波長(zhǎng)在370?400皿之 間；同型半脫氨酸核酸適體巧光探針與同型半脫氨酸結(jié)合時(shí)，同型半脫氨酸誘導(dǎo)其發(fā)生結(jié) 構(gòu)改變，核酸適體5'和3'兩端的巧分子單體相互靠近，形成激發(fā)態(tài)二聚體，巧光激發(fā)后激 發(fā)態(tài)二聚體發(fā)射波長(zhǎng)在480到500nm之間。
[0023] W上所述的一種用基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒來(lái)檢測(cè)同型 半脫氨酸濃度的方法，其特征在于，所述的血樣為肝素抗凝全血或末梢血，所述含N&Cl、 Tris、邸TA-N32的紅細(xì)胞裂解液為含有1?280mmol/L NH4CI，1?34mmol/L Tris, 1? 2mmol/LEDTA-Na2, pH7. 0 ?7. 2 ;所述含 MgCla的 0. 2M 磯酸緩沖液為含有 1 ?lOmmol/L MgCl,;所述巧光檢測(cè)儀為具有時(shí)間分辨巧光測(cè)定的巧光檢測(cè)儀。
[0024] W上所述的一種用基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸試劑盒來(lái)檢測(cè)同型半 脫氨酸濃度的方法，其特征在于，該檢測(cè)方法用于檢測(cè)肝素抗凝全血或末梢血中的同型半 脫氨酸濃度。
[0025] 本發(fā)明的原理是：在不與同型半脫氨酸時(shí)，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和 3'兩端的巧分子單體相互游離，巧光發(fā)射波長(zhǎng)在370到400nm之間；與同型半脫氨酸結(jié)合 時(shí)，同型半脫氨酸誘導(dǎo)核酸適體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核酸適體的5'和3'兩端的巧分子單體相互 靠近，形成二聚體，巧激發(fā)態(tài)發(fā)射波長(zhǎng)二聚體在480到500nm之間。巧激發(fā)態(tài)二聚體巧光壽 命有著長(zhǎng)達(dá)l(K)ns，比生物樣品自發(fā)巧光壽命（約為5ns)長(zhǎng)，通過(guò)檢測(cè)同型半脫氨酸核酸適 體探針和樣品混合后的巧光強(qiáng)度和巧光壽命，計(jì)算樣品中同型半脫氨酸的濃度。
[0026] 本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步是：
[0027] (1)檢測(cè)操作簡(jiǎn)單快速，無(wú)需復(fù)雜樣品加工和分離，將核酸適體探針直接加入裂解 后的血樣液，用巧光分光光度計(jì)短時(shí)間內(nèi)就可W檢測(cè)480?500nm處的巧光值；
[002引 （2)本試劑盒及其檢測(cè)方法具有靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性高，樣品檢測(cè)誤差在 0. 01?0. 1%之間，特異性強(qiáng)，同型半脫氨酸核酸適體巧光探針不與同型半脫氨酸結(jié)合時(shí)， 核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的巧分子單體相互游離，巧光激發(fā)后發(fā)射波 長(zhǎng)在370?400nm之間；其與同型半脫氨酸結(jié)合時(shí)，同型半脫氨酸誘導(dǎo)其發(fā)生改變，核酸適 體5'和3'兩端的巧分子單體相互靠近，形成二聚體，巧光激發(fā)后二聚體發(fā)射波長(zhǎng)在480? 500nm之間。
[0029] (3)所用的試劑可W使配制好可直接使用的液體試劑或是使用前加水溶解后使用 的干粉狀態(tài)，檢測(cè)試劑可W常溫貶存，運(yùn)輸方便。
【具體實(shí)施方式】
[0030] W下結(jié)合表1和實(shí)施例描述本發(fā)明基于核酸適體巧光探針的同型半脫氨酸H切試 劑盒及其檢測(cè)方法。
[0031] 表1.實(shí)施例中的試劑盒試劑成分組成
[0032]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在于，主要成分包括： 含順4(：1、1'1^40了4-似 2的紅細(xì)胞裂解液；含1%(：12的0.211磷酸緩沖液；同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn) 品；同型半胱氨酸核酸適體熒光探針；所述同型半胱氨酸核酸適體熒光探針為5'和3'兩 端分別標(biāo)記焚光花分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：gggctaatgc attgccatta atgcctacct ttgcctgggt ggtctaaccc〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征 在于，所述含NH4C1、Tris、EDTA-Nad^J紅細(xì)胞裂解液為含有1?280 mmol/L NH4C1，1~34 mmol/L Tris, l~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7. 0~7. 2 ;所述含]\%(：12的 0? 2M 磷酸緩沖液為含有 1-1 Ommol/],MgCl2〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其 特征在于，所述含NH4C1、Tris、EDTA-Nad^紅細(xì)胞裂解液、含MgCl 2的0. 2M磷酸緩沖液、同 型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、同型半胱氨酸核酸適體熒光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使 用前需加水溶解的干粉狀態(tài)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特 征在于，該試劑盒用于檢測(cè)肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸濃度。
5. -種用權(quán)利1~3任一所述基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來(lái)檢測(cè)同 型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括： (1) 血樣裂解：將血樣和含見(jiàn)14(：1、1'1^8 4014-似2的紅細(xì)胞裂解液按1:0.5~5體積比混 勾，靜置5~30min，再中速離心5~10min，收集上清液； (2) 混合卵育：取20~100 y 1步驟1)得到的上清液和30~50ul的用含1%(：12的0. 2M 磷酸緩沖液，溶解同型半胱氨酸核酸適體熒光探針得到的同型半胱氨酸核酸適體熒光探針 試劑混合，室溫下卵育5~15min，使同型半胱氨酸核酸適體熒光探針與血樣充分結(jié)合，得到 測(cè)試液； (3) 熒光檢測(cè)：熒光檢測(cè)儀檢測(cè)步驟2)得到的測(cè)試液50ul，在熒光檢測(cè)儀熒光激發(fā)后， 讀取熒光激發(fā)后20至100ns時(shí)間段內(nèi)波長(zhǎng)在480~500nm的熒光值； (4) 結(jié)果計(jì)算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 結(jié)合步驟3)中檢測(cè)到的熒光值計(jì)算出血樣中同型半胱氨酸的濃度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來(lái) 檢測(cè)同型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸核酸適體熒光探針試劑中 同型半胱氨酸核酸適體熒光探針濃度為200~400 nmol/L，所述同型半胱氨酸核酸適體熒 光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為： gggctaatgc attgccatta atgcctacct ttgcctgggt ggtctaaccc〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來(lái)檢 測(cè)同型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，所述的同型半胱氨酸核酸適體熒光探針不與同 型半胱氨酸結(jié)合時(shí)，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離， 熒光激發(fā)后發(fā)射波長(zhǎng)在370~ 400nm之間；所述的同型半胱氨酸核酸適體熒光探針與同型 半胱氨酸結(jié)合時(shí)，同型半胱氨酸誘導(dǎo)其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，核酸適體5'和3'兩端的芘分子單體 相互靠近，形成激發(fā)態(tài)二聚體，熒光激發(fā)后激發(fā)態(tài)二聚體發(fā)射波長(zhǎng)在480到500nm之間。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來(lái) 檢測(cè)同型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，所述的血樣為肝素抗凝全血或末梢血，所述含順4(：1、1^8、￡014-似2的紅細(xì)胞裂解液為含有1~280臟〇1/1順 4(：1，1~34臟〇1/ L Tris, l~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7. 0~7. 2 ;所述含]\%(：12的0? 2M磷酸緩沖液為含有 l~10mmol/L MgCl2;K述熒光檢測(cè)儀為具有時(shí)間分辨熒光測(cè)定的熒光檢測(cè)儀。
9.根據(jù)權(quán)利要求5~7所述的一種用基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來(lái) 檢測(cè)同型半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，該檢測(cè)方法用于檢測(cè)肝素抗凝全血或末梢血 中的同型半胱氨酸濃度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸HCy試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定同型半胱氨酸HCy濃度的方法、測(cè)定試劑組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括：紅細(xì)胞裂解液、磷酸緩沖液PBS、同型半胱氨酸HCy標(biāo)準(zhǔn)品、同型半胱氨酸HCy核酸適體熒光探針；通過(guò)血樣裂解、混合卵育處理，結(jié)合熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，從而測(cè)算出同型半胱氨酸HCy的濃度大小。本發(fā)明具有樣品處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N21-64
【公開(kāi)號(hào)】CN104597007
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410715903
【發(fā)明人】陳燕婷, 張莘蔓, 李紅梅
【申請(qǐng)人】陳燕婷, 張莘蔓, 李紅梅
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2014年11月30日