二倍體烏拉爾圖小麥磷酸甘露糖變位酶基因啟動(dòng)子TuPMM-A1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及二倍體烏拉爾圖小麥磷酸甘露糖變位酶基 因啟動(dòng)子TuPMM-Al及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 普通小麥為六倍體（Triticum aestivium L.，2η = 42, AABBDD)，由二倍體祖先物 種烏拉爾圖小麥（Triticum urartu L.，2η = 14, AA)和目前未知的B組供體，以及D組的 供體粗山羊草（Aegilops tauschii L·，2η = 14, DD)經(jīng)過(guò)兩次自然雜交加倍形成。
[0003] 小麥?zhǔn)俏覈?guó)的重要糧食作物，其生產(chǎn)水平直接與我國(guó)的糧食安全息息相關(guān)，我國(guó) 的小麥育種工作者培育了相當(dāng)數(shù)量適應(yīng)我國(guó)各地氣候和栽培條件優(yōu)良小麥品種，育種水平 不低于西方發(fā)達(dá)國(guó)家。
[0004] 植物的轉(zhuǎn)基因涉及三個(gè)方面研宄內(nèi)容：第一，用有效的手段將目標(biāo)基因進(jìn)入受體。 由于各種植物自身的特點(diǎn)，一種手段不可能在所有的植物中都適用，需針對(duì)不同的植物，研 宄高效的轉(zhuǎn)化手段。如在擬南芥和水稻中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化比較有效簡(jiǎn)易，而到目前 為止，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)尚在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行探索研宄中。第二，如何能夠在特異的位點(diǎn)導(dǎo) 入目標(biāo)基因，避免對(duì)基因組中其他功能基因的破壞。通過(guò)同源重組的定點(diǎn)打靶技術(shù)，在動(dòng) 物的轉(zhuǎn)化中獲得較大成功。目前，我國(guó)的科學(xué)家在在利用TALEN和CRISPR/Cas9基因組編 輯技術(shù)在作物基因組內(nèi)進(jìn)行定點(diǎn)編輯（如定點(diǎn)突變、定點(diǎn)甲基化修飾、定點(diǎn)基因沉默和激 活等）方面取得了重要的進(jìn)展。第三，如何能使轉(zhuǎn)入后的目標(biāo)基因按設(shè)計(jì)或有效地進(jìn)行表 達(dá)。大部分轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，均是使用組成型高表達(dá)的啟動(dòng)子，如在雙子葉植物中通常使用花椰 菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子；在單子葉植物中主要采用玉米泛素 ubiquitin和水稻肌動(dòng)蛋 白actin啟動(dòng)子等；這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子調(diào)控的基因表達(dá)不受時(shí)空限制和外界環(huán)境的誘 導(dǎo)，即在植物所有組織中均過(guò)量表達(dá)目的基因，其結(jié)果會(huì)造成轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)物質(zhì)和能量 的無(wú)謂浪費(fèi)，可能引起一些副作用。
[0005] 近年來(lái)，隨著對(duì)轉(zhuǎn)基因安全的關(guān)注，相對(duì)安全的基因改良的農(nóng)作物至少需要滿足 以下幾個(gè)方面的要求：（1)外源的（非宿主植物自身來(lái)源的DNA序列降低到最低程度）；（2) 目標(biāo)基因的產(chǎn)物在人類或動(dòng)物的食用組織或器官中最好不積累（對(duì)于改良目標(biāo)為相應(yīng)組 織或器官的除外）；（3)能經(jīng)過(guò)相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的證明，改良的性狀經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的動(dòng)物、環(huán)境 試驗(yàn)，并證明是安全的。就前兩個(gè)條件而言，需要研宄者廣泛地研宄，并對(duì)目標(biāo)生物體中相 關(guān)的基因進(jìn)行篩選。如水稻的Act in，玉米的Ub i qut in基因的啟動(dòng)子，但這類啟動(dòng)子也有其 明顯的缺點(diǎn)。目前，迫切需要篩選在種子器官中不表達(dá)或表達(dá)量低，其蛋白產(chǎn)物不能有效積 累（翻譯起始點(diǎn)上游的序列在種子中不同有效地驅(qū)動(dòng)翻譯，引起蛋白的積累）啟動(dòng)子序列， 盡可能地降低轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在人類的食物或食物加工的原材料中的積累。
[0006] 普通小麥中有六個(gè)磷酸甘露糖變位酶基因成員（phosphomannomutase, PMM)，分別 定位在小麥的第二群（TaPMM-Al，Bl和Dl)和第四群染色體（TaPMM-A2, B2和D2)，在根、 莖、葉、旗葉和幼穗等器官中TaPMM-Al的表達(dá)量比較高，且這種表達(dá)方式在二、四倍體祖先 物種中有相同的趨勢(shì)，說(shuō)明在六倍體小麥PMM-Al基因的啟動(dòng)子序列在二、四和六倍體小麥 物種中基本相同，受到了相同的調(diào)控方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供烏拉爾圖小麥TuPMM-Al基因的啟動(dòng)子p TuPMM-A。
[0008] 其中，烏拉爾圖小麥TuPMM-Al基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] ATGGCGGCGGCGAGGAAGGACGCCGGTGTGCTCGCGCTCTTCGACGTCGACGGCACCCTCACCGCGCCC CGCAAGGAGGTGACGCCGGAGATGCTCGAGTTCATGAAGCGCCTGCGCGAGGTGAGGCCCGAATGTGACCCTGTCTG TCGTTCTCTCGTTTCAGTTTCTTTTCCGTACAATTCTCAGGCGAGATTGCTCACTGTATGTCTGGGTTGTGGCACTC TGGTTTTCTTCCTGGGAGCAGAATGTGACCGTCGGCGTGGTGGGGGGATCCGATCTGGTCAAGATCTCCGAGCAGCT CGGCAAATCAGGTACCCGCCCTGCTTGGATTCAGCAGGACACTCTGCTTGGATTCAGAGTCCCCCCTAACCGCACTG TTCACTCACCTTGTCTGTAACTGTAACTGCAAGACTGAGCTTGATATTTGTTCTCCCCACTGCAGTCATCACCGACT ATGACTACGTCTTCTCCGAGAACGGCCTGGTCGCGCACAAGGACGGCAAGCTCATCGGGACGCAAGTAAGTGCCCAC GCCGCATAATGCGCGCTGTTTTAGCACAGATGTACAACTGAATTTTGCCTGGTGTTCTTCACTCTGCAGAGCTTGAA AACGTATCTTGGAGATGACCAACTTAAGGTGAGCCTGTGTTGTGTGACGTTTTTTTTTCTTGTACTGCTGTTGAAGA TGAGTTTTGAGGCCTTGGTAGTGATGTTTATGTGTTCTTTGCAGGAATTCATTAACTTCACTCTTCATTACATCGCG GATTTGGATATCCCAATTAAAAGGTCAGTGCGGAATCCTGTTTGAGAATTCCCTCGGACGCTTGCCCTTTACTGACC GGGTAAAGTAAATGTTTCCACAGGGGTACATTCATAGAGTTCAGGAGTGGAATGATCAATGTGTCGCCTATAGGGAG GAACTGTAGTCAAGAAGAACGTGATGATTTTGAGAAGTATGATAAGGTACAGATTGTCTTATAAGAACAAGTAGTTA GTCAATAATCAGAAAGGGGGGATAGCTATTAGAAAAACATGAAACTGAACCGACTCGTTTTGTTTAGGTACATAACG TTCGGCCTAAAATGGTGTCAGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCACACCTGAACCTGACTTTTTCTATTGGAGGGCAGATC AGTTTTGATGTAAGTGTTCTGAACTCATAAAAATCTGCTAGAAATCTTCAGTTTGGTATTTACTACTGCATCACTGA ATTCAGGTATTCCCACAAGGCTGGGACAAAACCTACTGCTTGAGATATCTGGAAGAATTCAAAGAAATCCATTTCTT TGGGGACAAAACCTACAAGGTAAGATACTTTAGTTGTGCAGTGCTTCCAAGTAAAGAAATCTCCTTTTCTTTTTTTG AAGTACTTTTGTGCACACAAGATGTTGTTTGATAAACTTTTCAAGCCACTGTTAACGACATCCCATTTAATTACTAC AGTACAAACTTAGCTGTACTGTATACTACAAACTGAAACTGACATTCGTTTTTCCTCTGATTATATTTAATAGGGTG GCAATGATCATGAGATATTTGAATCTGACAGAACAGTTGGTCATACAGGTATGCTCGTTGTATGTTAAAAGCTATTC TTCTGATGGTTATGAAATCTAGGAGGCATTTATATTTATATAGAGGACATCCCTGAACGAGCAATTTTGCATTGTAA AAAATATCATAGCTTAACAGGAGATTTCTCGAAGGGTTGGTTAATAAGTAAACAGGAGAGACAGAGAGAACCTCTTT GTAGCAAACGATATTATTAGTTGCCAACTGATTCCATATTTGGCATTGTGGTCAACCATGAGGGCAGTATCATTAAT ATCTAACCACTCTGAATTGTTGATGATCGAGCTGTAGTGGCTGTCAGAAACTACCTTTTCACCATCATATCTAATCA TCCGGAGTAGCACCTTTTCAAGTCATATTCGTCCCTGAAGAGTGCACCTCGGGCTGTAACCGAGTAAATAATAGGGC ATCAATAGCCCTTCAGAAACATTACACAGCTCCCATTGTAATTTAGTTGCAAAACATTACTCTGTTACTCCGCTTTG TTAGCGAGACTAGAGCTGGTGTCTGGCCCAGTTTTTTAGCCGAGTCCCACCCATGATTTATTTATCGGGATTTGGTG CTGACTGACCGTTTACATGTGCAGTTACCAGCCCCAATGACACTGTGCAGCAGTGCAAATCCATCTTCCTGTCGGAG TGA
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的二倍體烏拉爾圖小麥磷酸甘露糖變位酶基因啟動(dòng)子P TuPMM-A的核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 5' -ATCTCGCTCTGGCTCGTAGTGGAACTTTCCGAGCATAATTGGTTTGATGCCAACATTCTGCATTGC CATTATTTGGCAAGCCAACATTTGGCAAAATCAAAAGTCACCAAAATTTGGCGACTTTTTGTGAGATTGACAAGAAA AGTTGGTAGCCAACATTTGACATTTGCCAAATATTGTCATGCCAGCTTTTGGCAGCGAACCAATTATGCTCTCCGTC CTCATTTAGAACCTCTTTGTTAATGATTTTGGCCAACACCTTTTGGATGCGCTCATACTCTGTTAATAATTCCCCTA TGTCTATGTCCCTCTCCATCTCTTCGGACCACTTGACGATCTGGCTATGTTTTTGCAAATATTTGCTTTTCTTCAAT AAGTCGTATATGATGGCCATGGCACAATAGCAAGACCTATGAGAGGATTTGACATTTGGTTTTCTATAGCAACAAGC GCTAGTGAAGAACTTAATTTCGGAATGCTTTGTTATCGTCTCGTTGTAGTTCTTACACTTGGCTAGAGCATCATTTA GAACCTTCTTCAATCTGGTCCATTGCTTTTTAGGGTGTCTCGTCGAATCGAAAAAATAAGCCAAGCCCTGCGTCGGC AGTAGCGTGATTACGATCCAATATCGGTCACTGCGCAAAAAAAGAAGAAATTGGCATTGATGAGGTGAAACCAGAAG GTCATTTATATGTTTCAAAATAAATGAGTGAATGTTAACGACTTACTTGTCACAATATGGCACTAGTAAGGTGTCCT TACATGGATGATTCACAAGCATGCACGGGAACAGTAGTCCAAGATGAGCTCCTACTATTTCCGGTTTCCAGGTTGTG GCAGTGCATGTAAAAAGATCGAGTAAGGACACTTTACGATGCTGGAGTAGGCGATCTGAAGCTCCTTGAAGTACCCA AAGCCTTATTAACTCTGGGGAGGCTGCGCTGACAGAGAAGATATTCACATGGATCACCTCATTGAAGACTAGATCAA TTTTATCGGCCGAAAACTCTTGGATGAAATTGTAACCTTCTATGACCTTGGCCATGTATCCATGTTGACCTTCTTTT GATTTATCTACAACATCGGCGTGTAGAACTTGAAGATCGAGCGACCTTGCTGGGTGGCATTGGGCGTGCACAAGCCT ACATGCCAGAGCCTGGCCGAGCCCGCCTGTCGGTGTGTACGCCCCACACCGGGCTCGTCCGGTCACGACAAGCGGTT CATGCGTTGCGATCGCTCCACTGGCCGTATGTTGTGTCCGTCTTAGACGGCTCGTACATGGGGCTAGGCATCCAAGA TGCGTACCTGGGCAACCCGGCTCGGCGGTCCATGCTGGGTAGCTTTGGTCGGGCAAGCGGGGCATAGTGCGTGCGCC TGGCTCTATGGGTGTTGGTTCGTCCGTGCAAGCATTGTTCTCCGCGAGCTAGACATGCGCACTCGCCTGATGCACCC AGCCGGCTATGCAGAGGGATGTCCAGCCGTCTGTGCGGGCTGGGGGCGCTTGTCTGGGTCTTCTGGCTACCCAGCTG TGCGGATGGCCATTTAGCCGTTGTGCTGCCTATGGGAGGTGTTTTTTTGAAGGGGCCTATGGGAGGTGTTTGCCTGG CCCTTTCGGCTACCCGGTAGTTTGGCTGGGGCATTATGTCGATTTGCCGTGGCCCTGGTGTGTCTTGGCGCTTTGAT GTTTTCTTTGAGGCGGTTACATTTTCTTATAAGTTTGTTGTTTTACGGGCAATTCAGACGCGACGTTCATTGC