馬拉硫磷核酸適體、衍生物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種馬拉硫磷核酸適體、衍生物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬拉硫磷是高效低毒殺蟲(chóng)、殺螨劑，防治范圍廣。不僅用于稻、麥、棉，而且因毒性 低、殘效短，也用于蔬菜、果樹(shù)、茶葉，以及倉(cāng)庫(kù)的防蟲(chóng)。主要防治稻飛虱、稻葉蟬、棉蚜、棉 紅蜘蛛、麥粘蟲(chóng)、豌豆象、大豆食心蟲(chóng)、果樹(shù)紅蜘蛛、蚜蟲(chóng)、粉蚧殼蟲(chóng)、巢蛾、蔬菜黃條跳、菜葉 蟲(chóng)、茶樹(shù)上的多種蚧類，以及蚊、蠅幼蟲(chóng)和臭蟲(chóng)等。近年來(lái)，由于馬拉硫磷超標(biāo)使用而引起的 食品安全事故比較多。
[0003] 目前測(cè)定馬拉硫磷的主要方法有色譜法、酶抑制法、免疫分析法、化學(xué)發(fā)光法、生 物傳感器法等，但這些方法都存在不足。研宄快速、靈敏、可靠的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方法迫在 眉睫，開(kāi)發(fā)農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)在食品安全、環(huán)境保護(hù)等方面具有重要意義。
[0004] 核酸適體（Aptamer)是通過(guò) SELEX 技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)），從人工體外合成的隨機(jī)寡核苷 酸序列庫(kù)中反復(fù)篩選得到的，能與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸。核酸適體作為一種特異 性更好、親和力更高、品質(zhì)均一、穩(wěn)定性好的抗體替代品，在檢測(cè)分析領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)被 廣為認(rèn)可，并具有開(kāi)發(fā)周期短、生產(chǎn)成本低、使用方便的特點(diǎn)。目前，在食品中被嚴(yán)格控制的 諸多有害物質(zhì)包括生物類毒素、重金屬、抗生素等的核酸適體在食品檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)得到了 初步的應(yīng)用。因此，核酸適體在馬拉硫磷這種毒性小分子的快速檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前 景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的欠缺之處，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種 采用SELEX技術(shù)篩選得到的能夠與馬拉硫磷高特異性和高親和力結(jié)合的核酸適體，并提供 馬拉硫磷核酸適體在馬拉硫磷檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種馬拉硫磷核酸適體，為如下 核苷酸序列的DNA分子：
[0007] TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGTCACGCGGCTGC 或其互補(bǔ)序列。
[0008] 一種馬拉硫磷核酸適體衍生物，它具有與馬拉硫磷核酸適體相似的功能用途，它 是在馬拉硫磷核酸適體的核苷酸序列上標(biāo)記偶聯(lián)熒光素、酶、生物素、地高辛、納米材料、膠 體金、熒光基團(tuán)、發(fā)光物質(zhì)中的一種或多種得到；或是將馬拉硫磷核酸適體的核苷酸序列置 換、缺失或增加堿基得到。
[0009] 一種馬拉硫磷核酸適體在馬拉硫磷檢測(cè)分析中的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0010] 1)、將馬拉硫磷核酸適體與標(biāo)靶溶液在一定條件下孵育一段時(shí)間；
[0011] 2)、加入分子信標(biāo)（MB，molecular beacon)并在相同的條件下繼續(xù)孵育一段時(shí) 間；
[0012] 所述分子信標(biāo)是含有20個(gè)堿基的單鏈DNA，分子信標(biāo)的5'端和3'端被分別標(biāo)記 上了熒光基團(tuán)（FAM)與猝滅基團(tuán)（DABCYL)，分子信標(biāo)與馬拉硫磷核酸適體雜交的部位從核 酸適體Y末端起第16個(gè)堿基至第30個(gè)堿基；
[0013] 3)、檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，并與空白對(duì)照組比較，計(jì)算熒光抑制率。
[0014] 所述步驟1)中標(biāo)靶溶液的預(yù)處理步驟為：
[0015] 取待測(cè)蔬菜樣品，擦去表面泥土后研碎，用含1%甲醇的IXSB緩沖液45°C提取 15min ；
[0016] 稱取LOg碎片置于50mL燒杯中，加入IOmL含1%甲醇的IXSB緩沖溶液，放入 45°C的水浴鍋中浸提15min。
[0017] 所述步驟1)中馬拉硫磷核酸適體的最終濃度為0. 1 μ mol/L，步驟2)中分子信標(biāo) 的最終濃度為0. 4 μ mol/L，步驟2)中馬拉硫磷核酸適體與分子信標(biāo)的摩爾比為1:4。
[0018] 所述步驟1)和2)的反應(yīng)均在IXSB緩沖溶液（IXSB緩沖溶液中：Na+濃度為 200mmol/L，K +濃度為 40mmol/L，Mg 2+濃度為 10mmol /T,, Tris 濃度為 50mmol/L，pH 為 8. 0) 中進(jìn)行。
[0019] 所述步驟1)中馬拉硫磷核酸適體與馬拉硫磷的作用條件為避光在室溫下孵育 20min，步驟2)中的作用條件為避光在室溫下孵育60min。
[0020] 所述步驟3)中的檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm，熒光抑制率計(jì) 算公式如下：
[0022] 注：R指熒光抑制率；Fl指含有分子信標(biāo)和核酸適體時(shí)的熒光值；F2指含有分子 信標(biāo)、核酸適體和馬拉硫磷時(shí)的焚光值;M指僅含有分子信標(biāo)時(shí)的焚光值。
[0023] 本發(fā)明的馬拉硫磷核酸適體、衍生物及其應(yīng)用，采用SELEX技術(shù)篩選得到的馬拉 硫磷核酸適體具有特異性好、親和力高、穩(wěn)定性好、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，可以用于馬拉硫磷的 檢測(cè)分析。
[0024] 該馬拉硫磷核酸適體適用于樣品中馬拉硫磷的快速檢測(cè)，不僅具有快速、簡(jiǎn)單、經(jīng) 濟(jì)等特點(diǎn)，還具有較高的靈敏度和選擇性，對(duì)馬拉硫磷的檢測(cè)線性范圍為10~200 μmol/ L，檢出限為5 μ mol/L。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是分子信標(biāo)的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 圖2是檢測(cè)原理圖。
[0027] 圖3是馬拉硫磷檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明不僅限于實(shí)施例，在 未脫離本發(fā)明宗旨的前提下，所作的任何改進(jìn)均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0029] 請(qǐng)參閱圖2, 一種馬拉硫磷核酸適體在馬拉硫磷檢測(cè)分析中的應(yīng)用，包括以下步 驟：
[0030] I)、標(biāo)靶溶液的預(yù)處理步驟為：
[0031] 取待測(cè)蔬菜樣品，擦去表面泥土后研碎，用含1%甲醇的IXSB緩沖液45°C提取 15min ;稱取1.0 g碎片置于50mL燒杯中，加入IOmL含1 %甲醇的I X SB緩沖溶液，放入45°C 的水浴鍋中浸提15min。
[0032] 2)、將馬拉硫磷核酸適體與標(biāo)靶溶液在避光室溫下孵育20min，反應(yīng)在I X SB緩沖 溶液（1XSB緩沖溶液中：Na+濃度為200mmol/L，K+濃度為40mmol/L，Mg 2+濃度為IOmmol/ L，Tris濃度為50mmol/L，pH為8. 0)中進(jìn)行，馬拉硫磷核酸適體的最終濃度為0.1 ymol/L。
[0033] 3)、加入分子信標(biāo)（MB，molecular beacon)(請(qǐng)參閱圖1)并在避光室溫下孵育 60min，馬拉硫磷核酸適體與分子信標(biāo)的摩爾比為1:4,分子信標(biāo)的最終濃度為0. 4 μ mol/ L。反應(yīng)在IXSB緩沖溶液（1XSB緩沖溶液中：Na+濃度為200mmol/L，K+濃度為40mmol/ L，Mg2+濃度為 10mmol/L，Tris 濃度為 50mmol/L，pH 為 8. 0)中進(jìn)行。
[0034] 分子信標(biāo)是含有20個(gè)堿基的單鏈DNA，分子信標(biāo)的5'端和3'端被分別標(biāo)記上了 熒光基團(tuán)（FAM)與猝滅基團(tuán)（DABCYL)，分子信標(biāo)與馬拉硫磷核酸適體雜交的部位從核酸適 體Y末端起第16個(gè)堿基至第30個(gè)堿基。
[0035] 分子信標(biāo)與馬拉硫磷核酸適體的序列如下表所示：
[0036]
[0037] 4)、檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，并與空白對(duì)照組比較，計(jì)算熒光抑制率。
[0038] 檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm，熒光抑制率計(jì)算公式如下：
[0040] 注：R指熒光抑制率。Fl指含有分子信標(biāo)和核酸適體時(shí)的熒光值。F2指含有分子 信標(biāo)、核酸適體和馬拉硫磷時(shí)的焚光值。M指僅含有分子信標(biāo)時(shí)的焚光值。
[0041] 請(qǐng)參閱圖3,由此可知，馬拉硫磷核酸適體對(duì)馬拉硫磷的檢測(cè)線性范圍為10~ 200 ymol/L，線性回歸方程為y = (λ 17791χ+6· 52771，線性回歸系數(shù)為0· 99467,檢測(cè)限為 5 μ mol/L〇
[0042] 以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)所作的舉例和說(shuō)明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員 對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明 的結(jié)構(gòu)或者超越本權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種馬拉硫磷核酸適體，為如下核苷酸序列的DNA分子： TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGTCACGCGGCTGC 或其互補(bǔ)序列。2. -種馬拉硫磷核酸適體衍生物，是在馬拉硫磷核酸適體的核苷酸序列上標(biāo)記偶聯(lián)熒 光素、酶、生物素、地高辛、納米材料、膠體金、熒光基團(tuán)、發(fā)光物質(zhì)中的一種或多種得到； 或者，是將馬拉硫磷核酸適體的核苷酸序列置換、缺失或增加堿基得到； 所述馬拉硫磷核酸適體為如下核苷酸序列的DNA分子： TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGTCACGCGGCTGC。3. -種如權(quán)利要求1所述馬拉硫磷核酸適體在馬拉硫磷檢測(cè)分析中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟： 1) 、將馬拉硫磷核酸適體與標(biāo)靶溶液在一定條件下孵育一段時(shí)間； 2) 、加入分子信標(biāo)（MB，molecular beacon)并在相同的條件下繼續(xù)孵育一段時(shí)間； 所述分子信標(biāo)是含有20個(gè)堿基的單鏈DNA，分子信標(biāo)的5'端和3'端被分別標(biāo)記上了 熒光基團(tuán)（FAM)與猝滅基團(tuán)（DABCYL)，分子信標(biāo)與馬拉硫磷核酸適體雜交的部位從核酸適 體Y末端起第16個(gè)堿基至第30個(gè)堿基； 3) 、檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，并與空白對(duì)照組比較，計(jì)算熒光抑制率。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟1)中標(biāo)靶溶液的預(yù)處理步驟為： 取待測(cè)蔬菜樣品，擦去表面泥土后研碎，用含1 %甲醇的IXSB緩沖液45°C提取 15min ； 稱取1.0 g碎片置于50mL燒杯中，加入IOmL含1 %甲醇的I X SB緩沖溶液，放入45°C 的水浴鍋中浸提15min。6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟1)中馬拉硫磷核酸適體的最終濃 度為0. lymol/L，步驟2)中分子信標(biāo)的最終濃度為0.4ymol/L，步驟2)中馬拉硫磷核酸 適體與分子信標(biāo)的摩爾比為1:4。7. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟1)和2)的反應(yīng)均在IXSB緩沖 溶液中進(jìn)行。8. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟1)中馬拉硫磷核酸適體與標(biāo)靶 溶液的作用條件為避光在室溫下孵育20min，步驟2)中的作用條件為避光在室溫下孵育 60min〇9. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述步驟3)中的檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)為 485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm，熒光抑制率計(jì)算公式如下：R指熒光抑制率；Fl指含有分子信標(biāo)和核酸適體時(shí)的熒光值；F2指含有分子信標(biāo)、核酸 適體和馬拉硫磷時(shí)的焚光值;M指僅含有分子信標(biāo)時(shí)的焚光值。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種馬拉硫磷核酸適體、衍生物及其應(yīng)用。馬拉硫磷核酸適體的核苷酸序列為：TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGT CACGCGGCTGC或其互補(bǔ)序列。將馬拉硫磷核酸適體與標(biāo)靶溶液孵育，接著加入分子信標(biāo)再次孵育，最后檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，并與空白對(duì)照組比較，計(jì)算熒光抑制率，以實(shí)現(xiàn)馬拉硫磷的檢測(cè)分析。本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選得到的馬拉硫磷核酸適體具有特異性好、親和力高、穩(wěn)定性好、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，可以用于馬拉硫磷的檢測(cè)分析。
【IPC分類】G01N21/64, C12N15/115
【公開(kāi)號(hào)】CN104894137
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510297593
【發(fā)明人】王麗, 徐龍峰, 王蓓蓓, 張興體, 葉勇, 吳從婷, 王丹丹
【申請(qǐng)人】安徽科技學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年6月2日