一種檢測(cè)葡萄a(bǔ)病毒的rt-lamp試劑盒及其專用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)葡萄A病毒的RT-LAMP試劑盒及其 專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄A病毒（Grapevine virus A，GVA)為線形病毒科（Flexiviridae)葡萄病毒 屬（Vitivirus)病毒，是葡萄皺木復(fù)合病（rugose wood complex disease)的重要病原之 一，可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延遲、生長(zhǎng)減弱甚至衰退死亡等癥狀。葡萄A病 毒（Grapevine virus A，GVA)分布范圍很廣，目前在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生，自然寄 主為葡萄，可導(dǎo)致被侵染的葡萄植株出現(xiàn)卷葉，葉緣和葉柄變紅，莖的局部隆起和碎裂等癥 狀，可以通過機(jī)械接種、嫁接和無性繁殖材料傳播。自然條件下由粉蚧以半持久方式傳播， 也可以由介殼蟲（Neopulvinaria innumerabilis)傳播。葡萄生產(chǎn)周期長(zhǎng)且長(zhǎng)期無性繁殖， 帶毒種苗常造成病毒病廣泛流行，嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)。栽培無病毒苗木是防治果樹 病毒病的有效途徑之一，而病毒檢測(cè)水平的高低直接影響無病毒苗的推廣。為了有效提高 檢測(cè)效率，需要建立相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)。
[0003] 目前葡萄A病毒（Grapevine virus A，GVA)常采用的檢測(cè)方法有兩種，一種是血 清學(xué)檢測(cè)方法，如DAS-ELISA，但該方法不僅靈敏度較差，而且特異性也較低；另一種是分 子生物學(xué)檢測(cè)方法，其中以RT-PCR最為常見，但是需要特殊的儀器，如PCR儀。而且上述兩 種方法的檢測(cè)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，如血清學(xué)方法大約需要2天，分子生物學(xué)方法大約需要5小 時(shí)，無法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢疫的要求。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是利用 一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴(kuò)增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進(jìn)行核酸的 變性和自動(dòng)循環(huán)的鏈置換核酸擴(kuò)增反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)不需要特殊的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中 就可完成。LAMP技術(shù)在目的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了針對(duì)特異區(qū)域的6條引物，使擴(kuò)增反應(yīng)具有 很高的特異性。LAMP反應(yīng)結(jié)果的觀察方法非常簡(jiǎn)便，反應(yīng)結(jié)束后可通過肉眼在可見光下直 接觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定結(jié)果。由于LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效率很高，在少量cDNA存在 的條件下就可進(jìn)行核酸的大量擴(kuò)增，所以只需要在LAMP反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，通過逆 轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（RT-LAMP)就可以完成RNA的檢測(cè)。RT-LAMP具有簡(jiǎn)便、快速、靈 敏、特異的優(yōu)勢(shì)，尤其適合在基層開展RT-LAMP試劑盒的應(yīng)用推廣。目前RT-LAMP技術(shù)已廣 泛應(yīng)用于人類和動(dòng)植物各種病毒、細(xì)菌及寄生蟲等引起的疾病檢測(cè)和快速診斷。RT-LAMP技 術(shù)中，引物是決定檢測(cè)結(jié)果靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決技術(shù)問題是如何檢測(cè)葡萄A病毒（Grapevine virus A，GVA)。
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物L(fēng)F 和引物L(fēng)B組成，它們的核苷酸序列依次為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5 和序列6。其中，序列表的序列1由20個(gè)核苷酸組成，序列表的序列2由19個(gè)核苷酸組成， 序列表的序列3由39個(gè)核苷酸組成，序列表的序列4由39個(gè)核苷酸組成，序列表的序列5 由19個(gè)核苷酸組成，序列表的序列6由20個(gè)核苷酸組成。所述成套引物可以對(duì)葡萄A病 毒的總RNA進(jìn)行特異性的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。
[0007] 所述成套引物中，所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引 物L(fēng)F和所述引物L(fēng)B的摩爾比可為1:1:8:8:4:4。
[0008] 所述成套引物中，各引物的量如下：0. 2μπιο1所述引物F3、0. 2μπιο1所述引物B3、 1. 6 μ mol所述引物FIP、1. 6 μ mol所述引物ΒΙΡ、0· 8 μ mol所述引物L(fēng)F、0. 8 μ mol所述引物 LB 〇 〇
[0009] 所述摩爾比是總摩爾數(shù)之比，所述總摩爾數(shù)是引物中各種單鏈DNA摩爾數(shù)之和。
[0010] 所述成套引物中各條引物可分別單獨(dú)包裝。所述成套引物中各條引物可按照所述 摩爾比混合在一起。所述成套引物中各條引物可按照所述量混合在一起。
[0011] 所述成套引物的用途為如下a)或b)或c)或d) :a)制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)葡 萄A病毒的試劑盒；b)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有葡萄A病毒；c)制備用于鑒定 或輔助鑒定葡萄A病毒的試劑盒；d)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為候選的葡萄A病毒。 所述待測(cè)樣品可為植物樣品或微生物樣品。所述待測(cè)樣品具體可為未感染病毒的葡萄葉 片、感染了葡萄A病毒的葡萄葉片、感染了葡萄斑點(diǎn)病毒的葡萄葉片、感染了葡萄卷葉病毒 的葡萄葉片或感染了沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒的葡萄葉片。所述待測(cè)病毒可為葡萄A病毒、 葡萄斑點(diǎn)病毒、葡萄卷葉病毒或沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒。
[0012] 本發(fā)明還保護(hù)所述成套引物的應(yīng)用，為如下a)或b)或c)或d) :a)制備用于檢測(cè) 或輔助檢測(cè)葡萄A病毒的試劑盒；b)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有葡萄A病毒；c) 制備用于鑒定或輔助鑒定葡萄A病毒的試劑盒；d)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為候選的 葡萄A病毒。所述待測(cè)樣品可為植物樣品或微生物樣品。所述待測(cè)樣品具體可為未感染病 毒的葡萄葉片、感染了葡萄A病毒的葡萄葉片、感染了葡萄斑點(diǎn)病毒的葡萄葉片、感染了葡 萄卷葉病毒的葡萄葉片或感染了沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒的葡萄葉片。所述待測(cè)病毒可為葡 萄A病毒、葡萄斑點(diǎn)病毒、葡萄卷葉病毒或沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述成套引物的試劑盒。所述試劑盒的用途為如下e) 或f) :e)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有或疑似含有葡萄A病毒；f)鑒定或輔助鑒定 待測(cè)病毒是否為候選的葡萄A病毒。所述待測(cè)樣品可為植物樣品或微生物樣品。所述待測(cè) 樣品具體可為未感染病毒的葡萄葉片、感染了葡萄A病毒的葡萄葉片、感染了葡萄斑點(diǎn)病 毒的葡萄葉片、感染了葡萄卷葉病毒的葡萄葉片或感染了沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒的葡萄葉 片。所述待測(cè)病毒可為葡萄A病毒、葡萄斑點(diǎn)病毒、葡萄卷葉病毒或沙地葡萄莖痘相關(guān)病 毒。
[0014] 所述試劑盒還可包括2X反應(yīng)緩沖液（RM)和/或酶溶液。所述2X反應(yīng)緩沖 液（RM)和/或所述酶溶液（EM)可為北京藍(lán)譜生物科技有限公司產(chǎn)品目錄號(hào)為L(zhǎng)MP221的 "RT-LAMP逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒"中的組件。
[0015] 所述試劑盒中，所述2 X反應(yīng)緩沖液（RM)和/或所述酶溶液還可替換為鏈置換型 DNA聚合酶、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和/或反轉(zhuǎn)錄酶。所述鏈置換型DNA聚 合酶具體可為Bst DNA聚合酶大片段。所述反轉(zhuǎn)錄酶具體可為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。
[0016] 所述試劑盒還可包括熒光顯色劑。所述熒光顯色劑具體可為SYBR Green I核酸 染料。
[0017] 本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的應(yīng)用，為如下e)或f) :e)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中 是否含有或疑似含有葡萄A病毒；f)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為候選的葡萄A病毒。 所述待測(cè)樣品可為植物樣品或微生物樣品。所述待測(cè)樣品具體可為未感染病毒的葡萄葉 片、感染了葡萄A病毒的葡萄葉片、感染了葡萄斑點(diǎn)病毒的葡萄葉片、感染了葡萄卷葉病毒 的葡萄葉片或感染了沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒的葡萄葉片。所述待測(cè)病毒可為葡萄A病毒、 葡萄斑點(diǎn)病毒、葡萄卷葉病毒或沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有葡萄A病毒的方法，包括如下步驟：
[0019] 提取待測(cè)樣品的總RNA，以以上任一所述成套引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然 后進(jìn)行如下評(píng)判：如果所述成套引物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所述總RNA的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，則 待測(cè)樣品中含有或疑似含有葡萄A病毒；如果所述成套引物不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所述總RNA的逆轉(zhuǎn) 錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，則所述待測(cè)樣品不含有或疑似不含有葡萄A病毒。
[0020] 所述待測(cè)樣品可為植物樣品或微生物樣品。所述待測(cè)樣品具體可為未感染病毒的 葡萄葉片、感染了葡萄A病毒的葡萄葉片、感染了葡萄斑點(diǎn)病毒的葡萄葉片、感染了葡萄卷 葉病毒的葡萄葉片或感染了沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒的葡萄葉片。
[0021] 所述"檢測(cè)待測(cè)樣品是否感染葡萄A病毒的方法"具體可為方法一，包