質酸鹽：
[0365] 酶切寡聚透明質酸鹽：實施例13 - 18制備；
[0366] 化學法制備的寡聚透明質酸鹽：按照比較例1 一 2制備；
[0367] 酶切低分子透明質酸鹽：實施例19 一 26制備；
[0368] 化學法制備的低分子透明質酸鹽：比較例3 - 7制備；
[0369] 高分子透明質酸鈉（分子量161萬，HA-1610k):華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司生 產(chǎn)。
[0370] 1)自由基清除能力研究
[0371] 清除DPPH自由基能力的測定原理是：二苯基苦味肼自由基（DPPH)是一種穩(wěn)定 的以氮為中心的自由基，DPPH的甲醇或乙醇溶液呈紫色，在510 - 530nm波長處有最大吸 收，其濃度與吸光度呈線性關系。在有自由基清除劑存在時，自由基清除劑提供1個電子 與DPPH的孤對電子配對使其褪色，褪色程度與接收的電子呈定量關系，表現(xiàn)為溶液顏色變 淺，吸光度減小（Alisi,C.S.等?Freeradicalscavengingandin-vitroantioxidant effectsofethanolextractofthemedicinalherbChromolaenaodorataLinn. BritishJournalofPharmaceuticalResearch，2011, 1(4)，141-155.)。自由基清除劑的 能力越強，吸光度越小。分別精密量取〇?ImMDPPH(2-甲基-2, 3-二氫-5, 6-二苯基吡嗪） 乙醇溶液5.OmL和不同濃度樣品溶液5.OmL置具塞試管中，混勻。以等體積的水與95%乙 醇混合溶液為空白對照。室溫放置30分鐘，于523nm處分別測定溶液吸光度值。
[0372]
[0373] 寡聚透明質酸鹽的實驗結果如圖5B，從圖中可以看出，與化學降解法制備的寡聚 透明質酸鈉（比較例1或比較例2制備）相比，同樣濃度下酶切法制備的寡聚透明質酸鈉 (實施例13-18制備）具有更強的DPPH自由基清除能力，p<0? 05。
[0374] 低分子透明質酸鹽的實驗結果如圖5C，從圖中可以看出，不論是化學降解法制備 的低分子透明質酸鹽還是酶切法制備的低分子透明質酸鹽，隨著分子量的降低，自由基清 除能力提高。但是，分子量相近的低分子透明質酸鹽，酶切法制備的低分子透明質酸鹽的自 由基清除能力大于化學降解法制備的低分子透明質酸鹽。分子量大于1〇〇萬的透明質酸鹽 幾乎無自由基清除能力。
[0375] 2)還原能力測定
[0376] 還原能力測定原理：鐵氰化鉀在pH6. 6的弱酸性環(huán)境下，被還原性物質還原生成 黃血鹽K4Fe(CN) 6，其再與？冗13提供的三價鐵離子作用生成普魯士藍（Fe4[K4Fe(CN) 6] 3)， 其在700nm處有特定吸收，以測定普魯士藍的生成量為指標，吸光度值越大，其還原能力 越強。以透明質酸鹽水溶液為原料，測定其在此體系中生成普魯士藍的量，以此來判定還 原會泛力大?。∣yaizu，M.Antioxidantactivityofbrowingproductsofglucosamine fractionatedbyorganicsolventandthin-layerchromatography.JapaneseJournal ofNutrition, 1986, 44, 307-315)。
[0377] 分別精密量取不同濃度寡聚透明質酸鹽（實施例13 - 18制備）和低分子透明質 酸鹽（實施例19 一 26制備）溶液2. 5mL和磷酸鹽溶液2. 5mL置具塞試管中，加入2. 5mL 1. 〇%鐵氰化鉀溶液，混勻，50°C水浴20分鐘。水浴后迅速冷卻，加入2. 5mL10%三氯乙酸 溶液，3000rpm，離心10分鐘。取上清液8mL加5mL水與lmL0. 1 %三氯化鐵溶液，以等體積 的水代替三氯化鐵溶液為空白對照。室溫放置10分鐘，于700nm處測定溶液吸光度值。
[0378] 寡聚透明質酸鹽的還原能力結果如圖5D，從圖中可以看出，與化學降解法制備的 寡聚透明質酸鹽（比較例1或比較例2制備）相比，同樣濃度下酶切法制備的寡聚透明質 酸鹽具有更強的還原能力，P< 0.05。
[0379] 低分子透明質酸鹽的還原能力結果如圖5E，從圖中可以看出，不論是化學降解法 制備的低分子透明質酸鹽還是酶切法制備的低分子透明質酸鹽，隨著分子量的降低，還原 能力提高。但是，分子量相近的低分子透明質酸鹽，酶切法制備的低分子透明質酸鹽的還原 能力大于化學降解法制備的低分子透明質酸鹽。分子量大于100萬的透明質酸鹽幾乎無還 原能力。
[0380] 從上面的實驗結果可以看出，酶切法制備的寡聚透明質酸鹽（例如寡聚透明質酸 鈉）和低分子透明質酸鹽（例如低分子透明質酸鈉）比化學法降解得到的寡聚透明質酸鹽 (例如寡聚透明質酸鈉）和低分子透明質酸鹽（例如低分子透明質酸鈉）具有更強的DPPH 自由基清除能力和還原能力，因此可以有效清除人體內的自由基，減少黑色素的形成，故可 用在化妝品中，有防曬、曬后修復、美白、抗衰老的功效；還可用在保健食品及食品中，可清 除體內自由基，有抗衰老作用；也可用在藥品中，抵抗自由基對人體的侵害。
[0381]實驗例6 :S每切法制備的誘明質酸鹽在保健畬品中的功效研究
[0382] 1.酶切寡聚透明質酸鹽在保健食品中的功效研究
[0383] 以一種以寡聚透明質酸鹽為主要功效成分的保健型口服液為例，寡聚透明質酸鹽 添加量為〇. 05 - 2%?？诜号浞剑禾砑?. 5%寡聚透明質酸鹽（實施例13-18中任一實 施例制備），再添加25%食用糖或蜂蜜，用純水溶解。溶解完全后采用超濾設備除菌，灌入 10mL口服液瓶（經(jīng)高溫或紫外線臭氧消毒后）中，扎蓋密封，以上操作均在凈化車間。然后 經(jīng)產(chǎn)品質量檢驗后即得寡聚透明質酸鹽口服液。受試者年齡為30 - 65歲，分為6組，每組 30人，每人每天服用10 - 20mL寡聚透明質酸鹽口服液，連續(xù)服用一個月，使用效果如表7。 另有對照組30人，每天服用只含有食用糖或蜂蜜的溶液。
[0384] 表7 :寡聚透明質鹽口服液服用效果
[0385]
[0386]
[0387] 從表7可以看出，寡聚透明質酸鈉作為保健品可直接食用，極易吸收，具有增強免 疫力，延緩衰老，恢復皮膚光澤彈性等多種功能。本發(fā)明的寡聚透明質酸鹽分子量小，能夠 被人體腸道吸收，增加機體內組織中的透明質酸含量，補充皮膚隨年齡的增高所致的透明 質酸減少，并且口服吸收的小分子透明質酸在體內可生成高分子透明質酸，使皮膚細嫩光 滑，關節(jié)靈活，防止皺紋產(chǎn)生，可用于食品領域。
[0388] 2.酶切法制備的低分子透明質酸鹽在保健食品中的功效研究
[0389] 以一種主要功效成分為低分子透明質酸鹽的保健型口服液為例，其中低分子透明 質酸鹽添加量為〇. 05 % - 2 %?？诜号浞剑?. 0 %低分子透明質酸鹽（可以是實施例19 一 26中任一實施例制備），25%食用糖或蜂蜜。配制方法：在潔凈車間內配制，室溫下取純 水攪拌，按照比例加入低分子透明質酸鹽，再加入食用糖或蜂蜜攪拌至完全溶解，補純水至 100%。濕熱滅菌后，灌入10mL口服液瓶（經(jīng)高溫或紫外線臭氧消毒后）中，扎蓋密封，以 上操作均在潔凈車間。然后經(jīng)產(chǎn)品質量檢驗后即得低分子透明質酸鹽口服液。受試者年齡 為22 - 55歲，分為8組，每組32人，每人每天服用20mL低分子透明質酸鹽口服液，連續(xù)服 用一個月。另有對照組30人，每天服用只含有食用糖或蜂蜜的溶液。
[0390] 服用前后，由專人使用皮膚水分測定儀對受試者皮膚水分含量和水分流失量進行 測定，前后測定時測定部位和室內溫度濕度保持一致。人體皮膚水分測試結果如表8所示。
[0391] 表8 :皮膚水分含量測定結果
[0392]
[0393] 從表8可知，受試組連續(xù)服用低分子透明質酸鹽口服液1個月后，皮膚水分含量比 服用前明顯提高，水分流失量情況也明顯改善。觀察可知，受試組人員的皮膚光澤度、緊致 性、彈性均較對照組要好。因此，口服低分子透明質酸鹽易于吸收，保水補水效果好，而且能 夠活化皮膚細胞，具有抗衰老的功效。
[0394] 因此，口服寡聚透明質酸鹽及低分子透明質酸鹽后，均可使受試者皮膚光澤度、彈 性等得到改善，可用于保健食品及普通食品中。
[0395] 實驗例7 :S每切法制備的寡聚誘明質酸鹽促血管牛成作用研究
[0396] 以人臍靜脈內皮細胞（HUVEC，山東省醫(yī)學科學院提供）培養(yǎng)實驗和雞胚絨毛尿囊 (CAM)模型實驗（種蛋購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所）來研究酶切法制備的寡聚透明 質酸鹽（實施例13 - 18中任一實施例制備）是否能夠促進血管生成。HUVEC增殖效果和 CAM血管生成結果見表9。實驗步驟可以參考，例如王彥厚，王鳳山，郭學平.低相對分子量 質量透明質酸的制備及其促血管生成作用.中國生化藥物雜志，2007, 28 (2) : 107-109。
[0397] 表9 :寡聚透明質酸鈉促血管生成結果
[0398]
[0400] 由實驗結果可知，寡聚透明質酸鈉具有明顯的促血管生成活性，在體內能促進CAM 的血管生成，在體外能促進HUVEC細胞增殖，可用于創(chuàng)傷愈合等醫(yī)藥領域。
[0401] 實驗例8 :誘明質酸鹽的防曬及曬后修復作用研究
[0402] 日光中的紫外線（主要為UVA和UVB)是導致皮膚日曬傷、光老化及皮膚癌的重要 因素。皮膚主體的三大細胞：角質形成細胞、成纖維細胞及黑素細胞均對紫外線敏感。UVA 損傷主要是引起皮膚成纖維細胞DNA的氧化性損傷，可導致DNA突變及皮膚癌的發(fā)生。本 實驗以一定劑量的UVA照射小鼠成纖維細胞L929 (購買自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員 會細胞庫），然后以透明質酸鹽處理細胞，研究透明質酸鹽的降解方法及不同分子量透明質 酸鹽對L929細胞UVA輻照后的影響；以透明質酸鹽作用于小鼠成纖維細胞株L929,然后以 一定劑量的UVA照射細胞，研究透明質酸鹽的降解方法及不同分子量透明質酸鹽對L929細 胞UVA輻照的防護作用。
[0403] 所用試劑和細胞株：
[0404] 纖維細胞株L929 :購買自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；
[0405] 不同分子量的透明質酸鹽：
[0406] 酶切寡聚透明質酸鈉：實施例13-18制備；
[0407] 化學法制備的寡聚透明質酸鈉：按照比較例1 一 2制備；
[0408] 酶切低分子透明質酸鈉：實施例19 一 26制備；
[0409] 化學法制備的低分子透明質酸鹽：比較例3-7制備；
[0410] 高分子透明質酸鈉（分子量161萬，HA-1610k):華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司生 產(chǎn)。
[0411] 1.透明質酸鹽的紫外修復作用研究
[0412] 探討不同制備方法以及不同分子量的透明質酸鹽對L929小鼠成纖維細胞經(jīng)UVA 照射后的修復作用。
[0413] 取處于對數(shù)生長期的L929細胞，胰酶消化后，調細胞密度2X104/mL，接種于96孔 細胞培養(yǎng)板，每孔100yL細胞懸液，置二氧化碳培養(yǎng)箱37°C、5 % 0)2常規(guī)培養(yǎng)過夜。96孔板 中棄去培養(yǎng)液，每孔加入100yLPBS。除陰性對照組不進行照射外，其余試驗組采用7. 2J/ cm2UVA照射L929細胞。照射后棄去PBS，按下面操作處理細胞：
[0414]未照射組（陰性對照組）：加入100yL完全培養(yǎng)基；
[0415] 照射組（陽性對照組）：加入100yL完全培養(yǎng)基；
[0416] 照射+透明質酸鹽：加入含0. 0625%透明質酸鹽的100yL完全培養(yǎng)基；
[0417] 繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入20yLMTT，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。棄去培養(yǎng) 液，每孔加入150yLDMS0,避光震蕩lOmin，于570nm波長處用酶標儀測定光吸收值。按照 以下公式計算細胞相對增殖率（RGR):
[0418]
[0419] 式中A。表示實驗組的吸收值，A&。表示陰性對照組的吸收值。
[0420] 結果如圖6A、圖6B所示，不同方法制備的寡聚透明質酸鹽及不同分子量的透明質 酸鹽都具有UVA輻照后修復細胞損傷的作用，但是酶切法制備的寡聚透明質酸鹽的曬后修 復作用最好，化學法制備的寡聚透明質酸鹽的效果次之，并且隨著透明質酸鹽分子量的降 低，其修復效果越好。酶切法制備的寡聚透明質酸鹽及低分子透明質酸鹽的曬后修復效果 要好于高分子量透明質酸鹽。
[0421] 2?透明質酸鹽的防紫外作用研究
[0422]探討不同制備方法制備的寡聚透明質酸鹽及不同分子量的透明質酸鹽對L929小 鼠成纖維細胞對UVA照射的防護作用。
[0423] 本實驗以不同分子量透明質酸鹽作用于小鼠成纖維細胞株L929,然后以一定劑 量的UVA照射細胞，研究不同分子量透明質酸鹽和不同制備方法制備的寡聚透明質酸鹽對 L929細胞UVA輻照的防護作用。
[0424] 取處于對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后，調細胞密度2X104/mL，接種于96孔細胞 培養(yǎng)板，每孔1〇〇yL細胞懸液，置二氧化碳培養(yǎng)箱37°C、5%C02常規(guī)培養(yǎng)過夜。過夜后棄 去培養(yǎng)液，按下面分組處理細胞，放入細胞培養(yǎng)箱中孵育12h。
[0425] 未照射組（陰性對照組）：加入100yL完全培養(yǎng)基；
[0426] 照射組（陽性對照組）：加入100yL完全培養(yǎng)基；
[0427] 照射+透明質酸鹽：加入含0. 0625%透明質酸鹽的100yL完全培養(yǎng)基；
[0428] 96孔板中棄去培養(yǎng)液，每孔加入100iiLPBS。除無照射組外，其余試驗組采用 7. 2J/cm2UVA照射L929細胞。照射后棄去PBS，每孔加入20yLMTT，放入細胞培養(yǎng)箱中繼 續(xù)孵育4h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入150yLDMS0,避光震蕩lOmin，于570nm波長處用酶標儀 測定光吸收值。按照以下公式計算細胞相對增殖率（RGR):
[0429]
[0430] 式中A。表示實驗組的吸收值，A&。表示陰性對照組的吸收值。
[0431] 結果如圖6C、圖6D所示，不同制備方法制備的寡聚透質酸鹽及不同分子量的透明 質酸鹽都具有防UVA輻照的作用。酶切法制備的寡聚透明質酸鹽對UVA輻照的預防效果最 好，其次是酶切低分子透明質酸鹽，化學法制備的寡聚透明質酸鹽及高分子量透明質酸鹽 的預防效果最差。
[0432] 綜上所述，酶切法制備的寡聚透明質酸鹽及低分子透明質酸鹽都具有紫外修復及 防紫外作用，其中酶切法制備的寡聚透明質酸鹽的紫外修復及防紫外效果最好；低分子透 明質酸鹽的防紫外效果較好，紫外修復效果不如化學法制備的寡聚透明質酸鹽，但均高于 高分子量透明質酸鹽。因此酶切法制備的寡聚透明質酸鹽及低分子透明質酸鹽可用于防曬 及曬后修復的化妝品中。
[0433] 綜上可見，根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法得到的寡聚透明質酸鹽及低分子透明質酸 鹽，外用時可滲入皮膚表皮層，供給皮膚營養(yǎng)和水分，防止皮膚老化，還能防止紫外線的傷 害，修復曬傷的皮膚細胞，可用于化妝品中；口服時易于吸收，不僅可以活化皮膚細胞，保持 表皮濕潤，同時具有良好的增強免疫功能和抗衰老功能，可用于食品和保健品中；另外，還 具有促血管生成、細胞免疫活化和促進骨生成的作用，對治療細菌性角膜潰瘍具也有良好 的療效，可用于醫(yī)藥領域。
[0434] 盡管本發(fā)明的【具體實施方式】已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護范圍之內。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
【主權項】
1. 寡聚透明質酸或者寡聚透明質酸鹽在制備促血管生成和/或促進創(chuàng)傷愈合或抗氧 化或防曬或曬后修復或清除自由基或促進HUVEC細胞增殖或抗腫瘤或提高免疫力的藥物 或者在制備食品或保健品或化妝品中的用途；其中，所述寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽 由SEQ ID NO :2所編碼的透明質酸酶制得或者所述寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽N-乙 酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量蘭65 %、蘭70 %、蘭75 %、蘭80 %、蘭85 %、蘭90 % 或蘭95% (w/w)。2. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中，所述化妝品為防曬、曬后修復、抗衰老或保濕的 化妝品。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的用途，其中，所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的 含量通過HPLC法測得。4. 根據(jù)權利要求1或2所述的用途，其中，所述寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽的其分 子量為大于或等于3000Da，并且小于10 4Da。5. -種組合物，其包含寡聚透明質酸或者寡聚透明質酸鹽；其中，所述寡聚透明質酸 或寡聚透明質酸鹽由SEQ ID NO :2所編碼的透明質酸酶制得或者所述寡聚透明質酸或寡聚 透明質酸鹽N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量蘭65%、蘭70%、蘭75%、蘭80%、 蘭 85%、蘭 90%或蘭 95% (w/w)。6. 根據(jù)權利要求5所述的組合物，其還包含藥學上或食品學上可接受的載體或輔料。7. 根據(jù)權利要求5或6所述的組合物，其中，所述組合物為化妝品。8. 根據(jù)權利要求7所述的組合物，其中，所述化妝品為防曬、曬后修復、抗衰老、或保濕 的化妝品。9. 根據(jù)權利要求5或6所述的藥物組合物，其中，所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸 雙糖的含量通過HPLC法測得。10. 根據(jù)權利要求5或6所述的組合物，其中，所述寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽的 其分子量為大于或等于3000Da，并且小于10 4Da。
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶學和藥物化學領域，涉及聚透明質酸或者寡聚透明質酸鹽的用途及其組合物。具體地，本發(fā)明涉及一種。本發(fā)明制備的寡聚透明質酸鹽或低分子透明質酸鹽具有結構完整、透皮吸收性好、純度高、無細胞毒性、抗氧化能力強、顏色無褐變等優(yōu)點，還具有防曬及曬后修復的作用，可用在化妝品、食品及醫(yī)藥領域。CGMCC No.574420120208
【IPC分類】A61Q19/00, A61P35/00, A61K8/60, A61Q17/04, A61P39/06, A61P37/04, A61P17/02, A61K31/728, A61P9/00, A61Q19/08
【公開號】CN105055440
【申請?zhí)枴緾N201510427147
【發(fā)明人】郭學平, 石艷麗, 李海娜, 王冠鳳, 薛蔚, 喬莉蘋, 馮寧, 張曉鷗, 劉愛華
【申請人】華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2012年11月29日
【公告號】CN103255076A, CN103255076B, CN103255187A, CN103255187B, EP2818543A1, EP2818543A4, US20150175991, WO2013123791A1