3mmol)的CH3CN(3.5mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(0.8mL,3.3mmol)。在4(TC下加熱15分鐘以獲得澄清溶液后，向反應(yīng)中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸鹽(0.24mL,1.3mmol)?；亓?小時后，將反應(yīng)冷卻至室溫并倒入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以^是供粗制核苷128a，其在不作任何純化下使用。向核香128a(0.11g,0.15mmol)的MeOH(1.5mL)溶液添加K2CO3(40mg,0.3mmol)。在室溫下攪拌16小時后，真空去除溶劑并在EtOAc和鹽水之間分配殘留物。收集有機(jī)相，干燥(Na2S04)并真空濃縮，提供129a(未確定絕對立體化學(xué))。柱層析(Si02，以35。/。丙酮的CHCl3溶液洗脫)純化提供核苷129a(57mg,由127為74%)。&麗R(CDC13):S9.37(s,1H),7,92-7.61(m,5H),7.55-7.23(m,9H)，5.58(s,IH)，5.43(d,1H，J=8.1)，4.79(d,1H,J-11.7)，4.66(d,1H,J=11.7),4.58(m,2H),4.51(s,IH)，4.44(m,1H),4.05(s，IH)，3.95-3.72(m,4H)。LCMS:保留時間3.34min;M+H計算值517.19，實測值517.1。實施例18<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula>示意圖18(a)N-Bz-胞嘧啶或6-N-Bz-腺嘌呤或2-氨基-6-氯嘌呤，BSA,TMSOTf,MeCH，回流；(b)K2C03,MeOH,室溫，16小時(對于129b-c);(c)NaH,3-幾基丙腈，室溫(對于129d);(d)TMSC1,嘧啶，BzCl或Bz20,DMF(對于130b-c);(e)TMSC1,嘧啶，異丁酰氯(對于130d)核*128b、128c和128d可分別采用N-Bz-胞嘧啶，6-N-Bz-腺噤呤和2-氨基-6-氯嘌呤通過Vorbrugen反應(yīng)由糖前體127制備得到(示意圖18)。以K2C03和MeOH處理128b和128c可分別提供核普129b和129c。以氬化鈉和3-羥基丙腈處理128d可提供核苷129d。以TMSCl瞬時保護(hù)羥基基團(tuán)然后與苯甲酰氯反應(yīng)可分別提供核苷130b和130c?？蛇x擇地，上述轉(zhuǎn)化也可通過以DMF為溶劑，將核普129b和129c與苯甲酸酐反應(yīng)來實現(xiàn)。核苦130d可通過以存在于嘧啶中的過量TMSCl瞬時保護(hù)，再與異丁酰氯反應(yīng)制備得到。實施例196'-取代類似物的制備示意圖19<formula>formulaseeoriginaldocumentpage92</formula>R、R,和R2分別獨立為H、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、耳又代的烯基、取代的炔基或保護(hù)性基團(tuán)可以使用二氯甲烷為溶劑，通過如DAST等氟化劑處理核苷130制備得到核普131。核香132可通過首先以Dess-Martin高價碘或在Swern條件下氧化130的伯鞋基，然后以DAST處理所得的醛制備得到。核香133可通過首先以Dess-Martin高Y介石典或在Swern條件下氧化130的伯羥基，然后在冰醋酸和還原劑(例如，硼氫化氰鈉)存在下以伯胺或仲胺將所得的醛還原胺化制備得到。核苷134可通過先將130的幾基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)(甲磺酸、甲苯磺酸、囟化物)，然后與過量的疊氮化鈉加熱制備得到。核普135可通過先將130的伯醇氧化為羧酸，然后在HATU或任意其它肽偶合劑的存在下與胺反應(yīng)制備得到。核苷136可通過先以羰基二咪唑活化130的羥基基團(tuán)，然后與胺反應(yīng)制備得到。核苷137可通過先以適當(dāng)?shù)膲A將130的羥基基團(tuán)去質(zhì)子化，然后以烷基化試劑淬滅陰離子制備得到。核苷138可通過先將130的羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)，然后以疏醇親核試劑取代制備得到。核苷139可通過還原134的疊氮基團(tuán)，然后與異氰酸酯或異疏氰酸酯反應(yīng)制備得到。核香140可通過還原134的疊氮基團(tuán)并與FmocNCS反應(yīng)提供活化的硫脲進(jìn)行制備。fmoc活化的疏醇在EDC存在下進(jìn)一步與胺反應(yīng)可提供取代胍。去除fmoc保護(hù)性基團(tuán)釋放核苷140。實施例206-取代的BNA亞磷酰胺核普的制備示意圖20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage93</formula>可通過催化氫化去除核苷130-140的3'-和5'-0保護(hù)基團(tuán)制備得到核苷142?；蛘撸赏ㄟ^首先以DDQ去除130-140的3'O-Nap基團(tuán)，然后催化氬化去除5，0-苯甲基基團(tuán)制備得到142。將5'輕基基團(tuán)后續(xù)保護(hù)為二甲氧基三甲苯基醚，然后通過亞磷?；磻?yīng)可提供亞磷酰胺143。實施例21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula>示意圖23(a)DAST,CH2Cl2,.78。C至室溫，16小時，52%(b)DDQ,CH2C12,H20,室溫，8小時，定量，(e)10%Pd/C,H2氣球，50%(d)DMTC1,嘧啶，55%(e)(iPr2)2NPOCH2CH2CN,四唑，麗I，DMFA)核苷(131a)將二乙基氨基三氟化疏(DAST,0.16mL,1.4mmol)加入核香129a(0.1g,0.2mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液(-5(TC)。將反應(yīng)逐漸加熱至室溫并攪拌16小時，然后以飽和NaHC03溶液小心淬滅反應(yīng)。在EtOAc和鹽水之間分配反應(yīng)物，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，33%EtOAc的己烷溶液)純化提供核苦131a(51mg,52%，混有15-20%的開環(huán)雜質(zhì))的異構(gòu)體混合物。19FNMR(CDC13):S-227.98(m)和-231.07(m)。LCMS:保留時間3.84分鐘；M+H計算值519.19，實測值519.1，以及3.89min;M+H計算值519.19,實測值519.1。B)核苷(141a)向核苷131a(51mg，0.1mmol)的二氯甲烷(lmL)和7jc(2滴)溶液添加DDQ(44mg，0.2mmol)。室溫下攪拌8小時后，以EtOAc稀釋反應(yīng)物，并以10%NaHS03溶液、飽和NaHC03溶液、鹽水洗滌有機(jī)相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02,30%丙酮的氯仿溶液)純化提供核苷141a(41mg,作為異構(gòu)體混合物定量)。19FNMR(CDC13):5-229.3(m)和-230.97(m)。LCMS:保留時間2.66分鐘；M+H計算值379.12，實測值379.0。C)核苷(142a)使用氫氣球氫化核苷141a(41mg,由前面獲得)和10%鈀炭(10mg)在甲醇(2mL)中的混合物。3小時后，所有的起始核苦141a被耗盡(通過對反應(yīng)混合物的LCMS分析顯示)。以硅藻土過濾反應(yīng)物并減壓濃縮濾除液。柱層析(Si02，10至20%甲醇的氯仿溶液)純化提供作為異構(gòu)體混合物的核苷142a(14mg，50%)。19FNMR(CDC13):5-231.45(t)和-232.88(dt)。LCMS:保留時間1.72分鐘；M+Na計算值311.08,實測值311.0。D)核苷(142aa)向核苷142a(14mg,0.049mmol)的嘧咬(0.25mL)溶液添加DMTC1(24mg,0.07mmol)。室溫攪拌3小時后將反應(yīng)物減壓濃縮。柱層析(Si02,20至30%丙酮的氯仿溶液)純化提供作為異構(gòu)體混合物的核苷142aa(16mg，55%)。19FNMR(CDC13):S-228.6(t)和-230.91(dt)。LCMS:保留時間3.56分鐘；M+Na計算值613.21,實測值613.1。E)亞磷酰胺(143a)亞磷酰胺143a可參照實施例1的描述通過亞磷酰化(phosphitilation)反應(yīng)由核苷142aa制備得到。實施例22核香亞磷酰胺的合成核香亞磷酰胺可參照此處和本領(lǐng)域(例如但不限于美國專利6,426,220和公開的PCT申請WO02/36743)所述的方法進(jìn)行制備。實施例23寡核普酸和寡核普的合成如本發(fā)明所述的寡聚化合物可通過公知的固相合成技術(shù)進(jìn)行常規(guī)制備。進(jìn)行該種合成的設(shè)備已由多家銷售商出售，例如，AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。本領(lǐng)域已知的任何其它該類合成方法均可額外或替代性采用。使用類似技術(shù)制備寡核普酸如疏代磷酸酯和烷基化衍生物已眾所周知。寡核苷酸未取代和取代的磷酸二酯(P二O)寡核苷酸可在自動化DNA合成儀(AppliedBiosystems394型)上采用被碘氧化的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法合成得到。除以下區(qū)別外，硫代磷酸酯(P二S)的合成類似于磷酸二酯寡核苷酸采用10%w/v的3，H-l,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物的乙腈溶液氧化亞磷酸聯(lián)接以產(chǎn)生疏雜化。該辟^雜化反應(yīng)步驟的時間提高至180秒且在此之前進(jìn)行常規(guī)的帶帽步驟。從CPG柱裂解并在55。C下于濃氨水中去封閉(12-16小時)后，以大于3倍體積的乙醇從lMNH4OAc溶液中沉淀回收寡核苷酸。亞磷酸酯寡核苷酸可參照美國專利5,508,270的描述進(jìn)行制備。烷基磷酸酯寡核普酸可參照美國專利4,469,863的描述進(jìn)行制備。3，-脫氧-3，-亞甲基磷酸酯寡聚核苷酸可參照美國專利5,610,289或5,625,050的描述進(jìn)行制備。亞磷酰胺寡核普酸可參照美國專利5,256,775或5,366,878的描述進(jìn)行制備。烷基疏代磷酸酯寡核苷酸可參照公布的PCT申請PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分別公布為WO94/17093和WO94/02499)的描述進(jìn)行制備。3，-脫氧-3，-氨基磷酰胺酯寡核苷酸可參照美國專利5,476,925的描述進(jìn)行制備。磷酸三酯寡核普酸可參照美國專利5,023,243的描述進(jìn)行制備。硼烷磷酸酯寡核苷酸可參照美國專利5,130,302和5,177,198的描述進(jìn)行制備。寡核苷酸亞甲基甲亞胺基連接的寡核苷(也被稱為MMI連接的寡核苷)、亞甲基二甲基肼連接的寡核苷(也被稱為MDH連接的寡核香)、和亞甲基羰基氨基連接的寡核苷(也被稱為酰胺-3連接的寡核香)、和亞甲基氨基羰基連接的寡核苷(也被稱為酰胺-4連接的寡核苷)，以及具有例如交替的MMI和P=0或P=S聯(lián)接的混合骨架寡聚化合物可參照美國專利5,378,825;5,386,023;5,489,677;5,602，240和5,610,289的描述進(jìn)行制備。甲縮醛和硫甲縮醛連接的寡核苷可參照美國專利5,264,562和5,264,564的描述進(jìn)行制備。環(huán)氧乙烷連接的寡核苷可參照美國專利5,223,618的描述進(jìn)行制備。實施例24寡核苷酸分離從可控孔玻璃固相載體上裂解并在55°。的濃氨水中去封閉12-16小時后，以大于3倍體積的乙醇從lMNH4OAc溶液中沉淀回收寡核香酸或寡核香。合成的寡核苷酸可通過電噴霧質(zhì)譜(分子量測定)和毛細(xì)管凝膠電泳進(jìn)行分析。在合成中獲得的疏代磷酸酯和磷酸二酯聯(lián)接的相對數(shù)量可通過正確分子量相對-16amu產(chǎn)品(+/-32+/-48)的比例進(jìn)行確定。在某些研究中寡核苷酸通過HPLC進(jìn)行純化，例如描述于Chiang等人，J.Biol.Chem,1991,266,18162-18171。HPLC-純化材料所得的結(jié)果通常類似于從非-HPLC純化材料獲得的結(jié)果。實施例25寡核苷酸合成-96孔板形式寡核苷酸可在能夠以96-孔形式同時裝配96個序列的自動化合成器中通過固相P(III)亞磷酰胺化學(xué)法合成得到。磷酸二酯核香酸間聯(lián)接可通過碘水溶液氧化得到。硫代磷酸酯核苷酸間聯(lián)接可通過使用無水乙腈中的3,H-1,2苯并二硫醇-3-酮l,l-二氧化物(Beaucage試劑)疏化得到。標(biāo)準(zhǔn)的堿基被保護(hù)的卩-氰乙基-二異丙基亞碌酰胺可從銷售商(例如PE-AppliedBiosystems,FosterCity:CA或Pharmacia,Piscataway,NJ)處購得。非標(biāo)準(zhǔn)核苷可參照標(biāo)準(zhǔn)和專利方法進(jìn)行合成。它們可作為堿基保護(hù)的(3-氰乙基-二異丙基亞磷酰胺。寡核苷酸從載體上裂解并在升高的溫度(55-60。C)下在濃NH4OH中去保護(hù)12-16小時，在真空下干燥所釋放的產(chǎn)品。將干燥的產(chǎn)品重懸于無菌水中以提供主平板，從該平板上使用機(jī)械移液管稀釋得到所有的分析和測試平板樣本。實施例26采用96-孔板形式進(jìn)行寡核普酸分析各徵孔中的寡核香酸濃度可通過稀釋樣本和UV吸收廣譜測定。單個產(chǎn)品的全長完整性可以96-孔形式(BeckmanP/ACETMMDQ)或針對單獨制備的樣本在商用毛細(xì)管電泳設(shè)備(例如，BeckmanP/ACE5000,ABI270)上通過毛細(xì)管電泳(CE)進(jìn)行評估。堿基和骨架組成可采用電噴霧質(zhì)譜對寡聚化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析確定。所有的測試平板均從主平板采用單和多道機(jī)械移液器稀釋得到。如果平板上至少85%的寡聚化合物具有至少85%全長，則可認(rèn)為該平板可接受。實施例27細(xì)胞培養(yǎng)和寡核香酸處理寡聚化合物對耙標(biāo)核酸表達(dá)的作用可在各種細(xì)胞類型中進(jìn)行測試，只要該靶標(biāo)核酸以可測水平在該細(xì)胞類型中存在。這可通過使用，例如PCR或Northern印跡分析等方法常^見測定。來自多種組織和物種的細(xì)胞系可從美國菌種保藏中心(ATCC,Manassas,VA)獲得。下列提供的細(xì)胞類型僅供闡述目的，也可常規(guī)采用其它細(xì)胞類型，只要把標(biāo)在選定的細(xì)胞類型中表達(dá)。這可通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如，Northern印跡分析、核糖核酸酶保護(hù)測定或RT-PCR等進(jìn)行簡便的測定。b.END細(xì)胞小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞系b.END由MaxPlank研究所(BadNauheim，Germany)的WernerRisau博士提供。b.END細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于添加了100/o胎牛血清(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)的高糖DMEM中(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)。在匯合度達(dá)到約90%時，通過胰蛋白酶化和稀釋進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞傳代。將細(xì)胞以大約3000細(xì)胞/微孔的密度接種至96-孔板(Falcon-Primaria#353872,BDBiosciences,Bedford,MA)，從而用于包括但不限于寡聚化合物轉(zhuǎn)染實驗。涉及以寡聚化合物處理細(xì)胞的實驗當(dāng)細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)?shù)膮R合度時，采用所述的轉(zhuǎn)染方法以寡聚化合物對其進(jìn)行處理。UPOFECTIN當(dāng)細(xì)胞達(dá)到65-75%匯合度時，以寡核苷酸對其進(jìn)行處理。將寡核苷酸與LIPOFECTINTM(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)在Opti-MEMTM-l低血清培養(yǎng)基(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中混合，以實現(xiàn)寡核普酸的理想濃度，且LIPOFECTINTM的濃度為每100nM寡核香酸2.5或3pg/mL。將該轉(zhuǎn)染混合物在室溫下孵育約0.5小時。細(xì)胞生長于96-孔板時，以100nLOPTI-MEMTM-l洗滌微孔一次，然后以130pL轉(zhuǎn)染混合物處理。類似地，用適當(dāng)體積的培養(yǎng)基和寡核香酸處理生長于24-孔板或其它標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)板中的細(xì)胞。重復(fù)兩次或三次處理細(xì)胞并取得數(shù)值。在37。C下處理約4-7小時后，以新鮮培養(yǎng)基替換含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基。寡核普酸處理后16-24小時采集細(xì)胞。本領(lǐng)域已知的其它適用轉(zhuǎn)染試劑包括，但不限于，CYTOFECTINtm、LIPOFECTAMINEtm、OLIGOFECTAMINEtm和FUGENE。本領(lǐng)域已知的其它適用的轉(zhuǎn)染方法包括，但不限于電穿孔。實施例28寡核普酸抑制靶標(biāo)表達(dá)的分析靶標(biāo)表達(dá)的反義調(diào)節(jié)可通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行測定。例如，耙標(biāo)mRNA水平可通過，例如，Northern印跡分析、竟?fàn)幮跃酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或?qū)崟rPCR進(jìn)行定量。目前希望采用實時定量PCR?？蓪偧?xì)胞RNA或poly(A)+mRNA進(jìn)行RNA分析。本發(fā)明的一種RNA分析方法采用總細(xì)胞RNA，如本文其它實施例中所描述。RNA分離的方法已為本領(lǐng)域公知。Northern印跡分析也是本領(lǐng)域的常i見方法。實時定量(PCR)通過^^用來自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA的ABIPRISM7600、7700或7900序列檢測系統(tǒng)并參照生產(chǎn)商iJt明得以便利地實現(xiàn)。靶標(biāo)蛋白水平可通過本領(lǐng)域公知的多種方法進(jìn)行定量，例如免疫沉淀、Western印跡分析(免疫印跡)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或焚光激活細(xì)胞分類(FACS)。針對靶標(biāo)的抗體可從多種來源例如抗體的MSRS目錄(AerieCorporation,Birmingham,MI)鑒定并獲得，或者可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)單克隆或多克隆抗體生成方法制備得到。制備多克隆抗血清的方法可參見，例如，Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻,第11.12.1-11.12.9頁，JohnWiley&Sons,Inc.，1997。單克隆抗體的制備可參見，例^口，Ausubel，F(xiàn).M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.4.1-11.11.5頁，JohnWiley&Sons,Inc.,1997。免疫沉淀法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，并可參見例如，Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.16.11頁，JohnWiley&Sons,Inc.,1998。Western印跡(免疫印跡)分析是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，并可參見例如,Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.80.21頁，JohnWiley&Sons,Inc.,1997。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，并可參見例如，Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.4.1-11,2.22頁,JohnWiley&Sons:Inc.，1991。實施例29對把標(biāo)抑制劑用途的表型測定和體內(nèi)研究的設(shè)計表型測定一旦把標(biāo)抑制劑通過此處披露的方法進(jìn)行鑒定，可在一個或多個表型測定中進(jìn)一步考察該寡聚化合物，其中每個測定具有預(yù)示對特定疾病狀態(tài)或癥狀進(jìn)行治療的效力的可測端點。表型測定、其中適用的試劑盒和試劑已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并在此處用于考察靶標(biāo)在健康和疾病中的作用和/或關(guān)聯(lián)。代表性的表型測定(可從多個銷售商中購得)包括測定細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性、擴(kuò)增或細(xì)胞存活的測定(MolecularProbes,Eugene,OR;PerkinElmer,Boston,MA)，基于蛋白的測定包括酶法測定(Panvera，LLC,Madison,WI;BDBiosciences,FranklinLakes,NJ;OncogeneResearchProducts,SanDiego,CA)，纟田月包調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥、氧化過禾呈以及凋亡(AssayDesignsInc.,AnnArbor,MI)、甘油三酉旨積累(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)、血管生成測定、管道形成測定、細(xì)胞因子和激素觀'J定以及^U射觀'J定(ChemiconInternationalInc.,Temecula，CA;AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。在一個非限制性實例中，經(jīng)測定適用于特定表型測定的細(xì)胞(即，選擇用于乳腺癌研究的MCF-7細(xì)胞；用于肥胖研究的脂肪細(xì)胞)用體外研究鑒定的耙標(biāo)抑制劑和對照化合物在最佳濃度下處理(通過上述方法測定的)。在處理末期，用一種或多種對測定特異的方法來分析經(jīng)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞來確定表型結(jié)果和終點。表型終點包括細(xì)胞形態(tài)隨時間或處理劑量的變化以及細(xì)胞成分如蛋白、脂質(zhì)、核酸、激素、糖或金屬等的水平變化。對細(xì)胞狀態(tài)(包括pH、細(xì)胞周期階段、細(xì)胞對生物指示劑的攝取或排除)的檢測通常是感興趣的。對處理后的細(xì)胞中一種或多種基因表達(dá)的檢測同樣可用作把標(biāo)抑制劑的效力或功效的指示。同時檢測經(jīng)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞中的純度印記基因或懷疑與特定疾病狀態(tài)、癥狀或表型有關(guān)的那些基因。體內(nèi)研究本文所述的體內(nèi)研究中的個體對象為溫血脊推動物，包括人。實施例30RNA分離Poly(A)+mRNA分離Poly(A)+mRNA的分離可參照Miura等人的方法(Clin.Chem.,1996，42,1758-1764)。其它的poly(A)+mRNA分離方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。簡言之，對于生長于96-孔板的細(xì)胞，從細(xì)胞去除生長培養(yǎng)基并以200冷PBS洗滌每個微孔。向每個孩i孔添加60nL裂解緩沖液(IOmMTris-HCl，pH7.6,1mMEDTA，0.5MNaCl，0.5%NP-40,20mM氧釩-核糖核苷復(fù)合物)，輕柔搖動平板并在室溫下孵育五分鐘。將55|iL裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至涂覆了寡聚d(T)包被的96-孔板(AGCTInc.,IrvineCA)。將平板在室溫下孵育60分鐘，以200洗滌緩沖液(10mMTris-HClpH7.6,1mMEDTA，0.3MNaCl)洗滌3次。末次洗滌后，以紙巾吸去多余的洗滌緩沖液，然后空氣干燥5分鐘。將預(yù)熱至7(TC的60pL洗脫緩沖液(5mMTris-HClpH7.6)添加至各微孔，將平板在90°C熱板上孵育5分鐘，然后將洗脫物轉(zhuǎn)移至新鮮的96-孔板。生長于100mm或其它標(biāo)準(zhǔn)平板的細(xì)胞也可采用適當(dāng)體積的所有溶液進(jìn)行類似處理?？俁NA分離總RNA可采用由QiagenInc.(Valencia,CA)購得的RNEASY96頂試劑盒和緩沖液并參照生產(chǎn)商的推薦方法進(jìn)行分離。簡言之，對于生長于96-孔板的細(xì)胞，從細(xì)胞去除生長培養(yǎng)基并分別以200冷PBS洗滌每個微孔。向每個微孔添加150緩沖RLT并將平板劇烈搖動20秒。將150的70%乙醇添加至各微孔，然后通過上下吹吸三次混合內(nèi)含物。隨后將樣本轉(zhuǎn)移至裝配了廢物采集盤并連接至真空源的QIAVactm集流腔所連接的RNEASY96tm孔板上。抽真空1分鐘。將500[iL緩沖RW1添加至RNEASY96頂板的各微孔中并孵育15分鐘，再次抽真空1分鐘。再次將500|iL緩沖RW1添加至RNEASY96tm板的各微孔中并再次抽真空2分鐘。然后將1mL的緩沖RPE添加至RNEASY96tm板的各微孔中并抽真空90秒鐘。重復(fù)用緩沖RPE洗滌，再次吸真空3分鐘。然后從QIAVACTM集流腔取走平板并用紙巾吸干。重新將平板連接至裝配了含1.2mL采集管的采集管架的QIAVACtm集流腔。然后通過向各微孔中移入140無RNA酶的水，孵育1分鐘，抽真空3分鐘洗脫RNA。重復(fù)移液和洗脫步驟可通過QIAGENBio-Robot9604(Qiagen,Inc.,ValenciaCA)自動完成。簡言之，裂解培養(yǎng)平板上的細(xì)胞之后，將平板轉(zhuǎn)移至進(jìn)行移液、DNA酶處理和洗脫步驟的機(jī)械平臺上。實施例31耙標(biāo)mRNA水平的實時定量PCR分析耙標(biāo)mRNA水平可采用ABIPRISM7600、7700或7900序列檢測系統(tǒng)(PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)并參照生產(chǎn)商的i兌明通過實時定量PCR實現(xiàn)定量。這是一個閉管、非凝膠式熒光檢測系統(tǒng)，其允許對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物進(jìn)行實時高通量定量。與擴(kuò)增產(chǎn)物在PCR完成后定量的標(biāo)準(zhǔn)PCR不同，在實時定量PCR中的產(chǎn)物在其積累時定量。這一點可通過在PCR反應(yīng)中包含在正向和反向PCR引物之間特異性退火并包含兩個熒光染料的寡核苷酸探針來實現(xiàn)。報告染料(例如，F(xiàn)AM或JOE，來自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,OperonTechnologiesInc.,Alameda,CA或IntegratedDNATechnologiesInc.,Coralville,IA)被連接至探針的5'端而淬火染料(例如，TAMRA，來自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,OperonTechnologiesInc.,Alameda,CA或IntegratedDNATechnologiesInc.,Coralville,IA)被連接至探針的3'端。當(dāng)探針和染料完整時，報告染料的發(fā)射被鄰近的3'端淬火染料淬滅。在擴(kuò)增過程中，探針與靶標(biāo)序列的退火生成能被Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性裂解的底物。在PCR擴(kuò)增周期的延伸階段，Taq聚合生成了序列特異性熒光信號。在每一個周期中，附加的報告染料分子從其相應(yīng)的探針中裂解，并可通過整合在ABIPRISMTM序列檢測系統(tǒng)中的激光鏡頭定期監(jiān)測熒光強(qiáng)度。在每一個測定中，一系列包含來自未處理對照樣本的mRNA系列稀釋物的平行反應(yīng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，它可用于對測試樣本進(jìn)行反義寡核苷酸處理后的抑制百分比進(jìn)行定量。在定量PCR分析之前，對被測耙標(biāo)基因特異性的引物-探針組與GAPDH擴(kuò)增反應(yīng)的"多重性(multiplexed)"能力進(jìn)行評估。在多重化中，耙標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因GAPDH在單個樣本中同時擴(kuò)增。在該分析中，從未處理細(xì)胞中分離的mRNA被系列稀釋。各稀釋物可在僅特異性耙向GAPDH、僅特異性耙向靶標(biāo)基因("單重")或?qū)烧叨继禺?多重)的引物-探針組的存在下擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增之后，可同時從單重和多重樣本生成作為稀釋函數(shù)的GAPDH和耙標(biāo)mRNA信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果從多重樣本中生成的GAPDH和靶標(biāo)信號的斜率和相關(guān)聯(lián)系數(shù)均小于從單重樣本所得相應(yīng)數(shù)值的10%之內(nèi)，則該對把標(biāo)具有特異性的引物-探針組可認(rèn)為具有多重性。其它PCR方法已為本領(lǐng)域所知。RT和PCR試劑可從InvitrogenLifeTechnologies(Carlsbad,CA)獲得。RT，實時PCR可通過向含有30jiL總RNA溶液(20-200ng)的96-孔板添加20PCR混合物(2.5x無MgCl2PCR緩沖液，6.6mMMgCl2,dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375^M,正向引物和反向引物各375nM，125nM探針，4單位RNA酶抑制劑，1.25單位PLATINUMTaq，5單位MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及2.5xROX染料)得以實現(xiàn)。RT反應(yīng)可通過在48i:下孵育30分鐘得以實現(xiàn)。在95°C下聘育10分鐘以激活PLATINUMTaq后，進(jìn)行40個循環(huán)的兩步PCR法95。C下進(jìn)行15秒(變性)后在6(TC下進(jìn)行1.5分鐘(退火/延伸)。通過RT，實時PCR得到的基因目標(biāo)量通過GAPDH(—種表達(dá)恒定的基因)的表達(dá)水平或通過以RIBOGREEN(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)定量總RNA來歸一化。GAPDH表達(dá)可通過與靶標(biāo)同時多重或單獨運行實時RT-PCR來定量?？俁NA可采用RiboGreenRNA定量試劑(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)進(jìn)行定量。通過RIBOGREENtm迸行RNA定量的方法可參見Jones,L.J.,等人，(AnalyticalBiochemistry,1998,265,368-374)。在該測定中，170|iL的RIBOGREENTM工作試劑(RIBOGREENTM試劑以1:350稀釋于10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)以移液管移入含有30|iL純化細(xì)胞RNA的96-孔板。在CytoFluor4000(PEAppliedBiosystems)中讀板，激發(fā)波長為485nm,發(fā)射波長為530nrn。實施例32靶標(biāo)特異性引物和探針可采用公開的序列信息設(shè)計探針和引物，與把標(biāo)序列雜交。例如，對于人PTEN，可使用公開的序列信息(GENBANRTM錄入號U92436.1,SEQIDNO:l)設(shè)計下列引物-探針組正向引物AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQIDNO:2)反向引物TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQIDNO:3)以及PCR探針FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQIDNO:4),其中FAM為熒光染料，TAMRA為淬火染料。實施例33草巴標(biāo)蛋白水平的Western印跡分析Western印跡分析(免疫印跡分析)可采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。在寡核苷酸處理后16-20小時采集細(xì)胞，以PBS洗滌一次，懸浮于Laemmli緩沖液(100pl/微孔)，煮沸5分鐘并上樣至16%SDS-PAGE凝膠。在150V下跑膠1.5小時，并轉(zhuǎn)移到膜上進(jìn)行western印跡。采用適當(dāng)?shù)尼槍Π覙?biāo)的一抗，以及針對該一抗的放射標(biāo)記或焚光標(biāo)記的二抗。采用PHOSPHORIMAGER(MolecularDynamics,SunnyvaleCA)顯示條帶。實施例34耙向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-0-CH3BNA2-10-2帶間隙寡聚體體外研究如本發(fā)明所述，合成寡聚化合物并在一定劑量范圍內(nèi)檢測其減少PTEN表達(dá)的能力。采用此處所述的方法以0.3125、0.0625、1.25、2.5、5、10或20nM濃度的6-(R或S)-CH3-BNA(分別為392748和392749)以及6-(R或S)-CH2-OCH3(分別為396004和396005)修飾的寡聚體處理b.END細(xì)胞。如此處其它實施例所述，PTEN的表達(dá)水平可通過實時PCR測定并對RIBOGREEN歸一化。所得的劑量-響應(yīng)曲線可如下所示用于測定EC50。可在pH7的含0.1mMEDTA的100mM磷酸鹽緩沖液中于260nm下使用4|iM6-(R或S)-CH3-BNA或6-(R或S)-CH2-0-CH3修飾的寡聚體和4(iM互補(bǔ)RNA評估Tm。<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>所有的核苷間聯(lián)接為硫代磷酸酯，粗體的核香為6-(R或S)-CH3BNA核普，加下劃線和粗體的核香為6-(R或S)-CH2-0-CH3BNA核香，而下標(biāo)R和S表示了在6位碳原子處的構(gòu)型。應(yīng)當(dāng)指出6-修飾的BNA寡聚化合物顯示了更大的效力，盡管它的Tm略微下降。實施例35耙向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CHrBNA2-10-2帶間隙的寡聚體體內(nèi)研究在3周中每周兩次向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射劑量為0.5或2|imol/kg的把向PTEN的6-CHrBNA修飾寡聚體(6-(S)或6-(R))。在最后一次施用后48小時處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行比較(%UTC)。SEQH>NO.組成(S，至3，)劑量％UTC/腿腸*《鹽水10005/392748C'及U/TAGCACTGGCQfU及2.03105/392748CUffTAG(:ACTGGCC0.58105/392749CyJiTAGCACTGGCCsUs2,02305/392749C函TAGCACTGGCC美0.573所有的核苷間聯(lián)接為硫代磷酸酯，粗體核苷為6-CH3-BNA核普而下標(biāo)R和S表示了在6位^_原子處的構(gòu)型。實施例36靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CHrBNA2-10-2帶間隙的寡聚體體內(nèi)研究向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次劑量為1、2、4或8(imol/kg的靶向PTEN的6-CHrBNA修飾的寡聚體(6-(S)或6-(R))。在施用后72小時處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行比較(。/。UTC)。<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>所有的核苷間聯(lián)接均為疏代磷酸酯，粗體和帶下劃線的核苷為6-CHrO-CH2-BNA核普而下標(biāo)S和R表示了6位碳原子處的構(gòu)型。實施例38以SVPD處理的6-(R或S)-CH3-BNA修飾的寡聚體的核酸酶穩(wěn)定性6-(R或S)-CH3-BNA(分別為392748和392749)修飾的寡聚體的核酸酶穩(wěn)定性可采用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)進(jìn)行測定。該研究分別包括了可進(jìn)行比較的6-未取代的間隙體(gapmer)(4'-CH2-0-2，橋連的BNA，392745，下標(biāo)l)和2，-0-MOE間隙體(2，-0-(CH2)2-OCH3，392753,下標(biāo)e)。各寡聚體制備為含有以下成分的500(iL混合物5)iL100寡聚體，50含于SVPD緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5，8mMMgCl2)的0.5單位/mL磷酸二酯酶，其最終濃度為0.05單位/mL,445pLSVP緩沖液。將樣本在37。C下于水浴中孵育。在第0、1、2和4天取等份(100(iL)并在第1和2天添加新鮮的酶。在等份取出后立即添加EDTA以終止酶活性。在IPHPLC/MS上分析樣本。SEQM)NO'組成(5'至3，)第4天全長％艦SNO,05/392748C教U及TAGCACTGGCC及Ui>9005/392749C函TAGCACTGGCC函>7005/392745CiUiTAGCACTGGCCWi>400S艦753CATAGCACTGGCC具>30SEQIDNO.在24小時的組在48小時的組在96小時的組/ISISNO.成％成％成％05/—神27站100%89%92%0S/392灘96%纖74%05/39274567%56%48%05/39275358%46%36%所有的核苷間聯(lián)接為疏代磷酸酯，粗體核苷為修飾的核苷，下標(biāo)R和S表示了6-CH3-BNA核苦在6位碳原子的構(gòu)型，下標(biāo)e表示了2'-OMOE核普而下標(biāo)1表示了4，-CH2-0-2，修飾的核苷。含有6-甲基取代的BNA的化合物實施例39以SVPD處理的6-(R或S)-CH3-BNA、4，-CHrO-2，BNA和2，-0-MOE修飾的寡聚體的核酸酶穩(wěn)定性6-CH3-BNA修飾的寡聚體的核酸酶穩(wěn)定性可采用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)進(jìn)行測定。各寡聚體制備為含有以下成分的90混合物51iL寡聚體(2pL5pM寡聚體和35，32p-標(biāo)記的寡聚體)、75H20以及1010x緩沖液(500mMTris-HCl，700mMNaCl以及140mMMgCl2，pH8.6)。在0分鐘，從上述制備的寡聚體樣本取出9并添加至10(iL終止緩沖液(6.67M尿素，16.67%甲酰胺和83.3mMEDTA)然后添加1|iLH20并在IO(TC下加熱2.5至3分鐘。通過添加9SVPD(0.5單位/mL)開始測定動力學(xué)。最終的酶濃度為0.05單位/mL。將每等份的10寡聚體動力學(xué)溶液添加至10(iL終止緩沖液并按如上所述熱滅活。取l、3、9、27、80、240和1290為動力學(xué)時間點。通過12%丙烯酰胺PAGE在45瓦特/凝膠下跑2小時分析樣本。認(rèn)<|ID膽./腳膽，06/39542107/39542307/395424鵬9542S06/7157組成(5'至3')TTTTTTTTTTU禍TTTTTnTTTTT修飾粗體2-O-MOE粗體4,-CH2-0-2,粗體6-(R〗-CH3未修飾的.(2鄰所有的核苷間聯(lián)接均為疏代磷酸酯，粗體核普為修飾的核苷，下標(biāo)R和S表示了6-CHrBNA核普在6位碳原子的構(gòu)型，下標(biāo)e表示2'-0-M0E核脊而下標(biāo)1表示4，-CHrO-2，修飾核苷。SEQIDNO.在3分鐘的在27分鐘的在80分鐘的在240分鐘在12卯分鐘組成％組成％組成％的組成％的組成％06/39542168.727.917.211.69.007/39542332.64.72.52.22,207/39542496.4狄l83.279.072.007/395425鄰.O86.383.782.70頻575.2L22,0i,70,9,實施例40在三周、多劑量j本內(nèi)研究中耙向PTEN的6-(S)-CH3-BNA、4，-CH2-0-2-BNA和2'-0-MOE修飾的寡聚體在三周中每周兩次向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射劑量為3.2、1.0、0.32和0.1pmol/kg(以下僅顯示了3.2和1(imol/kg的數(shù)據(jù))的靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA(2-10-2,14-聚體)、4，-CH2-0-2，-BNA(2-10-2，14-聚體)和2，-0-MOE(5-10-5,20-聚體)修飾的寡聚體。在最后一次施用后48小時處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行比較(G/oUTC)。處死后測定血漿化學(xué)和肝重。SEQIDNO,組成(5，至3')劑量％UTCALT鹽水i節(jié)41,305/392749C函TM3CACTCK3CC函124.329.803/392稀C函TAOCACTGGCC胸13624.S05/392063C,線TAGCACTGGCCiU畫3,24.2279.308/392063詠C,WTAGCACTGGC,CiT,12641.009/116847CeTeG,CTAGCCTCTGG15341.3ATtHPra^*《le*e^"^e^e所有的核普間聯(lián)接為硫代磷酸酯，粗體核香為修飾的位置，下標(biāo)s表示6-(S)-CH3-BNA,下標(biāo)1表示4，-CH2-0-2，BNA,下標(biāo)e表示2，-OM0E而MeC表示5'-甲基胞嘧啶核苷。在研究的最高點，含4，-CH2-0-2，BNA(392063，3.2(imol/Kg劑量組)的寡聚體的高劑量組動物顯示肝重明顯升高的(相對鹽水為153%)。與之相對，含6-(S)-CH3BNA(392749，3.2fimol/Kg劑量組)寡聚體的肝重為鹽水組的117%。含2'O-MOE(116847,1.0|imol/Kg劑量組)寡聚體的肝重為鹽水組的116%。該實施例證明了6-(S)-CH3-BNA修飾在允許設(shè)計的反義寡聚體保持4'-CH2-0-2，BNA所賦予的效力的同時，其ALT水平相對4'-CH2-0-2，BNA修飾的化合物有顯著提升。實施例41耙向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-OCH3、4，-CH2-0-2，BNA2-10-2帶間隙的寡聚體體內(nèi)研究向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次劑量為2.5、5、10和201imol/kg(以下僅顯示了5和10(imol/kg的數(shù)據(jù))的耙向PTEN的修飾的6-(R或S)-CH3(分別為396568和396024)、6-(R或S)畫CH2-OCH3(分別為396007和396008)、4,-CH2-0-2，BNA2-10-2帶間隙的寡聚體(6-(S)或6-(R))。在施用后66小時處死小鼠。將肝組織勻漿化。SEQIDNO.組成(5'至3')劑量ALT腦)S肌鹽水41.305應(yīng)024CsU5TAGCACTGGCC:函10250.505/3卿24C函TAGCACT冊CC《U5'572.005/3賜S68C，炎TAGCACTGGCC:函10234.3C函TAGCACTGGCC函562.005jQ^TAGCACTGGCg^10129,S0S/39,gg^TAGCACTGGCgg^5鄉(xiāng).O05/3卿07g^TAGCACTOGCSia10柳05/39,^^TAGCAC',CS^50咖2啦MeC，T,TAGCACTGGC^C'T,10925,008鵬oe綠C,TiTAGCACTGGC隱CiT,5373.0所有的核苷間聯(lián)接均為硫代磷酸酯，粗體的核苷為修飾的核苷，下標(biāo)R和S表示所示的6-CH3-BNA(僅粗體)和6-CHrO-CH3-BNA(粗體并帶下劃線)核苷在6位碳原子的構(gòu)型，下標(biāo)1表示4，-CH2-0-2，核苷而Mec表示5'-甲基胞嘧咬核脊。上述寡核苷中，一個寡核苷(IsisNo.392063)在6位碳原子處不含手性核普，其中其它四個(IsisNo.396024、396568、396008和396007)在6位石友原子處含手性的核苷。特別地，這四個寡核苷在1、2、13和14位具有一個該種核苷。在肝中，在6位碳原子處不含手性核苷的寡核苷比包括在6位碳原子處含手性核苷的四個寡核苷具有相對更高的毒性。實施例42輩巴向PTEN的2-14-2帶間隙的寡聚體體內(nèi)研究在向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次劑量為2或10(imol/kg的靶向PTEN的6-CH3-BNA修飾的寡聚體。在施用后72小時處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進(jìn)行比較(Q/oUTC)。SEQIDNO.組成(5，至3，)修飾艦SNCX10/394420wCeTeGCTAGCCTCT<3GATTeTe粗體2'-OMOE1i/4助522mCRUR<3CTA(3CCTCTGGATURUR粗體6"(R)-CH311/4徹523mCsUsGCTAC3CCTCTGGATUsUs粗體11/400524mCRURGCTA<}CCTCTGGATCRUR粗體6-(R)-CH2-0-CH31i/40052S"CsUsGCTAGCCTCTGGATUsUs粗體6-(S)-CH2-OCH3ISISNO.劑量％UTC標(biāo)準(zhǔn)偏差鹽水湖％12%39442079%2%3944201026%11%柳522218%3%400522104%0%400523217%2%400523104%1%400524之23%7%40052410條0%柳525221%3%400525103%0%所有的核苷間聯(lián)接均為硫代磷酸酯，粗體的核普為修飾的核苷，下標(biāo)R和S表示所示的6-CH3-BNA和6-CH2-0-CHrBNA核苷在6位碳原子的構(gòu)型，下標(biāo)e表示2'-0-MOE核苷而MeC表示5'-甲基胞嘧啶核苷。此處所引用的所有出版物、專利和專利申請均納入本文作為參考。盡管在前述的說明書中本發(fā)明通過某些優(yōu)選實施方案進(jìn)行了描述，且為了闡述的目的列舉了眾多具體內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然理解本發(fā)明可采用其它的實施方案，且此處所述的某些具體內(nèi)容可在不悖離本發(fā)明基本原則的情況下進(jìn)行相當(dāng)?shù)母淖儭?quán)利要求1.一種雙環(huán)核苷，其具有下式其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T1是H或羥基保護(hù)基團(tuán)；T2是H、羥基保護(hù)基團(tuán)或活性磷基團(tuán)；Z是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的?；⑷〈孽０?、硫醇或取代的硫；且其中各被取代的基團(tuán)獨立地由任選被保護(hù)的取代基單或多取代，該取代基獨立地選自鹵素、氧代、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中各J1、J2和J3分別獨立為H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中Z是C廣C6烷基或取代的d-Q烷基。3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中Z是甲基。4.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中Z是取代的CrC6烷基。5.如權(quán)利要求4所述的化合物，其中所述的取代基為CrC6烷氧基。6.如權(quán)利要求4所述的化合物，其中Z是CH30CH2-。7.如權(quán)利要求1-6任意一項所述的化合物，其中所迷Z基團(tuán)為(R)-構(gòu)型:T「C>i、oBx8.如權(quán)利要求1-6任意一項所述的化合物，其中所述Z基團(tuán)為(S)-構(gòu)型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>9.如權(quán)利要求1-8任意一項所述的化合物，其中T！和T2中至少一個為羥基保護(hù)基團(tuán)。10.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中所述的羥基保護(hù)基團(tuán)分別獨立選自苯甲基、苯甲酰、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、甲磺酸、甲苯磺酸、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃噪呤-9-基(MOX)。11.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中Tt選自乙?；⒈郊谆?、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基以及二甲氧基三苯甲基。12.如權(quán)利要求ll所述的化合物，其中所述的Ti為4,4，-二甲氧基三苯甲基。13.如權(quán)利要求l-8任意一項所述的化合物，其中T2為活性磷基團(tuán)。14.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中所述的活性磷基團(tuán)為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺或H-磷酸酯。15.如權(quán)利要求1-8任意一項所述的化合物，其中T\為4,4，-二甲氧基三苯甲基，T2為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺。16.—種寡聚化合物，其具有至少一個具有下式的單體或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中Bx是雜環(huán)石威基部分；T3為H、鞋基保護(hù)基團(tuán)、聯(lián)接的共軛基團(tuán)或與核苷、核苷酸、寡核香、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核香間聯(lián)接基團(tuán)；T4為H、羥基保護(hù)基團(tuán)、聯(lián)接的共軛基團(tuán)或與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)；其中至少T3和T4之一為與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核普酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核普間聯(lián)接基團(tuán)；且Z是C廣C6烷基、C2-Q歸基、C2-C6炔基、取代的d-Q烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、?；?、取代的?；⑷〈孽０?、硫醇或取代的硫。17.如權(quán)利要求16所述的寡聚化合物，其中各被取代的基團(tuán)獨立地被任選被保護(hù)的取代基單或多取代，該取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OJi、NJ山、SJ!、N3、OC(-X)JbOC^X)NJ!J2、NJ3C(二X)NJ!J2和CN，其中各Ji、乙和J3獨立為H或C廣C6烷基，X是O、S或Nh。18.如權(quán)利要求16所述的寡聚化合物，其中各Z獨立地為CVC6烷基或取代的CrCe烷基。19.如權(quán)利要求18所述的寡聚化合物，其中至少一個Z為甲基。20.如權(quán)利要求18所述的寡聚化合物，其中至少一個Z為取代的d-C6烷基。21.如權(quán)利要求20所述的寡聚化合物，其中各所述取代基為CH^烷氧基。22.如權(quán)利要求20所述的寡聚化合物，其中至少一個Z為CH3OCH2-。23.如權(quán)利要求16-22任意一項所述的寡聚化合物，其中各Z為甲基或CH3OCH2-。24.如權(quán)利要求16-23任意一項所述的寡聚化合物，其中具有所述式的至少一個單體的Z基團(tuán)為由下式表示的(R)-構(gòu)型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(IV)、或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(V或下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(vi)。25.如權(quán)利要求24所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各單體的各Z基團(tuán)為(R)-構(gòu)型。26.如權(quán)利要求16-23任意一項所述的寡聚化合物，其中所述至少一個單體的Z基團(tuán)為由下式表示的(S)-構(gòu)型腳27.如權(quán)利要求26所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各單體的各Z基團(tuán)為(S)-構(gòu)型。28.如權(quán)利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中T3為H或羥基保護(hù)基團(tuán)。29.如權(quán)利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中T3為與核苷、核苷酸或單體亞基的連接核苷間聯(lián)接基團(tuán)。30.如權(quán)利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中丁3為與寡核苷或寡核苷酸連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。31.如權(quán)利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中丁3為與寡聚化合物連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。32.如權(quán)利要求16-31任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為H或羥基保護(hù)基團(tuán)。33.如權(quán)利要求16-31任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核香間聯(lián)接基團(tuán)。34.如權(quán)利要求16-31任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為與寡核香或寡核苷酸連接的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。35.如權(quán)利要求16-29任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為與寡聚化合物連接的核苦間聯(lián)接基團(tuán)。36.如權(quán)利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中丁3和T4中至少一個包含選自磷酸二酯或疏代磷酸酯的核苷間聯(lián)接基團(tuán)。37.如權(quán)利要求16-36任意一項所述的寡聚化合物，其包含至少一個由至少兩個相鄰的具有所述式的單體組成的區(qū)。38.如權(quán)利要求37所述的寡聚化合物，其包含至少兩個由至少兩個相鄰的具有所述式的單體組成的區(qū)。39.如權(quán)利要求38所述的寡聚化合物，其包含有間隙的寡聚化合物。40.如權(quán)利要求37或38所述的寡聚化合物，其進(jìn)一步包含至少一個由約8至約14個相鄰的(3-D-2'-脫氧核糖基核香組成的區(qū)。41.如權(quán)利要求40所述的寡聚化合物，其進(jìn)一步包含至少一個由約9至約12個相鄰的(3-D-2，-脫氧核糖基核苦組成的區(qū)。42.如權(quán)利要求37所述的寡聚化合物，其包含由2至3個具有所示式的相鄰單體組成的一個區(qū)，任選的由1或2個具有所示式的相鄰單體組成的第二區(qū)以及由8至14個P-D-2，-脫氧核糖基核苷組成的第三區(qū)，其中所述的第三區(qū)位于所述的第一和所述的第二區(qū)之間。43.如權(quán)利要求42所述的寡聚化合物，其包含8至10個(3-D-2'-脫氧核糖基核苷。44.如權(quán)利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約8至約40個的核苷和/或修飾的核苷或模擬物。45.如權(quán)利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約8至約20個的核香和/或修飾的核普或模擬物。46.如權(quán)利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約10至約16個的核普和/或修的飾核脊或模擬物。47.如權(quán)利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約10至約14個的核苷和/或修飾的核苷或模擬物。48.—種抑制基因表達(dá)的方法，其包括將一種或多種細(xì)胞、組織或動物與如權(quán)利要求16-45任意一項所述的寡聚化合物接觸。49.用于藥物治療的如權(quán)利要求16-47任意一項所述的化合物。50.如權(quán)利要求16-47任意一項所述的化合物在制備用于抑制基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了6-修飾的雙環(huán)核苷類似物以及包含這些核苷類似物的寡聚化合物。在優(yōu)選的實施方案中該核苷類似物在6位具有(R)或(S)-手性。這種雙環(huán)核苷類似物可用于提高寡聚化合物的性質(zhì)包括核酸酶抗性。文檔編號C07H19/04GK101410406SQ200780010566公開日2009年4月15日申請日期2007年1月27日優(yōu)先權(quán)日2006年1月27日發(fā)明者埃里克·E·斯威茲,普內(nèi)特·P·塞思申請人:Isis藥物公司