基于核酸適體熒光探針HCy5的同型半胱氨酸試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及基于核酸適體巧光探針的同型半 脫氨酸H切試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 同型半脫氨酸為一種含硫氨基酸，是生物體內(nèi)蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，與半脫氨 酸相比，側(cè)鏈中多一個亞甲基。同型半脫氨酸是多種疾病的危險(xiǎn)因子，目前認(rèn)為同型半脫 氨酸增高是動脈粥樣硬化所致屯、腦血管疾病最廣泛、最強(qiáng)獨(dú)立的致病因素。同型半脫氨酸 還與神經(jīng)管崎形、帕金森病、老年性癡呆、慢性腎功能衰竭等多種疾病及某些藥物、腫瘤的 影響有關(guān)。檢測同型半脫氨酸的方法主要色譜法、免疫學(xué)方法和循環(huán)酶法。
[0003] 色譜法：氣相色譜一質(zhì)譜法測定同型半脫氨酸。該法可同時測定半脫氨酸、蛋氨 酸、脫硫離和甲基甘氨酸等多種物質(zhì)。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、 色譜柱制備諸多變異，使其難W標(biāo)準(zhǔn)化。而且HPLC設(shè)備價(jià)格昂貴、技術(shù)條件要求高，需?？?的維護(hù)人員，使其推廣困難。
[0004] 免疫學(xué)法；該法應(yīng)用特異性的抗S-腺巧同型半脫氨酸單克隆技術(shù)，采用巧光偏振 法或免疫法測定。同型半脫氨酸在S腺巧同型半脫氨酸水解酶和過量腺巧存在下，被轉(zhuǎn)換 成S腺巧同型半脫氨酸；預(yù)稀釋的混合物、抗-S-腺巧同型半脫氨酸單克隆抗體及標(biāo)記的巧 光S腺巧同型半脫氨酸示蹤物一同解育，儀器自動檢測偏振光的改變，即可測出標(biāo)本總同 型半脫氨酸水平?？贵w巧光分析法和比濁法不能直接檢測同型半脫胺酸，需一小時W上才 能出結(jié)果，操作步驟繁瑣。
[0005] 循環(huán)酶法；是利用酶底物特性，放大祀物質(zhì)（被測物）的檢測方法。血漿氧化型同 型半脫氨酸經(jīng)S己駿己基麟（TCE巧還原成游離型同型半脫氨酸，基于同型半脫氨酸甲基 轉(zhuǎn)移酶，S腺巧同型半脫氨酸水解酶構(gòu)成的循環(huán)酶體系W及脫氨酶輔酶體系的原理，分解產(chǎn) 物顯色，用自動生化分析儀在600nm波長測OD值得出血漿中的同型半脫氨酸的含量。
[0006] 目前沒有能夠直接識別同型半脫氨酸的抗體和其它分子探針。因此設(shè)計(jì)一種高度 設(shè)別同型半脫氨酸的分子探針，并基于此建立簡單快速和廉價(jià)的檢測方法將提高對屯、腦血 管等于同型半脫氨酸相關(guān)的疾病的的監(jiān)控。
[0007] 核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識別分，是指能夠高特異性和高親和 力地域祀分子結(jié)的單鏈核巧酸分子。核酸適體可W通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponentia化nrichment，SELEX)篩選獲得。沈LEX 技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核巧酸（由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列 組成）文庫，通過施加選擇壓力（結(jié)合祀目標(biāo)，淘選與祀目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程）， 并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù)，經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集，獲得與祀物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核巧酸 分子，可W是RNA也可W是DNA，長度一般為25?60個核巧酸。核酸適體主要通過發(fā)生 適應(yīng)性折疊，通過氨鍵、疏水堆積作用、范德華力與祀分子相互作用，與插入或包被的祀分 子形成穩(wěn)定的=維空間結(jié)構(gòu)。核酸適體不與祀分子結(jié)合時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)， 5'和3'兩端相互游離。與祀分子結(jié)合時，祀分子誘導(dǎo)核酸適體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核酸適體的 5'端和3'端都將參與與祀分子特定區(qū)域（類似于與抗體結(jié)合的抗原位點(diǎn)）的相互作用，導(dǎo) 致5'和3'兩端相互靠近。該一特點(diǎn)使核酸適體適于分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)。其中一種分子信 標(biāo)設(shè)計(jì)利用了巧光染料巧分子。當(dāng)一個激發(fā)態(tài)巧分子和另一個基態(tài)巧分子近距離遭遇的時 候能形成激發(fā)態(tài)二聚體，能在比巧單體波長更長的位置釋放一個光子。巧激發(fā)態(tài)二聚體發(fā) 射峰在480到500nm，而巧單體的發(fā)射峰在370到400nm之間。另外，巧分子巧光壽命比生 物樣品中的非特異激發(fā)巧光的壽命長，檢測時可W在非特異激發(fā)巧光消失后，再來收集激 發(fā)態(tài)二聚體的巧光信號，大大提高檢測的特異性和靈敏度。識別同型半脫氨酸的核酸適體 可W應(yīng)用于同型半脫氨酸的臨床檢測，提高檢測效率，降低檢測成本。
[000引核酸適體與祀物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性，使其在疾病診斷中具有 良好的應(yīng)用前景，盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少，但應(yīng)用適體檢測祀蛋白的研究卻不 斷增多，基于適體的檢測新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。核酸適體由于其獨(dú)特的化學(xué)抗體特性成為新 一代針對特定蛋白的分子藥物或祀向載體，W及用于檢測其特異性識別的祀分子物質(zhì)。但 是目前基于核酸適體的針對于同型半脫氨酸H切診斷試劑還很缺乏，且針對于同型半脫氨 酸H切的核酸適體巧光探針檢測試劑盒的開發(fā)尚未見有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差、重復(fù)性欠佳、干擾因素很多、操 作繁瑣、測試成本高等不足，提供一種基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸H切試劑盒 及其檢測方法。
[0010] 本發(fā)明的方案是通過該樣實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒，其特征在于，主要成分包括： 含NH4Cl、Tris、邸TA-N32的紅細(xì)胞裂解液；含MgCls的0. 2M磯酸緩沖液；同型半脫氨酸標(biāo)準(zhǔn) 品；同型半脫氨酸核酸適體巧光探針；所述同型半脫氨酸核酸適體巧光探針為5'和3'兩 端分別標(biāo)記巧光巧分子單體的核巧酸單鏈，該核巧酸單鏈序列為；gggctaatgc attgccatta atgcctacct ttgcctgggt ggtctaaccc。該序列命名為 HCy5。
[0012] W上所述的一種基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒，所述含NH4CI、 Tris、邸TA-N32的紅細(xì)胞裂解液為含有1?280mmol/L畑典1，1?34mmol/L Tris, 1? 2mmol/LEDTA-Na2, pH 7. 0 ?7. 2 ;所述含 MgCla的 0. 2M 磯酸緩沖液為含有 1 ?lOmmol/L MgClao
[0013] W上任一所述的一種基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒，其特征在 于，所述含畑典1、Tris、邸TA-N32的紅細(xì)胞裂解液、含MgCl 2的0. 2M磯酸緩沖液、同型半脫 氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、同型半脫氨酸核酸適體巧光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使用前需 加水溶解的干粉狀態(tài)。
[0014] W上所述的一種基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒，其特征在于，該 試劑盒用于檢測肝素抗凝全血或末梢血中的同型半脫氨酸濃度。
[0015] 一種用W上任一所述基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒來檢測同型 半脫氨酸濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括：
[0016] (1)血樣裂解；將血樣和含N&CUTris、邸TA-Na2的紅細(xì)胞裂解液按1:0. 5?5體 積比混勻，靜置5?30min，再中速離屯、5?lOmin，收集上清液；
[0017] 似混合卵育；混合卵育：取20?100 y 1步驟1)得到的上清液和30?50ul的 用含MgCls的0. 2M磯酸緩沖液，溶解同型半脫氨酸核酸適體巧光探針得到的同型半脫氨酸 核酸適體巧光探針試劑混合，室溫下卵育5?15min，使同型半脫氨酸核酸適體巧光探針與 血樣充分結(jié)合，得到測試液；
[0018] (3)巧光檢測；巧光檢測儀檢測步驟2)得到的測試液50ul，在巧光檢測儀巧光激 發(fā)后，讀取巧光激發(fā)后20至100ns時間段內(nèi)波長在480?500皿的巧光值；
[0019] (4)結(jié)果計(jì)算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照同型半脫氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，結(jié)合步驟3)中檢測到的巧光值計(jì)算出血樣中同型半脫氨酸的濃度。
[0020] W上所述的生物醫(yī)學(xué)軟件為Sigma plot軟件，于市面上可W購買到。
[0021] W上所述的一種用基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒來檢測同型半 脫氨酸濃度的方法，其特征在于，所述同型半脫氨酸核酸適體巧光探針試劑中同型半脫氨 酸核酸適體巧光探針濃度為200?400nmol/L，其特性還在于，所述同型半脫氨酸核酸適 體巧光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記巧光巧分子單體的核巧酸單鏈，該核巧酸單鏈序列為： gggctaatgc attgccatta atgcctacct ttgcctgggt ggtctaaccc。
[0022] 同型半脫氨酸核酸適體巧光探針不與同型半脫氨酸結(jié)合時，核酸適體處于比較松 散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的巧分子單體相互游離，巧光激發(fā)后發(fā)射