聚透明質(zhì)酸或者寡聚透明質(zhì)酸鹽的用途及其組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮?01210497017. 3的母案的分案申請(qǐng)，該母案的申請(qǐng)日為2012 年11月29日，發(fā)明名稱為"一種芽孢桿菌、一種透明質(zhì)酸酶及其制備方法和用途"。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于酶學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及聚透明質(zhì)酸或者寡聚透明質(zhì)酸鹽的用途， 以及含有聚透明質(zhì)酸和/或寡聚透明質(zhì)酸鹽的組合物。
【背景技術(shù)】
[0003] 透明質(zhì)酸（hyaluronicacid，HA)是一種酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡 糖醛酸雙糖重復(fù)單位構(gòu)成的無(wú)分支高分子糖胺聚糖，存在于動(dòng)物組織細(xì)胞間質(zhì)和某些細(xì)菌 的莢膜中。透明質(zhì)酸廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域，分子量一般為1〇 5 - 10 7Da(道爾 頓）。
[0004] 寡聚透明質(zhì)酸是指分子量小于10kDa的透明質(zhì)酸。研究表明，分子量對(duì)透明質(zhì)酸 的活性有很大影響，不同分子量的透明質(zhì)酸甚至表現(xiàn)出截然相反的活性（郭學(xué)平等，低分 子量及寡聚玻璃酸，中國(guó)生化藥物雜志，2003, 24 (3) : 148-150)。
[0005] 研究表明，寡聚透明質(zhì)酸在體內(nèi)具有促血管生成作用，在體外可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì) 胞的增生，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合（WestDC,KumarS.Theeffectofhyaluronateandits oligosaccharidesonendothelialcellproliferationandmonolayerintegrity.Exp CellRes. 1989, 183(1) : 179-96)。寡聚透明質(zhì)酸鹽具有促血管生成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等生物 活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
[0006] 在炎癥過(guò)程中，寡聚透明質(zhì)酸對(duì)樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞具 有強(qiáng)力活化作用（TermeerC，BenedixF，SleemanJ，etal.Oligosaccharides ofHyaluronanactivatedendriticcellsviatoll-likereceptor4.JExp Med. 2002, 195(1) : 99-111)。
[0007] 寡聚透明質(zhì)酸在體外可抑制小鼠TA3/St乳腺癌細(xì)胞、大鼠CG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、 人HCT克隆瘤細(xì)胞及人LXI肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有抗腫瘤作用（GhatakS，MisraS，Toole BP.HyaluronanconstitutivelyregulatesErbB2phosphorylationandsignaling complexformationincarcinomacells.JBiolChem. 2005,280(10):8875-83)〇
[0008] 此外，寡聚透明質(zhì)酸鹽分子中的羥基、羧基和其他極性基團(tuán)可與水分子形成氫鍵 而結(jié)合大量的水分，保水效果明顯，因此寡聚透明質(zhì)酸鹽可用于防曬、抗衰老、保濕化妝品 中。
[0009]目前，透明質(zhì)酸降解的方法主要有物理降解、化學(xué)降解、生物降解三大類，物理降 解法很難將透明質(zhì)酸降至10kDa以下，化學(xué)降解法和酶法可以制備寡聚透明質(zhì)酸，但化學(xué) 降解法制備寡聚透明質(zhì)酸，需要較劇烈的反應(yīng)條件（如較高的酸堿濃度等）才能達(dá)到最大 程度的降解。此時(shí)，不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖（葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）殘基 的結(jié)構(gòu)也遭到破壞，如乙?；凰獾?，單糖六元環(huán)斷裂等（表現(xiàn)在紅外圖譜上是與歐洲 藥典標(biāo)準(zhǔn)圖譜不一致），對(duì)制得的寡聚透明質(zhì)酸的生物活性產(chǎn)生一定影響（郭學(xué)平等，低分 子量及寡聚玻璃酸，中國(guó)生化藥物雜志，2003,24(3) :148-150)。化學(xué)降解法制備的寡聚透 明質(zhì)酸還容易發(fā)生褐變（中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110008110. 9)，生產(chǎn)過(guò)程會(huì)污染環(huán)境。而酶解 法降解透明質(zhì)酸時(shí)，只斷裂單糖分子間的糖苷鍵，不會(huì)對(duì)其他結(jié)構(gòu)造成破壞，而且酶解法反 應(yīng)條件溫和，不用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，制備的寡聚透明質(zhì)酸不會(huì)發(fā)生褐變，不會(huì)造成環(huán)境污染，并且 酶解法制備的寡聚透明質(zhì)酸的雙糖結(jié)構(gòu)完整，紅外圖譜與歐洲藥典圖譜一致，因此酶解法 最適合制備寡聚透明質(zhì)酸。
[0010] 降解透明質(zhì)酸所用的酶主要是透明質(zhì)酸酶（又稱為玻璃酸酶），根據(jù)作用機(jī)制的 不同，可以分為3類：（1)內(nèi)切-e-N-乙酰氨基葡糖苷酶，為水解酶，作用于0 -1，4糖苷鍵， 終產(chǎn)物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素，并有轉(zhuǎn)糖苷酶活性。哺乳動(dòng)物來(lái)源的 以及動(dòng)物毒液來(lái)源的屬于此類。（2)水蛭、十二指腸蟲(chóng)來(lái)源的透明質(zhì)酸酶，為內(nèi)切-0-葡 糖苷酸酶，作用于0-1，3糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產(chǎn)物是四糖，特異性降解透明質(zhì) 酸；（3)細(xì)菌透明質(zhì)酸酶，也稱為透明質(zhì)酸裂解酶（hyaluronatelyase)，作用于0 -1，4糖 苷鍵，通過(guò)0 -消去機(jī)制得到4, 5-不飽和雙糖（Kreil,G,Hyaluronidases-agroupof neglectedenzymes,ProteinSci, 1995,4(9):1666-1669)〇
[0011] 目前工業(yè)生產(chǎn)寡聚透明質(zhì)酸或其鹽的方法是化學(xué)降解法，由于含透明質(zhì)酸酶 的動(dòng)物組織來(lái)源有限，有文獻(xiàn)報(bào)道的微生物來(lái)源透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液?jiǎn)挝幻富钶^低，發(fā) 酵液最高酶活是 1.3X102IU/mL(W02010130810Al;EileenIngham,K.T.Holland,G. Gowlandandff.J.Cunliffe,PurificationandPartialCharacterizationof HyaluronateLyase(EC4. 2. 2. 1)fromPropionibacteriumacnes,JournalofGeneral Microbiology(1979)，115, 411-418)，其余文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的酶活均低于100IU/mL，不可能大規(guī)模 制備透明質(zhì)酸酶，也就不可能用酶法大規(guī)模生產(chǎn)寡聚透明質(zhì)酸或其鹽。
[0012] 此外，目前一般將分子量在l〇4Da- 106Da的透明質(zhì)酸稱為低分子透明質(zhì)酸 (LMW-HA) 〇分子量為2萬(wàn)一6萬(wàn)的LMW-HA可刺激體外培養(yǎng)的骨細(xì)胞的增生，增加培養(yǎng)基 中骨細(xì)胞集落的數(shù)目和單個(gè)集落的面積（US5646129)。使用含有妥布霉素和分子量為50 萬(wàn)的HA的滴眼液治療細(xì)菌性角膜潰瘍，與只含妥布霉素的滴眼液相比，可顯著縮短愈合 時(shí)間（GandolfiSA,MassariA,OrsoniJG.Low-molecular-weightsodiumhyaluronate inthetreatmentofbacterialcornealulcerss[J].GraefesArchClinExp Ophthalmol, 1992, 230(1) :20-23)。韓國(guó)專利（KR20080087941)提供了一種含分子量小于 10萬(wàn)的HA的組合物，該組合物易于被人體吸收，口服可有效改善皮膚皺紋、提高皮膚彈性。 日本專利（JP2000-103723)提供了 一種含分子量20萬(wàn)一 40萬(wàn)HA的組合物，該組合物可促 進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。但是，與寡聚透明質(zhì)酸或其鹽的情形類似，酶解法制備的低分子透明質(zhì)酸或其 鹽在結(jié)構(gòu)上比化學(xué)法制備的要完整，化學(xué)法制備的低分子透明質(zhì)酸或其鹽的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生開(kāi) 環(huán)、脫乙?；取?br>[0013] LMW-HA因其相對(duì)分子質(zhì)量較小，外用時(shí)可被皮膚更好的吸收，促進(jìn)皮膚營(yíng)養(yǎng)的供 給和廢物排泄，從而防止皮膚老化，達(dá)到深層保濕和美容養(yǎng)顏的效果，而且還可促進(jìn)表皮細(xì) 胞的增殖和分化，清除氧自由基，修復(fù)日光或紫外線傷害的皮膚。口服LMW-HA易于吸收，不 僅可以活化皮膚細(xì)胞，保持表皮濕潤(rùn)，同時(shí)具有良好的增強(qiáng)免疫功能和抗衰老功能。因此化 妝品用及保健食品用HA多為L(zhǎng)MW-HA。另外，LMW-HA還具有促血管生成、細(xì)胞免疫活化和促 進(jìn)骨生成的作用，對(duì)治療細(xì)菌性角膜潰瘍具也有良好的療效，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
[0014]LMW-HA是由高分子量HA降解得到的，降解的方法主要有物理降解、化學(xué)降解、生 物降解三大類。物理降解法中的超聲降解法雖然不添加化學(xué)試劑和酶，但很難將高分子量 HA降解至分子量200kDa以下（覃彩鳳，王淼，陳曉峰.透明質(zhì)酸的降解方法及工藝條件 研究[J]. 2007, 4:32-36)。機(jī)械研磨法也是一種有效降低HA相對(duì)分子量的方法，有專利 報(bào)道在室溫下研磨時(shí)間為0. 5h- 12h，振蕩頻率為10Hz- 30Hz，但不適用于大規(guī)模生產(chǎn) (CN101942037A)?；瘜W(xué)降解法會(huì)造成結(jié)構(gòu)破壞，這時(shí)不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖 (葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）殘基的結(jié)構(gòu)也可能遭到破壞，如乙?；凰獾簟翁橇h(huán) 斷裂等。
[0015] 有報(bào)道酶解法生產(chǎn)低分子HA的制備過(guò)程，先將HA從發(fā)酵液中分離純化出來(lái)， 然后再添加入透明質(zhì)酸酶進(jìn)行酶解，再經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾、乙醇沉淀、脫水干燥得到低分子 HA(CN101020724A)，上述制備工藝所用的透明質(zhì)酸酶為透明質(zhì)酸酶成品，價(jià)格很高，很難實(shí) 現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道的微生物來(lái)源透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液?jiǎn)挝幻富钶^低，發(fā)酵液最 高酶活是1. 3X102IU/mL(W02010130810Al)，其余文獻(xiàn)報(bào)道的酶活均低于102IU/mL，因此應(yīng) 用酶切法大規(guī)模生產(chǎn)低分子HA目前很難實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一種芽孢桿菌和一種透明質(zhì)酸 酶。該透明質(zhì)酸酶活性高，可達(dá)10 5IU/mL(發(fā)酵液），純化后可以達(dá)到8X106 - 1. 5X10 7IU/ mg，遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)中報(bào)道的最高酶活。該透明質(zhì)酸酶的分子量為123KDa，最適作用溫度 及pH分別為42 °C、6. 5,熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性高。該酶可催化裂解透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素， 但是不能降解海藻酸鈉，肝素鈉，殼聚糖，幾丁質(zhì)和羥甲基纖維素鈉。利用該透明質(zhì)酸酶降 解高分子透明質(zhì)酸，反應(yīng)速度快、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)低分子 透明質(zhì)酸及寡聚透明質(zhì)酸，還可生產(chǎn)低分子硫酸軟骨素（本發(fā)明中是指分子量為1，〇〇〇 - 10, 〇〇〇的硫酸軟骨素，也稱為低分子量硫酸軟骨素）。本發(fā)明采用芽孢桿菌發(fā)酵得到的透 明質(zhì)酸酶對(duì)高分子量透明質(zhì)酸或其鹽進(jìn)行降解，酶活高、條件溫和、操作簡(jiǎn)單、無(wú)環(huán)境污染。 由此提供了下述發(fā)明：
[0017] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種芽孢桿菌，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 5744,保藏日期為 2012年2月8日，保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)。
[0018] 針對(duì)現(xiàn)今生物降解透明質(zhì)酸或其鹽所需降解酶活性低、來(lái)源有限、成本高的缺點(diǎn)， 發(fā)明人從空氣中分離得到了一種產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的芽孢桿菌（Bacillussp.)A50,該菌種 已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為 CGMCCNo. 5744,保藏時(shí)間為2012年2月8日。
[0019] 本發(fā)明的另一方面涉及一種制備透明質(zhì)酸酶的方法，包括使用本發(fā)明的芽孢桿菌 的步驟。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的制備透明質(zhì)酸酶的方法，其包括下述步驟：將本發(fā)明的芽孢桿菌斜 面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、離心、硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾，制得透明質(zhì)酸酶。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的制備透明質(zhì)酸酶的方法，其包括如下步驟：
[0022] (1)將本發(fā)明的芽孢桿菌進(jìn)行斜面培養(yǎng)，得斜面菌種；
[0023] (2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在25-40°C、100-200rpm的條 件下培養(yǎng)10-24h，得種子液；
[0024] (3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 - 40°C、100 - 300rpm的條件 下培養(yǎng)12 - 24h，得透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液；
[0025] (4)離心分離發(fā)酵液，取上清液；
[0026] (5)將上清液用硫酸銨分級(jí)沉淀，過(guò)濾（例如采用0.65ym的微孔濾膜進(jìn)行過(guò) 濾），得到粗制的透明質(zhì)酸酶；
[0027] (6)將步驟（5)沉淀出來(lái)的粗制透明質(zhì)酸酶溶于磷酸鹽緩沖液中，超濾除去小分 子雜質(zhì)，得純化的透明質(zhì)酸酶。
[0028] 可選地，步驟（6)也可以采用如下的步驟（6 - 1)至（6 - 3):
[0029] (6 - 1):將步驟（5)中的粗制透明質(zhì)酸酶溶于pH4. 5 - 8. 0的緩沖溶液中，得粗 酶液；將粗酶液裝入截留分子量為3.OX103 - 1. 4X10 4Da的透析袋，放入pH4. 5 - 8. 0的 緩沖溶液中，4°C下透析過(guò)夜；
[0030] (6-2):將透析后的粗酶液進(jìn)行離子交換色譜分離，色譜柱填料是DEAE瓊脂糖凝 膠FF介質(zhì)，用0-0. 5MNaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，并收集洗脫峰；
[0031] (6 - 3):將步驟（6 - 2)得到的透明質(zhì)酸酶樣品進(jìn)行冷凍真空干燥，得到白色粉 末，即為透明質(zhì)酸酶。
[0032] 步驟6 - 1至6 - 3是對(duì)透明質(zhì)酸酶的進(jìn)一步純化。
[0033] 上述分離純化透明質(zhì)酸酶的方法中，SDS-PAGE電泳檢測(cè)步驟（6-2)得到的透明質(zhì) 酸酶純度達(dá)到97%以上。
[0034] 上述步驟⑴中，每100mL斜面培養(yǎng)基中含有以下成分：蛋白胨0.2 - 2. 0g，酵 母粉 0? 2 - 2. 0g，K2HP04 ? 3H20 0? 05 - 0? 15g，MgS04 ? 7H20 0? 05 - 0? 15g，葡萄糖 0? 5 - 1. 5g，瓊脂粉2. 0g，pH調(diào)至6. 0 - 8. 0,斜面培養(yǎng)的溫度為25 - 40°C。
[0035] 上述步驟⑵中，每100mL種子培養(yǎng)基中含有以下成分：蛋白胨0.2 - 2. 0g，酵 母粉 0? 2 - 2. 0g，K2HP04 ? 3H20 0? 05 - 0? 15g，MgS04 ? 7H20 0? 05 - 0? 15g，葡萄糖 0? 5 - 1. 5g，pH調(diào)至 6. 0 - 8. 0。
[0036] 上述步驟⑶中，每lOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下成分：蛋白胨0.2 - 2.0g，酵 母粉 0? 2 - 2. 0g，K2HP04 ? 3H20 0? 05 - 0? 15g,MgS04 ? 7H20 0? 05 - 0? 15g，葡萄糖 0? 5 - 1. 5g，吐溫 800. 05mL，pH調(diào)至 6. 0 - 8. 0。
[0037] 可采用鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或一種以上調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā) 酵培養(yǎng)基pH。
[0038] 斜面種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的接種量可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)得到，不需付出創(chuàng)造性的勞 動(dòng)。種子培養(yǎng)基的接種量能夠達(dá)到發(fā)酵培養(yǎng)所需接種量的種子液即可，發(fā)酵培養(yǎng)基的接種 量一般在3 - 15%即可。
[0039] 上述步驟⑷中，發(fā)酵液離心的轉(zhuǎn)速為10000 - 15000rpm，離心時(shí)間為10 - 20min〇
[0040] 上述步驟（5)中，硫酸銨分級(jí)沉淀的步驟是：將上清液中加入硫酸銨，使其質(zhì)量體 積濃度為20 % - 25 %，過(guò)濾除去產(chǎn)生的沉淀，然后繼續(xù)加入硫酸銨，至其質(zhì)量體積濃度為 35% -40%為止，得到的沉淀即為透明質(zhì)酸酶。本發(fā)明中所述的質(zhì)量體積濃度的意思是：每 mL上清液中含有硫酸銨的質(zhì)量（g)。
[0041] 上述步驟（6)中，磷酸鹽緩沖液的pH優(yōu)選為6. 0,濃度優(yōu)選為50mmol/L，在實(shí)際應(yīng) 用中可酌情變動(dòng)。超濾所用的為超濾膜。超濾膜的截留分子量為3X104Da。
[0042] 本發(fā)明的再一方面涉及一種透明質(zhì)酸酶，其由上面任一項(xiàng)所述的制備透明質(zhì)酸酶 的方法制得。
[0043] 本發(fā)明芽孢桿菌生產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶在發(fā)酵液中的酶活可達(dá)到1X105- 3X10 5IU/ mL，大大高于文獻(xiàn)報(bào)道中的最高酶活（1. 3X102IU/mL)，且該酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性高，用 其降解高分子透明質(zhì)酸，用來(lái)制備寡聚或低分子透明質(zhì)酸，成本顯著降低，可用于大規(guī)模生 產(chǎn)，解決了動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶成本高的問(wèn)題，在生化研究領(lǐng)域及寡聚或低分子透明質(zhì) 酸的生產(chǎn)方面有廣闊的應(yīng)用前景。
[0044] 本發(fā)明還涉及一種分離的多肽（或蛋白），其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示；具 體地，所述多肽（或蛋白）為透明質(zhì)酸酶。
[0045] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述透明質(zhì)酸酶由本發(fā)明的芽孢桿菌制得。
[0046] 本發(fā)明還涉及一種透明質(zhì)酸酶，其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0047] -種分離的多肽（或蛋白），其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示；具體地，所述多 肽（或蛋白）為透明質(zhì)酸酶。
[0048] -種分離的多核苷酸，其編碼SEQIDN0 :2所示所示的氨基酸序列；具體地，所述 多核苷酸的序列為SEQIDN0 :3所示的序列或SEQIDN0 :3的互補(bǔ)序列。
[0049] -種重組載體，其含有本發(fā)明的多核苷酸。
[0050] -種重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的重組載體。
[0051 ] 本發(fā)明的再一方面涉及一種制備寡聚透明質(zhì)酸或寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法，包括使 用本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的透明質(zhì)酸酶或者含有本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的透明質(zhì)酸酶的發(fā)酵 液對(duì)分子量大于l〇kDa的透明質(zhì)酸或其鹽進(jìn)行降解的步驟。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明制備寡聚透明質(zhì)酸或寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法，其包含如下步驟：
[0053] 1)配制透明質(zhì)酸或其鹽溶液：向純化水中加入分子量大于10kDa的透明質(zhì)酸或其 鹽，配制成質(zhì)量體積濃度為1 一 30%的溶液；
[0054] 2)酶解：調(diào)節(jié)步驟1)中溶液的溫度為20 - 48°C、pH為4 - 9,然后向其中加入芽 孢桿菌透明質(zhì)酸酶，將透明質(zhì)酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液；
[0055] 3)滅活：將酶解液在50 - 90°C下保持10 - 60min，對(duì)芽孢桿菌透明質(zhì)酸酶進(jìn)行 滅活；
[0056] 優(yōu)選地，還包括如下步驟：
[0057] 4)過(guò)濾：向滅活后的酶解液中加入易溶性無(wú)機(jī)鹽，攪拌至完全溶解，然后用孔徑 為0. 45ym的濾膜過(guò)濾，得濾液，每100mL酶解液中加入0. 1 - 10g的易溶性無(wú)機(jī)鹽；
[0058] 5)沉淀：將步驟4)的濾液與濾液體積3 - 20倍的醇或酮混合均勻，析出寡聚透 明質(zhì)酸鹽沉淀；
[0059] 6)脫水干燥：將步驟5)中的寡聚透明質(zhì)酸鹽沉淀分離出來(lái)，用有機(jī)溶劑脫水，然 后真空干燥，得寡聚透明質(zhì)酸鹽。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明制備寡聚透明質(zhì)酸或寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法，其中，步驟1)中，每lkg 透明質(zhì)酸或其鹽加2X107- 5X10 7IU的芽孢桿菌透明質(zhì)酸酶。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的制備寡聚透明質(zhì)酸或寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法，其中，步驟2)中，酶 解溫度為35 - 45 °C，酶解pH為5. 5 - 7. 5,將透明質(zhì)酸酶解至分子量為大于或等于3000Da， 并且小于l〇4Da。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的制備寡聚透明質(zhì)酸或寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法，其滿足如下的A-F 中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)：
[0063] A.步驟1)中，透明質(zhì)酸鹽為透明質(zhì)酸的鈉鹽