一種轉(zhuǎn)基因茄子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因茄子的制備方法，包括種子消毒、載體構(gòu)建、預(yù)培養(yǎng)、浸染、分化和生根培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)基中包括IAA，ZT，Kan和Cef。本發(fā)明所述制備方法可以把各種優(yōu)良農(nóng)藝性狀的調(diào)控基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到茄子中，從而可以快速提高茄子品質(zhì)，加快育種進(jìn)程。通過(guò)轉(zhuǎn)基因工程，可以產(chǎn)生積累外源蛋白。轉(zhuǎn)基因茄子的制備方法不僅是品種改良的有效方法，還可以作為生物工廠，應(yīng)用到代謝工程上。
【專利說(shuō)明】一種轉(zhuǎn)基因前子的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物的制備的方法，特別涉及轉(zhuǎn)基因茄子的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]爺子(Solanum melongena L., 2n = 24)起源于古印度,在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植，是我國(guó)的重要果菜之一。茄子極易受黃萎病、青枯病、枯萎病、綿疫病等多種病害以及線蟲(chóng)和各種昆蟲(chóng)的侵害，盡管有少數(shù)野生種質(zhì)資源為抗病材料，但是它們所擁有的天然抗性不足以完全抵抗病蟲(chóng)害，而且不能在育種過(guò)程中被充分利用。在傳統(tǒng)茄子育種中，由于連鎖的毒害基因存在，導(dǎo)致育性不兼容，若想得到可育的后代，需要花費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間(Pratap etal.，2011)。分子生物學(xué)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展，可將克隆的重要農(nóng)藝性狀及抗病調(diào)控基因被基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人茄子優(yōu)良品種中，因此可快速改良品種，提高抗病性，加速育種進(jìn)程(Mariashibu et al.，2012)。如 Rotino 等(Rotino et al.，1997)米用基因工程手段，在茄子子房中特異表達(dá)生長(zhǎng)素合成基因，使生長(zhǎng)素含量大大增加，導(dǎo)致子房未經(jīng)受精而直接膨大發(fā)育成果實(shí)，獲得了單性結(jié)實(shí)品種，并在番茄、草莓、懸鉤子、葡萄等蔬菜水果上利用同樣的轉(zhuǎn)基因工程，均得到單性結(jié)實(shí)品種(Rotino et al., 1997, 2005; Ficcadenti etal.,1999;Mezzetti et al.，2004)。
[0003]到目前為止，關(guān)于茄子轉(zhuǎn)基因的研究進(jìn)展，已在多個(gè)文獻(xiàn)中被公布。如以根為外植體，含 0.lmg/L TDZ,3mg/L6-BA, 100mg/L Kan 和 500mg/L Cef 的 MS 固體培養(yǎng)基上，4 周后可通過(guò)愈傷組織獲得不定芽(Franklin et al.，2003)。以無(wú)菌苗子葉為外植體，在含2.5mg/L6-BA,0.5mg/L IAA, 100mg/L Kan和500mg/LCef的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行再生培養(yǎng)，能獲得再生苗(Prabhavathi and Yadav, 2002)。Arpaia等以子葉為外植體,再生培養(yǎng)基選擇0.5mgl/L ZEA, 0.3mgl/L6-BA, 0.2mgl/L KIN和 0.lmgl/L NAA(Arpaia et al.，1997)。張興國(guó)等以下胚軸為外植體，確定lmg/L`的ZT和l-3mg/L的BA組合時(shí)均獲得70%以上的芽再生率，150mg/L的Kan濃度為最適選擇壓(張興國(guó)等2001)。Singh(2010)等以莖為外植體，攜帶有aadA基因的pPRVlllA載體通過(guò)基因槍哄擊,成功獲得轉(zhuǎn)基因爺子。Subramanyam等用茄子種子為外植體，在3mg/L的MS液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)18h后，含有IOOyM乙酰丁香酮，
0.2%Si lwett L-77的MS液體農(nóng)桿菌懸浮液侵染20 min后，通過(guò)500mm Hg真空導(dǎo)入，在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因苗(Kondeti Subramanyam et al.，2013)。通常一般載體利用Kan作為抗性基因，Khan等利用pMAT21載體，構(gòu)建無(wú)抗性基因的載體，以子葉為外植體，通過(guò)MS培養(yǎng)基，獲得轉(zhuǎn)基因苗。
[0004]雖然這些體系都能獲得轉(zhuǎn)基因苗，但是材料基因型非常重要，不同基因型材料的再生能力差異很大，也影響再生的途徑(金丹丹等2004)。因此盡管已有這么多成功案例被公布，但是以浙江省大面積種植的紫紅線茄基因型運(yùn)用這些轉(zhuǎn)基因體系時(shí)，不管是根、莖、帶柄子葉還是葉片，作為外植體都不能獲得轉(zhuǎn)基因植株。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，茄子轉(zhuǎn)基因研究是非常重要的，如果能充分利用高效的轉(zhuǎn)基因體系，可以將一些重要而優(yōu)良的農(nóng)藝性狀調(diào)控基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到茄子中，從而可以快速改良品種。因此結(jié)合本地育種目標(biāo)，創(chuàng)建適合本地育種品種的轉(zhuǎn)基因體系非常重要，可以大大提升本省人民喜歡的茄子品種的品質(zhì)提升。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種新的最有效最適宜紫紅線茄的轉(zhuǎn)基因方法，包括種子消毒、載體構(gòu)建、預(yù)培養(yǎng)、浸染、分化和生根培養(yǎng)，其特征在于，預(yù)培養(yǎng)基中包括吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,簡(jiǎn)稱IAA)和玉米素(Zeatin,簡(jiǎn)稱ZT),選擇培養(yǎng)基中包括IAA, ZT,卡那霉素(Kanamycin,簡(jiǎn)稱Kan)和頭孢氨節(jié)(Cefotaxime,簡(jiǎn)稱Cef)。
[0006]進(jìn)一步地，IAA濃度選自 0.3-0.8mg/L，ZT 濃度為 2mg/L，Kan 濃度為 25mg/L，Cef為 500mg/L。
[0007]進(jìn)一步地，IAA濃度為0.5mg/L, ZT濃度為2mg/L, Kan濃度為25mg/L, Cef濃度為500mg/L。
[0008]進(jìn)一步地，種子消毒方法包括:種子經(jīng)75%乙醇處理30s，10%NaC10表面消毒15min，無(wú)菌水洗漆4~5次。
[0009]進(jìn)一步地，種子消毒后在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述固體培養(yǎng)基中添加較低濃度的 Cef。
[0010]進(jìn)一步地，M S固體培養(yǎng)基包括3%蔗糖和200mg/LCef。
[0011]進(jìn)一步地，載體的構(gòu)建方法包括:引物序列為SmARF8-1NT-F和SmARF8_INT-R，PCR克隆后獲得294bp片段，PCR產(chǎn)物位于SmARF8基因1609bp_1902bp區(qū)段；2個(gè)PCR片段分別以3’-5’和5’-3’方向構(gòu)建到PBS-1n載體玉米NIRl基因第二個(gè)內(nèi)含子片段兩端后，用Sac I和Pst I進(jìn)行雙酶切，獲得含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及2個(gè)PCR片段的片段AjfPCAMBIA1300進(jìn)行改造，CaMV35S啟動(dòng)子亞克隆到pCAMBIA1300載體的EcoRI和SacI酶切位點(diǎn)之間，豌豆RubiscoE9基因的poly (A)序列插入到HindIII和PstI酶切位點(diǎn)之間，成功獲得PCAMBIAI35S-1300載體。酶切后的片段A，用T4DNA連接酶構(gòu)建到PCAMBIAI35S-1300載體上；將含有35S啟動(dòng)子、片段A和poly㈧終止子的載體經(jīng)EcoR I和Hind III酶切后，構(gòu)建到PCAMBIAI35S-2300載體上，成為含有NPT II抗性基因的復(fù)合表達(dá)載體PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT。
[0012]進(jìn)一步地，預(yù)培養(yǎng)的方法包括:超凈臺(tái)下將無(wú)菌苗的外植體，接種到預(yù)培養(yǎng)基上；25°C,16h光照/8h黑暗的條件下生長(zhǎng)2天。
[0013]進(jìn)一步地，分化培養(yǎng)的方法包括:農(nóng)桿菌侵染后的外植體，在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，直到未經(jīng)愈傷分化而直接長(zhǎng)出不定芽，從外植體上切下不定芽后繼續(xù)在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)獲得健壯分化苗。
[0014]進(jìn)一步地，選用莖作為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:(I)由于茄子種子較大，10%NaC10表面消毒15min，并在MS發(fā)芽培養(yǎng)基中添加較低濃度的Cef，可抑制污染，獲得無(wú)菌苗。(2)將2個(gè)SmARF8基因294bp的PCR擴(kuò)增片段分別以相反方向構(gòu)建到含有玉米NIRl基因第二個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)兩端，然后被轉(zhuǎn)導(dǎo)到植物體內(nèi)時(shí)，能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到干涉內(nèi)源基因SmARFS，使它們不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)的目的。(3)無(wú)菌苗的莖外植體在含0.5mg/L IAA濃度，2mg/L ZT激素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，莖能未經(jīng)愈傷分化，而直接長(zhǎng)出不定芽，出芽效率達(dá)到80%。并經(jīng)RT-PCR，qRT-PCR和Sourthen blot分析驗(yàn)證,轉(zhuǎn)基因效果良好,成功獲得爺子轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因茄子的制備方法，可以把各種優(yōu)良農(nóng)藝性狀的調(diào)控基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到茄子中，從而可以快速提高茄子品質(zhì)，加快育種進(jìn)程。通過(guò)轉(zhuǎn)基因工程，可以產(chǎn)生積累外源蛋白，轉(zhuǎn)基因茄子的制備方法不僅是品種改良的有效方法，還可以作為生物工廠，應(yīng)用到代謝工程上。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1:PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT載體構(gòu)建過(guò)程框架圖。A:含有玉米NIRl基因第二個(gè)內(nèi)含子的PBS-1n載體，SmARF8基因的294bp PCR片段分別以相反方向構(gòu)建到內(nèi)含子區(qū)域兩端，然后用Sac I和Pst I進(jìn)行酶切，被命名為片段A。B:PCAMBIAI35S-1300-SmARF8-1NT載體T-DNA區(qū)域。片段A被構(gòu)建到載體上，受35S啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。C:PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT載體T-DNA區(qū)域。含有35S啟動(dòng)子和終止子的區(qū)域經(jīng)EcoR I和Hind III酶切后，重組構(gòu)建到PCAMBIAI35S-2300載體上。35S啟動(dòng)子啟動(dòng)NPT II基因和片段A的表達(dá)?；蜣D(zhuǎn)錄表達(dá)方向用箭頭表示，酶切位點(diǎn)用直線表示。
[0017]圖2:含有PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT載體的轉(zhuǎn)基因茄子發(fā)育過(guò)程。A、B:Kan抗性分化苗在 0.5mgl/L IAA, 2mgl/L ZT, 25mgl/L Kan 和 500mgl/LCef 的 MS 選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)與發(fā)育21d和28d ；C:子葉外植體在同樣培養(yǎng)基上沒(méi)有出現(xiàn)分化苗；D:分化苗在選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)伸長(zhǎng)；E:分化苗在MS培養(yǎng)基上生根；F:生根后轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)移到塑料缽中生長(zhǎng)；G植株在溫室中生長(zhǎng)結(jié)果。
[0018]圖3:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸蚉CAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT融合載體導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因植株(TO)的 RT-PCR，qRT-PCR 和 Sourthern blot 驗(yàn)證分析。A、B:RT_PCR 和 qRT-PCR 分析鑒定SmARF8基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。M:DNA marker。1:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍?_6:轉(zhuǎn)基因植株cDNA被擴(kuò)增。C =RT-PCR驗(yàn)證過(guò)的轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot雜交分析。1-2:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏?-7:轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。這些具體的實(shí)施例僅僅是在不違背本發(fā)明精神下的有限列舉，并不排除本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員把現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明結(jié)合而產(chǎn)生的其他具體的實(shí)施方案。
[0020]實(shí)施例1種子消毒及無(wú)菌苗的制備
[0021]材料:紫紅線茄E666、E25、E22 和 E673。
[0022]本發(fā)明所述 的消毒方法對(duì)紫紅線茄消毒，所述消毒方法包括:精選的紫紅線茄種子經(jīng)75%乙醇處理30s，10%NaC10表面消毒15min，無(wú)菌水洗滌4~5次，接種到含3%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上(200mg/LCef )，并以不加抗生素為對(duì)照。每瓶放置20粒種子，3次重復(fù)。在25°C ±1°C，黑暗中培養(yǎng)一個(gè)星期后，光照強(qiáng)度為50μπιΟ1.m-2.s_2，每天光照16h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)21d，培育出無(wú)菌小苗。
[0023]采用現(xiàn)有技術(shù)的消毒方法對(duì)紫紅線茄種子消毒，所述消毒方法為:精選的種子經(jīng)75%乙醇處理30s, 0.l%HgCl消毒Imin和0.l%HgCl消毒2min兩種消毒方式分別處理，無(wú)菌水洗滌4~5次，接種到含3%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上(200mg/LCef)，不加抗生素為對(duì)照。每瓶放置20粒種子，3次重復(fù)。在25°C ±1°C，黑暗中培養(yǎng)一個(gè)星期后，光照強(qiáng)度為50 μ mo I.π2.s'每天光照16h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)21d,培育出無(wú)菌小苗。
[0024]比較上述三種方法的消毒效果。采用現(xiàn)有技術(shù)中的0.l%HgCl消毒Imin和
0.l%HgCl消毒2min處理過(guò)的種子，播種在不含Cef抗生素的MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)芽后，消毒2min的種子不會(huì)污染，但是發(fā)芽率只有10% ;而消毒Imin的種子污染率為50%，發(fā)芽率也只有50%。因此這種HgCl消毒方式不適合茄子無(wú)菌苗的獲得。采用本發(fā)明所述的消毒方法，10%NaC10消毒15min處理過(guò)的種子，播種在不含Cef抗生素的MS固體培養(yǎng)基上時(shí)，污染率為30%，但是發(fā)芽率達(dá)到80-90%。MS固體培養(yǎng)基中加入200mg/LCef，就不會(huì)發(fā)生污染事件，發(fā)芽率也沒(méi)有受影響。因此本發(fā)明所述的10%NaC10消毒15min的種子消毒方法，以及將消毒后的種子播種在含200mg/LCef的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，非常適合制備茄子的無(wú)菌苗，且發(fā)芽率高，效果明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的方法。
[0025]實(shí)施例2載體構(gòu)建
[0026]根據(jù)茄子生長(zhǎng)素響應(yīng)因子SmARF8基因(FJ597628) cDNA序列設(shè)計(jì)引物SmARF8-1NT-F 和 SmARF8_INT-R (表 1)，PCR 克隆獲得 294bp 片段，PCR 產(chǎn)物位于 SmARF8 基因 1609bp-1902bp 區(qū)段。
[0027]表1引物序列
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因爺子的制備方法，包括種子消毒、載體構(gòu)建、預(yù)培養(yǎng)、浸染、分化和生根培養(yǎng)，其特征在于，預(yù)培養(yǎng)基中包括吲哚乙酸和玉米素，選擇培養(yǎng)基中包括吲哚乙酸，玉米素，卡那霉素和頭孢氨芐。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，吲哚乙酸濃度選自0.3-0.8mg/L，玉米素濃度為2 mg/L,卡那霉素濃度為25 mg/L,頭孢氨節(jié)濃度為500 mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，吲哚乙酸濃度為0.5mg/L，玉米素濃度為2 mg/L,卡那霉素濃度為25 mg/L,頭孢氨節(jié)濃度為500 mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，種子消毒方法包括:種子經(jīng)75%乙醇處理30s，10 % NaClO表面消毒15 min，無(wú)菌水洗滌4~5次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，種子消毒后在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述固體培養(yǎng)基中添加較低濃度的頭孢氨芐。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，MS固體培養(yǎng)基包括3%蔗糖和200mg/L頭孢氨節(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，載體的構(gòu)建方法包括:引物序列為SmARF8-1m-￥和^k^P/^-1NT-R，PCR克隆后獲得294 bp片段，PCR產(chǎn)物位于SmARF8基因1609bp-1902bp區(qū)段；2個(gè)PCR片段分別以3’-5’和5’-3’方向構(gòu)建到PBS_in載體玉米Λ?7基因第二個(gè)內(nèi)含子片段兩端后，用fee /和/進(jìn)行雙酶切，獲得含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及2個(gè)PCR片段的片段A ;將pCAMBIA1300進(jìn)行改造，CaMV 35S啟動(dòng)子亞克隆到pCAMBIA1300載體的及?01?1和SacI酶切位點(diǎn)之間，豌豆沿/Ai1Sco烈基因的poly (A)序列插入到/--(6/111和AiI酶切位點(diǎn)之間，成功獲得PCAMBIAI 35S-1300載體；酶切后的片段A，用T4 DNA連接酶構(gòu)建到PCAMBIAI 35S-1300載體上；將含有35S啟動(dòng)子、片段A和poly (A)終止子的載體備EcoR /和歷fli////酶切后，構(gòu)建到PCAMBIAI 35s_2300載體上，成為含有MT JJ抗性基因的復(fù)合表達(dá)載體 PCAMBIA I 355-2300-5^7^^-1^。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，預(yù)培養(yǎng)的方法包括:超凈臺(tái)下將無(wú)菌苗的外植體，接種到預(yù)培養(yǎng)基上；25 °C, 16 h光照/8 h黑暗的條件下生長(zhǎng)2天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，分化培養(yǎng)的方法包括:農(nóng)桿菌侵染后的外植體，在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，直到未經(jīng)愈傷而直接長(zhǎng)出不定芽，從外植體上切下不定芽后繼續(xù)在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)獲得健壯分化苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求8和9之一所述的制備方法，其特征在于，選用莖作為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103805632SQ201410041131
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】包崇來(lái), 杜黎明, 毛偉海, 胡天華, 朱琴妹, 胡海嬌, 何群燕 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院