基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，涉及MicroRNA。試劑盒設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶。提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，則在樣本充分裂解后加入試劑盒提供的濃度為5n?mol的外源性參照cel-miR-395μL，漩渦震蕩；若為細(xì)胞或組織樣本，則無(wú)需加入外源性參照cel-miR-39；采用試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA；采用試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增；綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值和基線，進(jìn)行結(jié)果分析。
【專利說(shuō)明】基于AIIG10探針熒光定量PCR的hsa-m i R-363檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及MicroRNA，尤其是涉及一種基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，參與了在生物體中許多生理病理過(guò)程，通過(guò)調(diào)芐基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，具體表現(xiàn)為miRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過(guò)形成最初的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pr1-miRNA到pre_miRNA,后轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核,通過(guò)剪切形成成熟miRNA,通過(guò)與Ago蛋白等形成RISC (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)，部分抑制或降解靶mRNA序列，參與基因表達(dá)調(diào)控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004，116(2):281-297)。
[0003]由于miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后判斷以及許多其他疾病狀態(tài)下扮演著重要角色，精確檢測(cè)其表達(dá)情況對(duì)于研究miRNA的作用具有重大意義。目前，檢測(cè)miRNA的方法主要有northern blot技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)等。其中，northern blot技術(shù)是RNA檢測(cè)的早期手段之一，但其特異性和敏感性低，如果樣本RNA含量低或存在降解，可能檢測(cè)不到；原位雜交技術(shù)用于檢測(cè)組織和細(xì)胞水平miRNA的分布情況，同時(shí)對(duì)miRNA進(jìn)行半定量檢測(cè)，其不足地方在于不能準(zhǔn)確檢測(cè)到低表達(dá)的miRNA ；微陣列芯片技術(shù)是一種高通量的檢測(cè)技術(shù)，能同時(shí)檢測(cè)一種或多種樣本的大量的miRNA，但存在芯片制作費(fèi)時(shí)，費(fèi)力和標(biāo)記成本高，檢測(cè)靈敏度和特異性低等問(wèn)題。
[0004]實(shí)時(shí)熒光定量`技術(shù)(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表達(dá)檢測(cè)的技術(shù)之一，具有簡(jiǎn)便快速、敏感性高和特異性好等特點(diǎn)。目前，用于檢測(cè)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法包括miRNA逆轉(zhuǎn)錄和下游的熒光定量PCR兩部分，其中逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物的不同分為兩種:同聚物加尾法和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法；熒光定量PCR的檢測(cè)分為染料法和探針?lè)?，其中目前檢測(cè)miRNA的探針多為Taqman-MGB探針(一種適合于擴(kuò)增短片段的突光探針)，由于成熟的miRNA具有片段短小的特點(diǎn)，要特異的檢測(cè)，探針?lè)ǜ袃?yōu)勢(shì)，在敏感性和特異性上優(yōu)于染料法?；谇o環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物能特異識(shí)別，擴(kuò)增成熟的miRNA序列，而miRNA的前體并未被擴(kuò)增，Taqman-MGB探針檢測(cè)miRNA缺點(diǎn)在于合成價(jià)格貴,不利于推廣。
[0005]目前，AllGl0探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測(cè)皰疹病毒、乙型肝炎病毒基因突變(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu，Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵襲性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010，49 (2): 142-145)、K-ras基因突變、強(qiáng)直性脊柱炎等檢測(cè)。[0006]有研究報(bào)道表明在腫瘤研究方面，hsa-miR-363在神經(jīng)性腫瘤的發(fā)生與腫瘤轉(zhuǎn)移方面有重要作用(Qiao J, Lee S，Paul P, Theiss L, Tiao J, Qiao L, et al.miR_335andmiR-363regulation of neuroblastoma tumorigenesis and metastasis[J].Surgery, 2013，154(2):226-33),在頭頸部腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方研究面hsa-miR-363也起著不可忽視的作用(Sun Q, Zhang J, Cao W，Wang X, Xu Q, Yan M, et al.DysregulatedmiR-363affects head and neck cancer invasion and metastasis by targetingpodoplanin[J], Int J Biochem Cell Biol, 2013，45 (3): 513-20)。目前對(duì) hsa-miR-363 在生物及其他領(lǐng)域的功能越來(lái)越得到重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)miRNA方法中使用的試劑盒和檢測(cè)方法存在的上述缺陷，提供基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒。
[0008]本發(fā)明的目的之二在于提供基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363的檢測(cè)方法。
[0009]所述hsa-miR-363為一種人源性miRNA，其核苷酸序列為:SEQ ID N0.15 ; -AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA-3 ;。
[0010]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，外源性參照瓶?jī)?nèi)裝有外源性參照，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶?jī)?nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶?jī)?nèi)裝有實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑。
[0011]所述外源性參照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作濃度可為 5nmol。
[0012]所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT 緩沖液(所述 5XRT 緩沖液由 250m mol Tris-HCl,375m mol KClU5m molMgCl2,50m mol DTT 組成)、40 單位 / μ L 的 RNA 酶抑制劑、IOm mol 的 MgCl2'I μ mol 的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品(這里的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品是指人工合成的miRNA，濃度為IOOnmol)。
[0013]所述miRNA的特異逆轉(zhuǎn)錄引物由hsa-miR-363的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成:
[0014]所述hsa-miR-363的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTACAGATG-3 ;；
[0015]所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.45 1-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;；
[0016]所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ IDN0.55 ; -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;。
[0017]所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液(IOXTaq緩沖液包括 IOOmmol Tris-HCl, 500m mol KCl)> IOm mol 的 MgCl2、5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmmoldNTP混合液、IOOmL無(wú)核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。
[0018]所述特異正向引物由hsa-miR-363的特異引物、外源性參照cel-miR-39的特異引物和內(nèi)源性參照U6的特異引物組成:
[0019]所述hsa-miR-363的特異引物的核苷酸序列為:
[0020]SEQ ID N0.65 ; -GCCGAATTGCACGGTAT-3 ;；
[0021]所述外源性參照cel-miR-39的特異引物的核苷酸序列為:
[0022]SEQ ID N0.75 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;；
[0023]所述內(nèi)源性參照U6的特異引物的核苷酸序列為:
[0024]SEQ ID N0.85 ; -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ;。
[0025]所述通用反向引物的核苷酸序列為:
[0026]SEQ ID N0.95 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
[0027]所述AllGlo探針由hsa-miR-363的特異探針、內(nèi)源性參照U6的特異探針和外源性參照cel-miR-39的特異探針組成；
[0028]所述hsa-miR-363的特異探針的核苷酸序列為:
[0029]SEQ ID N0.1OMAR-CACTGGATACGACTACAGATGGA-MAR ；
`[0030]所述內(nèi)源性參照U6的特異探針的核苷酸序列為:
[0031]SEQ ID N0.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP ;
[0032]所述外源性參照cel-miR-39的特異探針的核苷酸序列為:
[0033]SEQ ID N0.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
[0034]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsaniR-363的檢測(cè)方法，其步驟如下:
[0035]I)采用常規(guī)方法提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，則在樣本充分裂解后加入所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒提供的濃度為5n mol的外源性參照cel-miR-395 μ L，立即進(jìn)行漩渦震蕩15s ;若為細(xì)胞或組織樣本，則無(wú)需加入外源性參照cel-miR-39 ；
[0036]2)采用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA ；
[0037]3)采用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增；
[0038]4)綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline),進(jìn)行結(jié)果分析。
[0039]所述AllGlo 探針可米用美國(guó) AlleLogic Biosciences Corporation 公司的突光定量探針，它擁有普通Taqman, Taqman-MGB及分子信標(biāo)(molecular beacon)探針?biāo)袃?yōu)點(diǎn)，克服了目前這幾種探針的最大弊端，它打破了傳統(tǒng)Taqman —端報(bào)告基團(tuán)一端淬滅基團(tuán)的限制，利用了美國(guó)AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見(jiàn)波長(zhǎng)的特制熒光染料，標(biāo)記在寡核苷酸上面互為報(bào)告基團(tuán)和粹滅基團(tuán)，而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火溫度)的化學(xué)基團(tuán)，提高探針特異性，雜交特異性大大提高，在雜交水解之后兩端標(biāo)記的染料又全部變?yōu)閳?bào)告基團(tuán)，提高熒光增量。
[0040]所述AllGl0探針具有以下優(yōu)勢(shì):①提高Tm值(可達(dá)10°C以上)，探針更短可以達(dá)到15~16個(gè)堿基，可以適用A，T含量比較高的序列設(shè)計(jì)探針；②加大了多重?zé)晒舛康倪x擇，因?yàn)槊糠N染料即是報(bào)告基團(tuán)又是淬滅基團(tuán)，打破傳統(tǒng)Taqman探針因波長(zhǎng)原因標(biāo)記選擇困難，不受淬滅基團(tuán)波長(zhǎng)限制；③大大提高信噪比，無(wú)背景信號(hào)，空間距離近，更好的淬滅效果；④成本較低，價(jià)格僅相當(dāng)于Taqman-MGB探針的一半，具有MGB探針?biāo)袃?yōu)勢(shì)。
[0041]本發(fā)明采用了 AllGlo探針技術(shù)，建立了能檢測(cè)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，與taqman-MGB探針?lè)ㄏ啾?，線性范圍均能達(dá)到7個(gè)數(shù)量級(jí)。本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度最低可達(dá)10拷貝/yL，最高可達(dá)IO7拷貝/yL。
[0042]本發(fā)明采用了 AllGlo探針技術(shù)，設(shè)計(jì)了特異性引物和相應(yīng)的AllGlo探針，探針?lè)謩e標(biāo)記2種特殊熒光基團(tuán)(MAR、JUP)，并對(duì)該技術(shù)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種AllGlo探針熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)hsa-miR-363的方法，應(yīng)用前景廣闊。
[0043]本發(fā)明的有益效果如下:
[0044]本發(fā)明提供了一種基于AllGlo探針RT-qPCR的hsaniR-363檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，其特異性和敏感性高，可快速準(zhǔn)確檢測(cè)樣本中miRNA的含量，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢(shì):
[0045]1.與northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探針檢測(cè)的特異性和敏感性均要高，價(jià)格比miRNA芯片要便宜；
[0046]2.與taqman-MGB探針相比，AllGlo探針采用相同的熒光基團(tuán)，互為報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，一方面釋放的熒光信號(hào)更強(qiáng)，另一方面本底信號(hào)更低；而且合成程序簡(jiǎn)單，價(jià)格僅相當(dāng)于Taqman-MGB的一半。
[0047]3.相比目前普遍采用的基于SYBGreen染料檢測(cè)miRNA方法，基于AllGlo探針檢測(cè)miRNA的反應(yīng)時(shí)間大大縮短,而且敏感性與特異性要明顯高于基于SYBGreen檢測(cè)miRNA的方法；
`[0048]4.本發(fā)明建立了基于AllGlo探針的RT-qPCR檢測(cè)hsa-miR-363的方法，適合于作為篩選miRNA的臨床樣本驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究miRNA在相關(guān)疾病中扮演的作用起到推動(dòng)作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049]圖1為本發(fā)明基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒實(shí)施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]實(shí)施例1
[0051]參見(jiàn)圖1，本發(fā)明所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒實(shí)施例，設(shè)有盒體1、隔板2、外源性參照瓶3、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶5 ;隔板2設(shè)在盒體I內(nèi)，外源性參照瓶3、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶5插在隔板2上，外源性參照瓶3內(nèi)裝有外源性參照，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶5內(nèi)裝有實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑。
[0052]①所述外源性參照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,,其工作濃度可為5n mol，其作用在于監(jiān)測(cè)從miRNA提取到后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR全過(guò)程的反應(yīng)效率；[0053]②莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT緩沖液(5XRT緩沖液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50m molDTT組成)、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、10m mol的MgC12、I μ mol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品(這里的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品是指人工合成的miRNA，濃度為IOOn mol);
[0054]③實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液(IOXTaq緩沖液包括 100m molTris-HCl, 500m mol KCl )> 10m mol 的 MgCl2、5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、10mmo I dNTP混合液、IOOmL無(wú)核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。
[0055]實(shí)施例2
[0056]血清或血衆(zhòng)hsa-miR-363的檢測(cè),包括以下步驟:
[0057]1.收集血漿或血清:
[0058]抽取新鮮血液標(biāo)本2mL裝于EDTA抗凝管或無(wú)抗凝劑管中，立即將上述試管顛倒混勻6~8次,然后將上述試管置于離心機(jī)3000r離心IOmin,結(jié)束后取出置于試管架上,小心吸取上清置于新的1.5mL的無(wú)RNA酶的離心管中，將裝有上清的1.5mL的離心管置于離心機(jī)中13000r離心lOmin，結(jié)束后將上層血漿或血清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無(wú)RNA酶的離心管中(此步驟注意不要吸取到下層的細(xì)胞沉淀。)，每管分裝400~500 μ L，取200 μ L用于下一步提取，其余血漿或血清于-80°C凍存。
[0059]2.提取 microRNA
[0060]采用天根生物科技有限公司的生產(chǎn)的miRNA提取試劑盒(DP501)，按照操作說(shuō)明書進(jìn)行樣本(血漿或血清)miRNA提取，其中200 μ L血漿或血清在加入同等體積的裂解液劇烈震蕩30s后靜置5min，然后加入外源性參照celnir-39 (其工作濃度為5n mol) 5 μ L，后按照說(shuō)明書操作進(jìn)行，最后用30 μ L的去核酶水溶解miRNA，于核酸分光光度儀器NanoDrop2000上分別測(cè)定濃度和純度，取純度A260/A280比值在1.6~2.2之間，取濃度2~20ng/ μ L的已提取的miRNA用于下游的逆轉(zhuǎn)錄,其余的miRNA均于_80°C凍存。
[0061]3.miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄:
[0062]3.1將逆轉(zhuǎn)錄所需成分于室溫下溶解，震蕩混勻后置于冰上；請(qǐng)按表1配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
[0063]表1
[0064]
【權(quán)利要求】
1.基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述hsa-miR-363 為一種人源性miRNA，其核苷酸序列為:SEQ ID N0.15 ; -AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA-3 ;； 所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，外源性參照瓶?jī)?nèi)裝有外源性參照，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶?jī)?nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶?jī)?nèi)裝有實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑。
2.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述外源性參照采用cel-miR-39，所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作濃度為 5nmol。
3.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5 X RT緩沖液、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mol的MgCl2U μ mol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為IOOn mol ;所述5XRT緩沖液由250m mol Tris-HCl,375mmol KClU5m mol MgCl2,50m mol DTT 組成。
4.如權(quán)利要求3所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述miRNA的特異逆轉(zhuǎn)錄引物由hsa-miR-363的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成； 所述hsa-miR-363的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCA`ATTGCACTGGATACGACTACAGATG-3 ;； 所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.45 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;； 所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ IDN0.55 ; -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;。
5.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份=IOXTaq緩沖液、IOm mol的MgCl2、5單位/μ L的Taq聚合酶、IOm moldNTP混合液、IOOmL無(wú)核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針;所述10XTaq緩沖液包括IOOm mol Tris-HCl, 500mmol KCl0
6.如權(quán)利要求5所述基于AlIGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述特異正向引物由hsa-miR-363的特異引物、外源性參照cel-miR-39的特異引物和內(nèi)源性參照U6的特異引物組成； 所述hsa-miR-363的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.65 ; -GCCGAATTGCACGGTAT-3 ;； 所述外源性參照cel-miR-39的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.75 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;； 所述內(nèi)源性參照U6的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.85 ; -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ;。
7.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述通用反向引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.95 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
8.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述AllGlo探針由hsa-miR-363的特異探針、內(nèi)源性參照U6的特異探針和外源性參照cel-miR-39的特異探針組成； 所述hsa-miR-363的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.1OMAR-CACTGGATACGACTACAGATGGA-MAR ； 所述內(nèi)源性參照U6的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP ； 所述外源性參照cel-miR-39的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
9.基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363的檢測(cè)方法，其特征在于其步驟如下: 1)采用常規(guī)方法提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，則在樣本充分裂解后加入所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒提供的濃度為5nmol的外源性參照cel-miR-395y L，立即進(jìn)行漩渦震蕩15s ;若為細(xì)胞或組織樣本，則無(wú)需加入外源性參照cel-miR-39 ； 2)采用所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA ； 3)采用所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363檢測(cè)試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增； 4)綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值和基線，進(jìn)行結(jié)果分析。
10.如權(quán)利要求9所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-363的檢測(cè)方法，其特征在于所述AllGlo探針采用美國(guó)AlleLogic Biosciences Corporation公司的突光定量探針。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK103773874SQ201410041110
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張忠英, 唐晶 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院