人NF-kB的核酸適配體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本申請(qǐng)涉及一種人NF-kB的核酸適配體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 因子kB(NF-kB)是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是一種具 有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子。目前已發(fā)現(xiàn)NF-kB調(diào)節(jié)著100多種靶基因的表達(dá)，包括 細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、黏附分子、某些急性期反應(yīng)蛋白以及參與免疫識(shí)別的受體 和抗原遞呈的蛋白質(zhì)等。這些分子大多數(shù)在免疫調(diào)控、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡中起重要 作用。NF-kB的過(guò)度活化會(huì)激活、增強(qiáng)機(jī)體的非特異及特異性免疫反應(yīng)，造成組織損傷和器 官功能紊亂。NF-kB還可上調(diào)CyclinDl (CCNDI)等致癌基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。NF-kB 激活對(duì)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲具有明顯的促進(jìn)作用。因此，對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-kB信號(hào)強(qiáng)度 的計(jì)算和調(diào)控，將有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞惡性表型的檢測(cè)和逆轉(zhuǎn)。
[0003] 核酸適配體（aptamer)由約50bp寡核苷酸組成的DNA或RNA序列，一般經(jīng)過(guò)體外 系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選而得到。核酸適配體能形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)與靶分子特異性得相結(jié) 合。Aptamer的靶分子廣泛，可以是蛋白質(zhì)、核酸、短肽、氨基酸、化合物、代謝小分子等，甚至 可以是細(xì)胞。核酸適配體已在高靈敏分析、疾病診斷和癌癥治療等方面顯示出重要的應(yīng)用 前景。有研究提示，如果將核酸適配體的序列插入至一些目的基因的5'非翻譯區(qū)內(nèi)，當(dāng)與 配體相結(jié)合時(shí)，可在局部形成非常穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并抑制核糖體小亞基的結(jié)合或滑動(dòng)，從 而可以有效抑制目的基因的翻譯起始和表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種新的人NF-kB的核酸適配體及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供一種人NF-kB的核酸適配體，其序列如SEQIDNO: 1所示。
[0006]所述的核酸適配體作為NF-kB抑制劑的應(yīng)用。
[0007]所述的核酸適配體在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0008]所述腫瘤包括膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌和黑色素瘤。所 述腫瘤細(xì)胞為膀胱癌細(xì)胞系T24和UM-UC-3。
[0009]所述的核酸適配體在調(diào)控腫瘤細(xì)胞中NF-kB信號(hào)強(qiáng)度的應(yīng)用。
[0010] 檢測(cè)時(shí)，可以將核酸適配體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入膀胱癌細(xì)胞系T24。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：通過(guò)設(shè)計(jì)NF-kB的核酸適配體，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)NF-kB的抑制， 進(jìn)而能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是本實(shí)施方式人NF-kB的核酸適配體的構(gòu)建示意圖；
[0013] 圖2是顯示NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)能夠產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性NF-kB信號(hào)的有效應(yīng)答的檢測(cè) 圖，其中，林表示與對(duì)照組相比，P值小于0. 01，A指陰性對(duì)照，B指NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)，C指 陰性對(duì)照+NF-kB siRNA，D指NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)+NF-kBsiRNA，E指NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)+siRNA對(duì) 眧.
[0014] 圖3是顯示NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)能夠有效降低NF-kB下游靶基因的表達(dá)的檢測(cè)圖，其 中，**表示與對(duì)照組相比，P值小于0. 01，黑色長(zhǎng)條指陰性對(duì)照，白色長(zhǎng)條指NF-kB監(jiān)控系 統(tǒng)；
[0015] 圖4是顯示NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)能夠有效抑制了膀胱癌細(xì)胞系T24的增殖的檢測(cè)圖， 其中，**表示與對(duì)照組相比，P值小于0. 01，上面的線條表示陰性對(duì)照，下面的線條表示實(shí) 驗(yàn)組（NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)）；
[0016] 圖5是顯示NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)能夠有效誘導(dǎo)了膀胱癌細(xì)胞系T24的凋亡的檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 技術(shù)與方法
[0019] 1?細(xì)胞培養(yǎng)
[0020] 膀胱癌細(xì)胞系T24和UM-UC-3購(gòu)自American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA)，細(xì)胞培養(yǎng)液由 90 % 的DMEM (Invitrogen, CA)，10 % 的胎 牛血清（Invitrogen)，1%-2%的谷氨酰胺和0? 5% -1%的雙抗配成。
[0021] 2.NF-kB監(jiān)控系統(tǒng)的構(gòu)建
[0022] 體外化學(xué)合成NF-kB的核酸適配體序列兩個(gè)拷貝。中間以連接序列分開(kāi)。引入酶 切位點(diǎn)StuI和NheI于該元件的上下游，同時(shí)用酶切psiCHECKTM-2雙熒光素酶表達(dá)載體。 經(jīng)T4DNA連接酶將二者連接6小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，搖菌、涂板、挑選陽(yáng)性克 隆，并提純質(zhì)粒。
[0023] 3?細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0024] 轉(zhuǎn)染前一天，4-5XIO4個(gè)細(xì)胞接種在24孔板上，加入0. 5ml培養(yǎng)基，放在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。生長(zhǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%，在50ul的無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)加入Iug 重組質(zhì)粒，柔和混勻。在50ul無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)加入lulLipofectamin2000(Invitrogen,CA )試劑，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的質(zhì)粒和Lipo2000輕柔混勻，室溫放置20分 鐘，以便形成質(zhì)粒/lipofectamin復(fù)合物。將質(zhì)粒/Iipofectamin混合物加入24孔板內(nèi)， 輕柔搖晃24孔板。放入培養(yǎng)箱內(nèi)，4-6小時(shí)后更換培養(yǎng)基，48小時(shí)后收集細(xì)胞，準(zhǔn)備下一步 實(shí)驗(yàn)。
[0025] 4?總RNA提取
[0026] 使用美國(guó)nvitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA。使用紫外分光光度計(jì)和2% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量。定量后于-80°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0027] 5?實(shí)時(shí)定量PCR
[0028]使用美國(guó)Fermentas的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit把上 述總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟如下：取總RNA2ug，加入oligo(dT) 18 (0. 5ug/ ul)，加DEPC處理的水至12ul。65°C反應(yīng)5分鐘，取出后立即置冰上。加5Xreaction buffer4ul，RNA酶抑制劑（20u/ul)lul，dNTP(10mM)2ul，混勻，瞬時(shí)離心。37°C反應(yīng) 5 分鐘，取出后立即置冰上。加MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/ul)lul至20ul。42°C反應(yīng)60分 鐘。85°C10分鐘終止反應(yīng)后，立即置于冰上冷卻，逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA儲(chǔ)存于-80°C。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。實(shí)時(shí)定量PCR引物序列如下：HIF-1a 正向引物（SEQIDNO:3) :5 ' -CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3 '，反向引物（SEQIDNO: 4):5，-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3，；VEGF正向引物（SEQIDNO:5):5，-AGCCTTG CCGCCTTGCTGCTCTA-3 '，反向引物（SEQIDN0:6):5 ' -GTGCTGGCCTTGGTGAGG-3 '; Bcl-XL正向引物（SEQIDN0:7):5 ' -GGTCGCAITGTGGCCTTCTT-3 '，反向引物 (SEQIDN0:8):5，-GCAGGTCTGCTGACCTCACT-3，；GAPDH正向引物（SEQIDNO: 9) : 5，-CGCTCTCTGCTCCTCCTGITC-3，，反向引物（SEQIDNO: 10) : 5'-ATCCGITGACTCCGAC CTTCAC-3'.GAPDH用作內(nèi)參。PCR總反應(yīng)體系為 20ul，包括 10iil2XAll-in-0ne?qPCR Mix(GeneCopoieaInc,美國(guó)），0.4iil正向引物，0.4iil反向引物，IniFirst-Strand cDNA, 50XR0XReferenceDyeO. 4ul和 7. 8ul雙蒸水。使用ABIPRISM7000Fluorescent QuantitativePCRSystem(App