一種鼻咽癌抑制劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體的涉及一種鼻咽癌抑制劑及其應用，更具體的 涉及mir-363和/或miR-363在診治鼻咽癌中的新用途。
【背景技術】
[0002] 鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種發(fā)生于鼻咽粘膜，具有較高惡性 程度和極強轉移能力的惡性腫瘤。鼻咽癌是多基因遺傳性疾病，其發(fā)病與遺傳因素（遺傳 易感性）、EB病毒感染、環(huán)境因素、飲食習慣等多種因素有關，早期診斷、早期治療是挽救患 者生命和提高生活質量的最有效手段。遺憾的是，鼻咽癌起病隱匿，具有強烈的轉移傾向。 據統(tǒng)計，約75%的患者在就診時就已到達晚期，發(fā)生局部淋巴結和/或遠處轉移，治療后復 發(fā)或轉移則預后極差，成為鼻咽癌治療失敗的主要原因。因此，篩查鼻咽癌的腫瘤標記物， 爭取早期發(fā)現、選擇最佳治療方案、預測預后、監(jiān)測復發(fā)或轉移對鼻咽癌診療具有重要的臨 床意義。
[0003] miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)轉錄生成。Pol II結合在以后形成發(fā)夾結 構的頸環(huán)DNA序列附近。生成的轉錄本經修飾添加5'帽子結構和3'末端多腺苷酸尾巴結 構，并剪切，生成的產物稱為初級miRNA (pri-miRNA)，該產物可能長達數千或數百核苷酸， 可能包含多個miRNA環(huán)結構。
[0004] 單個pri-miRNA可能含一到六個miRNA前體。這些發(fā)夾結構每個由約70nt左右的 核苷酸組成。每個發(fā)卡結構附以部分序列以利于有效剪切處理。pri-miRNA中的雙鏈發(fā)夾 RNA 結構被叫做 DGCR8 的核蛋白（DiGeorge Syndrome Critical Region 8)辨認，DGCR8 同 Drosha酶一起形成微處理（microprocessor)復合體。在該復合體中，DGCR8組織Drosha 蛋白的RNase III結構域使其在距離發(fā)卡結構約11個核苷酸處切割pri-miRNA，使其釋放 發(fā)卡結構。釋放的發(fā)卡結構即為前miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在3'存在兩個懸空的核 苷酸，pre-miRNA 5'為磷酸集團，3'為羥基集團。
[0005] 在胞漿中，pre-miRNA發(fā)夾結構經RNase III Dicer切割處理。這種內源性核糖 核酸酶（endoribonuclease)與發(fā)夾結構的3'相互作用并在環(huán)的3'和5'臂上完成切割， 產生長約22nt并不完美匹配的miRNA :miRNA*雙鏈結構。
[0006] miRNA與靶mRNA的典型作用方式主要有兩種。在大多數情況下，復合物中的單 鏈miRNA與靶mRNA的3' UTR不完全互補配對，阻斷靶基因的翻譯，從而調芐基因表達。這 種方式主要影響蛋白表達水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。近來，有研宄對翻譯抑制理論提 出質疑，發(fā)現被抑制的革G mRNAs和miRNAs共同聚集于胞衆(zhòng)中被稱為P小體（processing bodies，P_bodies)的區(qū)域，這個區(qū)域還濃縮了許多參與mRNA降解的酶類。P小體可能是作 為未翻譯mRNA進行暫時的可逆儲存的容器，減少一些特定P小體組成蛋白的表達能夠緩和 miRNA介導的基因表達抑制作用。P小體是胞漿中的一定區(qū)域，它包含參與多種轉錄后過程 的蛋白質，例如：mRNA 降解（mRNA degradation)、無義介導 mRNA 衰退（nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，轉錄抑制及 RNA 介導的基因沉默（RNA-mediated gene silencing)。
[0007] 另一種作用方式與siRNA類似，當miRNA與mRNA完全互補配對時，Ago2蛋白通過 切割mRNA直接導致其降解，實現基因沉默。以siRNA參與的RNAi為例：siRNA可與RISC結 合，作為模板識別mRNA靶子，通過堿基互補配對原則，mRNA與siRNA中的反義鏈結合，置換 出正義鏈。雙鏈mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下產生22nt左右的siRNA，siRNA 繼續(xù)同RISC形成復合體，與siRNA互補的mRNA結合，使mRNA被RNA酶裂解。這個過程也 稱為轉錄后基因沉默（PTGS)。
[0008] 總之，當前認為miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對程 度有關。miRNA與目的基因配對不完全時，miRNA就以抑制目的基因的表達發(fā)揮作用；miRNA 與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因在互補區(qū)斷裂而導致基因沉默。另 外，miRNAs有時候也導致組氨酸修飾和啟動子區(qū)的DNA甲基化，從而影響靶基因的表達。除 此外，近來發(fā)現快速脫腺苷酸化（accelerated deadenylation)是miRNA抑制基因表達的 新機制。在哺乳動物細胞中發(fā)現miR-125b和let-7能夠促進mRNA聚腺苷酸尾巴（polyA tail)的去除。用3'組蛋白莖-環(huán)結構取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b對mRNA 含量的影響，還可以降低對蛋白質合成的作用，可見miRNA能通過降低翻譯效率和聚腺苷 酸化mRNA的濃度來抑制基因表達。
[0009] 本發(fā)明通過高通量測序分析鼻咽癌組織，獲得其miRNA表達數據，進而進行生物 信息學分析，選取后備miRNA進行分子生物學驗證及靶標驗證，結果顯示，本發(fā)明提供的 miRNA和鼻咽癌密切相關，可用于臨床診斷及預防檢測，具有很好的實際應用價值。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的還在于提供mir-363和/或miR-363在制備預防、診斷和/或治療 鼻咽癌試劑中的應用。mir-363的序列見序列表SEQ ID NO 1。mir-363的成熟miRNA為 miR-363序列見序列表SEQ ID NO 2。
[0011] 進一步，所述的預防、診斷鼻咽癌試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量 PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測鼻咽癌樣本中mir-363和/或miR-363的轉錄或基 于免疫檢測方法檢測鼻咽癌樣本中miR-363調控的靶基因的表達情況，優(yōu)選采用northern 雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細胞 術檢測鼻咽癌樣本中mir-363和/或miR-363的轉錄；采用ELISA和/或膠體金試紙條檢 測鼻咽癌樣本中miR-363調控的靶基因的表達情況。優(yōu)選所述miR-363調控的靶基因為 ARMCI、ATP6V1B2、C12orf 5、C5orf 30、CANDI、CCND2、CCNE2，更優(yōu)選的 miR-363 調控的靶基因 為 ARMC1、ATP6V1B2、C12orf5、CCND2、CCNE2。
[0012] 優(yōu)選的，所述的基于定量PCR方法包括特異性擴增mir-363和/或miR-363的 引物，進一步優(yōu)選特異性擴增mir-363引物序列為SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19,特異 性擴增miR-363引物序列為SEQ ID NO 3;所述的基于探針雜交方法包括與mir-363和/ 或miR-363的核酸序列雜交的探針；所述免疫檢測方法包括與miR-363調控基因表達蛋 白特異性結合的抗體，進一步優(yōu)選調控的靶基因為ARMC1、ATP6V1B2、C12orf5、C5orf30、 CANDI、CCND2、CCNE2蛋白特異性結合的抗體，更優(yōu)選的，調控的靶基因為ARMCl、ATP6V1B2、 C12orf5、CCND2、CCNE2。
[0013] 進一步，所述的治療鼻咽癌試劑包括上調mir-363和/或miR-363的轉錄和/或 促進miR-363的活性的試劑。優(yōu)選的，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術和/或基 因特異性miR Mimics技術上調mir-363和/或miR-363的轉錄和/或促進miR-363的活 性。更優(yōu)選人工合成111；[1'-363成熟11111?嫩的短發(fā)夾1?嫩(81101'1:113；[印;[111?嫩，8111?嫩）或通 過調控啟動子上調mir-363 0
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療鼻咽癌藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合 物包含：
[0015] (a)上調mir-363和/或miR-363的轉錄和/或促進miR-363的活性的試劑；
[0016] (b)藥劑學上能接受的載體。
[0017] 進一步，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術和/或基因特異性miR Mimics 技術上調mir-363和/或miR-363的轉錄和/或促進miR-363的活性。優(yōu)選人工合成 mir-363成熟miRNA的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)或通過調控啟動子上調 mir-363〇
[0018] 本發(fā)明的目的在于提供一種鼻咽癌診斷試劑，所述鼻咽癌診斷試劑能夠檢測鼻咽 癌樣本中mir-363和/或miR-363的轉錄或免疫檢測方法檢測鼻咽癌樣本中miR-363調控 的靶基因的表達情況。
[0019] 進一步，所述鼻咽癌診斷試劑基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/ 或基于探針雜交方法檢測鼻咽癌樣本中mir-363和/或miR-363的轉錄或基于免疫方法檢 測鼻咽癌樣本中miR-363調控的革El基因的表達情況，優(yōu)選采用northern雜交方法、miRNA 表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細胞術檢測鼻咽癌樣 本中mir-363和/或miR-363的轉錄；采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測鼻咽癌樣本 中miR-363調控的靶基因的表達情況。優(yōu)選所述mir-363的成熟miRNA調控的靶基因為 ARMCl、ATP6V1B2、C12orf5、C5orf30、CANDl、CCND2、CCNE2 蛋白特異性結合的抗體，更優(yōu)選 的，調控的靶基因為 ARMC1、ATP6V1B2、C12orf5、CCND2、CCNE2。
[0020] 優(yōu)選的，所述的用于定量PCR方法包括特異性擴增mir-363和/或miR-363的引 物；所述的基于探針雜交方法包括與mir-363和/或miR-363的核酸序列雜交的探針；所述 免疫檢測方法包括與miR-363調控基因表達蛋白特異性結合的抗體，進一步優(yōu)選調控的靶 基因為 ARMCl、ATP6V1B2、C12orf5、C5orf30、CANDl、CCND2、CCNE2 蛋白特異性結合的抗體， 更優(yōu)選的，調控的靶基因為ARMC1、ATP6V1B2、C12orf5、CCND2、CCNE2蛋白特異性結合的抗 體。
[0021] 定義：