鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法，更確切而言，涉及包括如下步驟的鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法：（1）制備含有核酸的對(duì)象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；（2）使所述對(duì)象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，所述RNA-雙探針?lè)謩e綴合有報(bào)告子和淬滅子；以及（3）對(duì)由所述報(bào)告子產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的鑒別對(duì)象物的方法提供了相對(duì)于使用測(cè)序或熒光物質(zhì)標(biāo)記的傳統(tǒng)方法而言高達(dá)100倍的標(biāo)記靈敏度，并具有如下優(yōu)點(diǎn)：分析時(shí)間更短；便于根據(jù)熒光物質(zhì)在大量產(chǎn)品上進(jìn)行不同標(biāo)記；以及通過(guò)差異化各寡核苷酸的核苷酸序列使得在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)過(guò)程中能夠?qū)崿F(xiàn)按產(chǎn)品組和產(chǎn)品批次進(jìn)行的無(wú)限產(chǎn)品管理。
【專利說(shuō)明】鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鑒別含有核酸的對(duì)象物(object)的方法，更確切地說(shuō)，涉及使用熒光來(lái)容易地鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法，所述核酸具有被核糖核酸酶(RNase)識(shí)別的核苷酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002]即使在樣品中所含的濃度極低，通過(guò)PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))也能夠大規(guī)模擴(kuò)增核酸(例如寡核苷酸)。并且，此類以非常少的量被包含的核酸可以通過(guò)分析核苷酸序列進(jìn)行鑒別。因此，通過(guò)向目標(biāo)對(duì)象物或產(chǎn)品(包括油制品如油或涂料、火藥和有價(jià)值的藝術(shù)作品等)中添加最低量的核酸，可以精確跟蹤對(duì)象物或產(chǎn)品的來(lái)源和運(yùn)輸路徑，還可以對(duì)真品(genuine product)進(jìn)行精確鑒定。已有的報(bào)道過(guò)使用此類寡核苷酸來(lái)研究產(chǎn)品的運(yùn)輸路徑的文章如下:
[0003]美國(guó)專利號(hào)5，665，538描述了用于在水溶液中對(duì)石油類移動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法。在該說(shuō)明書中清楚地闡述了如下過(guò)程:將DNA作為微示蹤添加劑(microtrace additive)添加入石油類，然后在石油類移動(dòng)后對(duì)含有DNA微示蹤添加劑的石油類進(jìn)行采樣，隨后用PCR對(duì)DNA微示蹤添加劑進(jìn)行檢測(cè)。美國(guó)專利號(hào)5，451，505描述了用于對(duì)暴露于自然UV中的對(duì)象物進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法。確切地說(shuō)，為了確認(rèn)目標(biāo)對(duì)象物，收集核酸，隨后用PCR對(duì)該核酸進(jìn)行擴(kuò)増。同吋，EP1171633描述了用于對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，所述方法使用引物和熒光標(biāo)記的探針作為核酸標(biāo)簽通過(guò)實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行。然而，這些傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)在于，例如，它們不便于對(duì)濃度非常低的樣品進(jìn)行定量分析；很難對(duì)樣品進(jìn)行差異化的標(biāo)記；存在被操作人員污染或操縱(例如，消除)等的風(fēng)險(xiǎn)；以及因?yàn)閷?duì)這樣的核酸進(jìn)行檢測(cè)用時(shí)很長(zhǎng)，因而很難商業(yè)化。
[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的局限，開(kāi)發(fā)出了在親脂性溶劑中具有改善的溶解度的寡核苷酸和使用該寡核苷酸對(duì)目標(biāo)對(duì)象 物進(jìn)行檢測(cè)的方法(韓國(guó)專利號(hào)0851764);還開(kāi)發(fā)出了寡核苷酸標(biāo)記物和使用該寡核苷酸標(biāo)記物對(duì)交通工具進(jìn)行檢測(cè)的方法(韓國(guó)專利號(hào)0851765),所述寡核苷酸標(biāo)記物在加入機(jī)動(dòng)車的涂料膜(paint film)時(shí),適于用作交通エ具的識(shí)別標(biāo)簽或標(biāo)記物。根據(jù)該方法，對(duì)以低濃度溶解于涂料中的寡核苷酸進(jìn)行提取和回收，然后用PCR對(duì)核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)増。通過(guò)對(duì)該核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序，可以對(duì)目標(biāo)對(duì)象進(jìn)行跟蹤和確認(rèn)。然而，在這種方法中，序列信息是編碼的，因此需要對(duì)編碼序列進(jìn)行解碼這ー過(guò)程。此外，就測(cè)序而言，這ー過(guò)程的成本、精確度、處理時(shí)間以及復(fù)雜性這些問(wèn)題也都是使得商業(yè)化難以進(jìn)行的問(wèn)題。也就是說(shuō)，該方法在快速簡(jiǎn)單地判別真品方面以及確認(rèn)編碼信息(批號(hào)、制造商的獨(dú)特識(shí)別號(hào)等)方面存在問(wèn)題。根據(jù)近來(lái)油制品供應(yīng)多樣化的趨勢(shì)，篡改油等級(jí)及經(jīng)銷非法汽油已經(jīng)成為社會(huì)問(wèn)題。因此，為了制造商品牌形象的管理和經(jīng)銷秩序的建立，需要開(kāi)發(fā)出更加快速且更加簡(jiǎn)單有效的方法來(lái)對(duì)市場(chǎng)上油制品的種類和質(zhì)量進(jìn)行鑒別和識(shí)別。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問(wèn)題
[0006]本發(fā)明被設(shè)計(jì)為用以改善使用核酸識(shí)別對(duì)象物的傳統(tǒng)方法的問(wèn)題。因此，本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)使用從核酸標(biāo)記的對(duì)象物中回收的核酸而快速地鑒別所標(biāo)記的核酸標(biāo)記物的方法。
[0007]技術(shù)方案
[0008]所述鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法包括下列步驟:
[0009](I)制備含有核酸的對(duì)象物，所述核酸具有與RNA-雙探針(RNA-dual probe)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0010](2)使所述對(duì)象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，所述RNA-雙探針?lè)謩e綴合有報(bào)告子和淬滅子；以及
[0011](3)對(duì)由所述報(bào)告子產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)。
[0012]在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“RNA-雙探針”是指雙標(biāo)記的RNA探針，在所述RNA探針的結(jié)構(gòu)中，報(bào)告子和淬滅子分別與RNA探針結(jié)合。報(bào)告子和淬滅子可綴合于所述RNA探針的任意位點(diǎn)，但更優(yōu)選可綴合于所述RNA的兩端。
[0013]在步驟(I)中，核酸可為任何單鏈或雙鏈的DNA、RNA或DNA/RNA雜合體(DNA/RNA hybrid)，更優(yōu)選可為單鏈DNA，但并不總限于此。本文中的含有核酸的對(duì)象物優(yōu)選是液態(tài)的，例如石油類(如汽油、煤油和柴油)、用于機(jī)動(dòng)車涂層的涂料(paint forautomobile coating)、漆(lacquer)、用于交通道指示的涂料、涂料稀釋劑(paintdiluent)、稀料(thinner).、火藥(gunpowder)、天然油(natural oil)、建筑涂料(paint forconstruction)、有機(jī)溶劑、膠(glue)、染料、肉類以及海產(chǎn)食品,但并不總限于此。核酸優(yōu)選為具有5-1，000個(gè)核苷酸、更優(yōu)選為具有10-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸，但不總限于此。RNA相對(duì)容易降解。因此，當(dāng)對(duì)象物含有DNA吋，穩(wěn)定性増加，這是更優(yōu)選的。
[0014]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸可以與季銨鹽化合物或陽(yáng)離子表面活性劑綴合，所述季銨鹽化合物或陽(yáng)離子表面活性劑為陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑。在本發(fā)明中，所述陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑為燒基季銨離子(quaternary alkyl ammonium ion),例如四丁基氫氧化銨Ctetrabutyl ammonium hydroxide)或十バ燒是三甲塞溴化銨(hexadecyl trimethylammonium bromide)。核酸優(yōu)選用封閉劑進(jìn)行封閉，該封閉劑為典型的脂質(zhì)或磷酸鹽/酷、或者為不具有端基(terminal group)的化學(xué)物質(zhì)。
[0015]在本發(fā)明中，所述核酸的氮和氧位點(diǎn)(反應(yīng)區(qū)域)特征性地與C1-C5tl有機(jī)化合物綴合。該C1-C5tl有機(jī)化合物例如可為:與氮部分形成酰胺鍵和與氧部分形成酯鍵的羰基化合物、形成O-Si鍵與N-Si的娃燒化合物(silanyl compounds)、形成O-S鍵與N-S的磺酰基化合物、形成O-C鍵與N-C (當(dāng)用氨進(jìn)行處理時(shí)可斷裂)的飽和烴類、芳香烴類、不飽和烴類、含有雜原子的飽和烴類或不飽和烴類等。
[0016]同時(shí)，在用核酸對(duì)對(duì)象物進(jìn)行標(biāo)記或從對(duì)象物中回收核酸的方法方面沒(méi)有限制，因此可以使用任何常規(guī)方法。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過(guò)在核酸的3'端和/或5/端添加脂質(zhì)來(lái)制備所述核酸。所述脂質(zhì)可不受限地為C3-C 脂質(zhì)、優(yōu)選為C7-C24脂質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過(guò)在3'端添加C12脂質(zhì)、并在5'端添加C18脂質(zhì)來(lái)制備所述核酸?？蓪⑺龊怂崛苡谑皖?、優(yōu)選汽油中，但不總限于此。此時(shí)，可在實(shí)驗(yàn)前將陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑加入核酸中，所述陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑能通過(guò)靜電吸引與所述核酸的陰離子位點(diǎn)結(jié)合。在本發(fā)明的另ー優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)加入陰離子相轉(zhuǎn)移劑(-PTA)使其與陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑綴合，可以從對(duì)象物中回收該核酸，該陰離子相轉(zhuǎn)移劑可為陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑(+PTA)的反荷離子(count-1on)。此時(shí)，陰離子相轉(zhuǎn)移劑(-PTA)可為陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑(+PTA)的反荷離子(所述陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑通過(guò)靜電吸引與有機(jī)溶劑中的核酸結(jié)合)；或者可不受限地使用可溶解于有機(jī)溶劑中的任何試劑。
[0017]在步驟(2)中，報(bào)告子和淬滅子可以分別與RNA-雙探針的5'端或3'端綴合。所述報(bào)告子優(yōu)選為TAMRA (羧基四甲基羅丹明)、FAM (6-羧基熒光素)、Cy3、Cy5或Cy5.5 ;而所述淬滅子優(yōu)選為BHQl (2，5- ニ叔丁基氫醌-1)、BHQ2、TAMRA或DABCYL，但不總限于此，并且實(shí)際上可以使用多種熒光物質(zhì)，或者可以使用它們的任意組合。本文中的緩沖液不受限制，可使用具有合適于核酸擴(kuò)增或核酸生化反應(yīng)的常規(guī)成分的任何緩沖液。然而，更優(yōu)選使用含有選自于由如下成分所組成的組中的ー種或多種成分的緩沖液:Tris、KC1、MgCl2,MnCl2和ニ硫蘇糖醇。本文中的緩沖液可選擇性包含RNase抑制劑。
[0018]RNase是降解RNA的酶，其可以分成兩種類型，如內(nèi)切型(消化核苷酸序列的中間部分)和外切型(切割核苷酸序列的末端)。RNase具有廣泛的底物特異性，并涉及非常復(fù)雜的生理活性。在本發(fā)明中，RNase可以是能消化綴合物(在該綴合物中，對(duì)象物的核酸與RNA-雙探針綴合)中的RNA部分的任意隨機(jī)RNase,更優(yōu)選RNase H。RNase H是ー種只特異性地消化單鏈DNA/單鏈RNA雜合體中的RNA的酶，其最早在1969年由W.H.Stein和 P.Hausen 從小牛胸腺中分離得到(Stein H, Hausen P.，Science, 1969,166 (903)，393-395)。這種酶在多種真核細(xì)胞(如動(dòng)物細(xì)胞和酵母)和原核細(xì)胞(如大腸桿菌(E.coli))中均存在。RNase H是內(nèi)切型酶，表現(xiàn)出底物特異性，并且只特定地消化DNA/RNA雜合體中的RNA鏈。這種酶的活化需要ニ價(jià)金屬離子，如Mg2+和Mn2+。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，RNase H在20°C _90°C的溫度范圍中具有其活性。
[0019]在步驟(3)中，對(duì)熒光的檢測(cè)通過(guò)如下方式進(jìn)行:使用合適的檢測(cè)裝置對(duì)由報(bào)告子所產(chǎn)生的處于特定波段的熒 光進(jìn)行檢測(cè)。本文中的波長(zhǎng)隨報(bào)告子的種類而變化，并不局限于特定的波段。
[0020]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，將核酸從含有核酸的對(duì)象物中回收，然后與含有RNA-雙探針和RNase的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)。確切而言，本發(fā)明的鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法包括下列步驟:
[0021](I)制備含有核酸的對(duì)象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0022]( 2 )從所述對(duì)象物中回收所述核酸；
[0023](3)使所述對(duì)象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，所述RNA-雙探針?lè)謩e綴合有報(bào)告子和淬滅子；以及
[0024](4)對(duì)由所述報(bào)告子產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)。
[0025]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)如下過(guò)程容易確認(rèn)目標(biāo)對(duì)象物是否含有核酸:在含有RNA-雙探針和RNase H的反應(yīng)緩沖液中，使從含有寡核苷酸的溶液中回收的寡核苷酸反應(yīng)所需時(shí)間(優(yōu)選I分鐘-1小吋、更優(yōu)選5分鐘-10分鐘)后，測(cè)量熒光。根據(jù)這一方法，不存在純化DNA的步驟。因此，由細(xì)胞或其它基因組DNA的交叉污染所造成的檢測(cè)到錯(cuò)誤熒光信號(hào)的可能性實(shí)際上可以被消除。
[0026]在本發(fā)明的另ー優(yōu)選實(shí)施方式中，證實(shí)本發(fā)明的方法通過(guò)測(cè)量報(bào)告子所產(chǎn)生的熒光而有利于查證產(chǎn)品的經(jīng)銷渠道、產(chǎn)地以及辨別真品。確切而言，為鑒別各自含有不同核酸的產(chǎn)品，使各產(chǎn)品中所含的核酸與RNA-雙探針進(jìn)行反應(yīng)(該RNA-雙探針與所述產(chǎn)品的核酸互補(bǔ)結(jié)合)，然后進(jìn)行熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示，可以容易地確定哪種產(chǎn)品含有哪種核酸。
[0027]在本發(fā)明的另ー優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)本發(fā)明的方法容易地證實(shí)了特定產(chǎn)品(例如油制品)是否為真品。例如，存在類似產(chǎn)品，在該產(chǎn)品中，真品油制品與非法油制品以1:1的比例混合。此時(shí)，如果將從真品油制品中測(cè)量到的熒光視為100，則類似產(chǎn)品的熒光水平將會(huì)為約50。根據(jù)這ー原理，油制品的經(jīng)銷渠道、真假的辨別以及所含真品的比例可以很容易地進(jìn)行確證。
[0028]發(fā)明的有益效果
[0029]根據(jù)本發(fā)明的方法，即使標(biāo)記物寡核苷酸以極低的量包含于目標(biāo)對(duì)象物中，仍可在短時(shí)間內(nèi)(例如10分鐘內(nèi))以高精確度對(duì)其進(jìn)行鑒定。在本發(fā)明中，寡核苷酸的大小或核苷酸序列可以變化，這表明可以進(jìn)行各種標(biāo)記，并且標(biāo)記靈敏度可以隨各種熒光染料的不同組合的數(shù)量而增加。此外，本發(fā)明的鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法提供了相對(duì)于使用測(cè)序或熒光物質(zhì)標(biāo)記的傳統(tǒng)方法而言高達(dá)100倍的標(biāo)記靈敏度。另外，本發(fā)明方法的特征為:分析時(shí)間更短；便于根據(jù)熒光物質(zhì)在大量產(chǎn)品上進(jìn)行不同標(biāo)記；以及通過(guò)差異化各寡核苷酸的核苷酸序列使得在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)過(guò)程中能夠?qū)崿F(xiàn)按產(chǎn)品組和產(chǎn)品批次進(jìn)行的無(wú)限產(chǎn)品管理。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]參考附圖會(huì)最好地理解本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的應(yīng)用，其中:
[0031]圖1為說(shuō)明加入RNase H的實(shí)驗(yàn)組中的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量的圖。
[0032]圖2為說(shuō)明發(fā)射值隨RNA-雙探針含量増加呈劑量依賴性增長(zhǎng)的圖。
[0033]圖3為說(shuō)明發(fā)射值隨RNase H含量增加而增長(zhǎng)的圖。
[0034]圖4為說(shuō)明隨RNase反應(yīng)在固定溫度下進(jìn)行而進(jìn)行的熒光測(cè)量的圖。
[0035]圖5為說(shuō)明對(duì)通過(guò)RNase反應(yīng)所生成的熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量的ー組圖(無(wú)論熒光物質(zhì)為何種種類)。在圖5A中，TAMRA和BHQ2分別用作報(bào)告子和淬滅子。在圖5B中，F(xiàn)AM和BHQl分別用作報(bào)告子和淬滅子。在圖5C中，Cy3和BHQ2分別用作報(bào)告子和淬滅子。在圖5D中，Cy5和BHQ2分別用作報(bào)告子和淬滅子。圖5E為將圖5A-圖的圖一起示出的圖。
[0036]圖6為說(shuō)明甚至在小于10分鐘的測(cè)量時(shí)間內(nèi)對(duì)由RNase活性所產(chǎn)生的突光進(jìn)行測(cè)量的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]如下列實(shí)施例所示，本發(fā)明的操作實(shí)施方式和目前優(yōu)選的實(shí)施方式為說(shuō)明性的。
[0038]然而，將理解的是，本發(fā)明技術(shù)人員在考慮到本公開(kāi)的基礎(chǔ)上，可以在本發(fā)明的精神和保護(hù)范圍內(nèi)做出修改和改進(jìn)。
[0039]實(shí)施例
[0040]實(shí)施例1:含有核酸的對(duì)象物的制備，所述核酸具有與RNA-雙探針互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列
[0041]〈1-1>寡核苷酸的制備
[0042]使用自動(dòng)測(cè)序儀，在用于寡核苷酸合成的固定化載體(CPG)的表面上合成具有由SEQ.1D.NO:1所示的核苷酸序列的寡核苷酸(相當(dāng)于IOmer模板DNA)。
[0043]5' -ACCGTGACGT-3' , MW=3027.96 (SEQ.1D.NO:1)
[0044]在用作模板的、具有由SEQ.1D.NO:1所示的核苷酸序列的寡核苷酸的合成中，可在其兩端都添加脂質(zhì)。在本實(shí)施例中，向3'端添加C12脂質(zhì)、井向5'端添加C18脂質(zhì)，從而制備出本發(fā)明的寡核苷酸。
[0045]5' -C18-ACCGTGACGT-C12-3'
[0046]使用氨水(氨濃度:28%)從固定化載體(CPG)回收合成的寡核苷酸。具體而言，向氣密密封的固定化載體(CPGlOmg)中加入ImL的28被％氨水，然后在65°C下反應(yīng)3小吋。然后，通過(guò)回收氨水來(lái)獲得處于溶液中的寡核苷酸。用寡核苷酸純化方法BioRP(Bioneer)對(duì)所述寡核苷酸進(jìn)行純化。通過(guò)測(cè)量UV吸收(260nm)對(duì)溶液中的寡核苷酸進(jìn)行定量。
[0047]〈1-2>含有寡核苷酸的汽油的制備
[0048]將實(shí)施例1中通過(guò)在3'端添加C12脂質(zhì)、在5'端添加C18脂質(zhì)而制得的寡核苷酸溶于蒸餾水中。將濃度調(diào)節(jié)至500D/mL。將溶于蒸餾水中的寡核苷酸以1000D的濃度加樣于15mL錐管(Corning)中。作為相轉(zhuǎn)移劑(PTA)，將陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑(+PTA)十六烷基三甲基溴化銨(MW=364.5)在蒸餾水中稀釋至濃度為1.3mM，所述陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑可能通過(guò)靜電吸引連接至寡核苷酸的陰離子位點(diǎn)。將其加入寡核苷酸中使總體積為3mL。向其中加入等體積的汽油(SK Oil Ref inery C0.)。將混合物用漩渦振蕩器充分混合至少I分鐘，在這個(gè)過(guò)程中，溶液中寡核苷酸的極性位點(diǎn)由于靜電吸引而結(jié)合至相轉(zhuǎn)移劑。結(jié)果顯示，寡核苷酸被中和，并溶解于汽油中。
[0049]〈1-3>從對(duì)象物中回收核酸
[0050]由于寡核苷酸穩(wěn)定溶解于汽油中，很難簡(jiǎn)單地通過(guò)加氨水后煮沸或與水混合使其溶于水層中。因此，向其中加入作為陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑(+PTA)的反荷離子的陰離子相轉(zhuǎn)移劑(-PTA)，使得反荷離子與陽(yáng)離子相轉(zhuǎn)移劑綴合、而不是與寡核苷酸綴合。結(jié)果顯示，可以用水萃取寡核苷酸。具體而言，將以0.5M的濃度溶于滅菌水中的HDEHP (雙(2-こ基己基)磷酸酷，M.W:322.42)加入實(shí)施例〈1-2>中制備的寡核苷酸/汽油混合物。將混合物在3，OOOrpm下離心10分鐘以使水層和有機(jī)溶劑層分離。取出在下部的水溶液，測(cè)量UV吸收。然后，回收存留在水層中的寡核苷酸。
[0051]實(shí)施例2:由RNase H引起的光發(fā)射
[0052]對(duì)從實(shí)施例〈1-3>中回收的寡核苷酸和RNA-雙探針中是否能觀察到由RNase H引起的光發(fā)射進(jìn)行了研究。合成實(shí)施例〈1-3>中回收的具有由SEQ.1D.NO:1所示的核苷酸序列的寡核苷酸(3'端添加有C12脂質(zhì)、5'端添加有C18脂質(zhì))以及具有由SEQ.1D.NO:2所示的核苷酸序列(與寡核苷酸序列互補(bǔ))的RNA-雙探針(見(jiàn)表I)。本發(fā)明中使用的RNA-雙探針的長(zhǎng)度為lOmer，其5'端標(biāo)記有熒光物質(zhì)報(bào)告子TAMRA、3'端標(biāo)記有淬滅子BHQ2。
[0053]通過(guò)下列步驟證實(shí)了由RNase H引起的熒光發(fā)射。在特定溫度下，使用基因擴(kuò)增儀(MyGenie96 ;Bioneer)證實(shí)了 RNase H與核苷酸/RNA-雙探針綴合物的反應(yīng)。并且,還通過(guò)使用熒光分光光度計(jì)(SHIMADZU)證實(shí)了由RNase H引起的熒光發(fā)射。此時(shí)，將不含有RNase H的樣品用作對(duì)照。
[0054](I)如表2所示，制備總共20 ii L的樣品。
[0055](2)在基因擴(kuò)增儀(MyGenie96)中，通過(guò)以0.5V /sec的升溫速率從20°C升溫至90°C來(lái)誘發(fā)反應(yīng)。
[0056](3)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物與1，980mL的IM Tris-HCl混合，然后用熒光分光光度計(jì)(SHIMADZU)測(cè)量熒光波長(zhǎng)。
[0057]表I
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法，所述方法包括如下步驟: (1)制備含有核酸的對(duì)象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列； (2)使所述對(duì)象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，所述RNA-雙探針?lè)謩e綴合有報(bào)告子和淬滅子；以及 (3)對(duì)由所述報(bào)告子產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸選自于由DNA、RNA和DNA-RNA雜合體所組成的組。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸是單鏈DNA。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸在3'端和/或5'端添加有脂質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述脂質(zhì)是C7-C24脂質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含有核酸的對(duì)象物是液態(tài)對(duì)象物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含有核酸的對(duì)象物選自于由如下對(duì)象物所組成的組:汽油、煤油、柴油·、用于機(jī)動(dòng)車涂層的涂料、漆、用于交通道指示的涂料、涂料稀釋齊U、稀料、火藥、天然油、建筑涂料、有機(jī)溶劑、膠、染料、肉類以及海產(chǎn)食品。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸具有包含5-1，OOO個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述RNase是RNaseH。
10.如權(quán)利要求1或9所述的方法，其中，所述RNaseH在20°C _90°C的溫度范圍中具有活性。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述報(bào)告子和所述淬滅子與所述RNA-雙探針的5/端或3'端綴合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述報(bào)告子選自于由TAMRA(羧基四甲基羅丹明)、FAM (6-羧基熒光素)、Cy3、Cy5和Cy5.5所組成的組。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述淬滅子選自于由BHQl(2，5_ ニ叔丁基氫醌-1 )、BHQ2、TAMRA和DABCYL所組成的組。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述緩沖液包含選自于由Tris、KCl、MgCl2、MnCl2和ニ硫蘇糖醇所組成的組中的ー種或多種組分。
15.如權(quán)利要求1或14所述的方法，其中，所述緩沖液還含有RNase抑制劑。
16.—種鑒別含有核酸的對(duì)象物的方法，所述方法包括如下步驟: (1)制備含有核酸的對(duì)象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列； (2)從所述對(duì)象物中回收所述核酸； (3)使所述對(duì)象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，所述RNA-雙探針?lè)謩e綴合有報(bào)告子和淬滅子；以及 (4)對(duì)由所述報(bào)告子產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)。
17.一種確認(rèn)含有核酸的對(duì)象物是否為真的方法，所述方法包括如下步驟: (I)制備含有核酸的對(duì)象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(2)使所述對(duì)象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，所述RNA-雙探針?lè)謩e綴合有報(bào)告子和淬滅子；以及 (3)對(duì)由所述報(bào)告子產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述含有核酸的對(duì)象物選自于由如下對(duì)象物所組成的組:汽油、煤油、柴油、用于機(jī)動(dòng)車涂層的涂料、漆、用于交通道指示的涂料、涂料稀釋齊U、稀料、火藥、天然油 、建筑涂料、有機(jī)溶劑、膠、染料、肉類以及海產(chǎn)食品。
【文檔編號(hào)】G01N33/52GK103429758SQ201280013351
【公開(kāi)日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月14日
【發(fā)明者】樸翰浯, 崔正榮, 韓殷洙, 宋邱永, 蔣沅錫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社百奧尼