基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒及其檢測方法,涉及MicroRNA。試劑盒設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶提取樣本中miRNA,若為血清/血漿或其他體液樣本,則在樣本充分裂解后加入試劑盒提供的濃度為5n?mol的外源性參照cel-miR-395μL,漩渦震蕩;若為細(xì)胞或組織樣本,則無需加入外源性參照cel-miR-39;采用試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA;采用試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增;綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù),設(shè)定合理的閾值和基線,進(jìn)行結(jié)果分析。
【專利說明】基于AIIG10探針熒光定量PCR的hsa-m i R-26a-2檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及MicroRNA,尤其是涉及一種基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的長約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子,參與了在生物體中許多生理病理過程,通過調(diào)芐基因表達(dá),在細(xì)胞增殖、凋亡、生長發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝等過程中發(fā)揮重要作用,具體表現(xiàn)為miRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過形成最初的初級轉(zhuǎn)錄本pr1-miRNA到pre_miRNA,后轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核,通過剪切形成成熟miRNA,通過與Ago蛋白等形成RISC (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體),部分抑制或降解靶mRNA序列,參與基因表達(dá)調(diào)控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004,116(2):281-297)。
[0003]由于miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后判斷以及許多其他疾病狀態(tài)下扮演著重要角色,精確檢測其表達(dá)情況對于研究miRNA的作用具有重大意義。目前,檢測miRNA的方法主要有northern blot技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)等。其中,northern blot技術(shù)是RNA檢測的早期手段之一,但其特異性和敏感性低,如果樣本RNA含量低或存在降解,可能檢測不到;原位雜交技術(shù)用于檢測組織和細(xì)胞水平miRNA的分布情況,同時(shí)對miRNA進(jìn)行半定量檢測,其不足地方在于不能準(zhǔn)確檢測到低表達(dá)的miRNA ;微陣列芯片技術(shù)是一種高通量的檢測技術(shù),能同時(shí)檢測一種或多種樣本的大量的miRNA,但存在芯片制作費(fèi)時(shí),費(fèi)力和標(biāo)記成本高,檢測靈敏度和特異性低等問題。
[0004]實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表達(dá)檢測的技術(shù)之一,具有簡便快速、敏感性高和特異性好等特點(diǎn)。目前,用于檢測miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法包括miRNA逆轉(zhuǎn)錄和下游的熒光定量PCR兩部分,其中逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物的不同分為兩種:同聚物加尾法和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法;熒光定量PCR的檢測分為染料法和探針法,其中目前檢測miRNA的探針多為Taqman-MGB探針(一種適合于擴(kuò)增短片段的突光探針),由于成熟的miRNA具有片段短小的特點(diǎn),要特異的檢測,探針法更有優(yōu)勢,在敏感性和特異性上優(yōu)于染料法。基于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物能特異識別,擴(kuò)增成熟的miRNA序列,而miRNA的前體并未被擴(kuò)增,Taqman-MGB探針檢測miRNA缺點(diǎn)在于合成價(jià)格貴,不利于推廣。
[0005]目前,AllGl0探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測皰疹病毒、乙型肝炎病毒基因突變(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu,Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes [J].Clin Chim Acta, 2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵襲性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010,49 (2): 142-145)、K-ras基因突變、強(qiáng)直性脊柱炎等檢測。[0006]有研究報(bào)道表明在腫瘤研究方面,hsa-miR-26a-2在腎細(xì)胞癌患者血清中存在高表達(dá),且其平均表達(dá)量是正常對照的6.2倍。(Hauser, S., Wulfken, L.M., Holdenrieder, S.,Moritz, R., Ohlmann, C-H., Jung, V., von Ruecker, A.(2012).Analysis of serum microRNAs (miR-26a_2, miR-191, miR-337_3p and miR-378)as potential biomarkers in renalcell carcinoma.Cancer epidemiology, 36 (4), 391-394)如此我們便能通過檢測血清學(xué)hsa-miR-26a-2表達(dá)水平有效辨別腎細(xì)胞癌患者和正常人群,因此hsa-miR-26a_2很有可能可以作為新的腫瘤標(biāo)記物運(yùn)用于臨床診斷。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有檢測miRNA方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的上述缺陷,提供基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的目的之二在于提供基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2的檢測方法。
[0009]所述hsa-miR-26a-2為一種人源性miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.15 ; -CCUAUUCUUGAUUACUUGUUUC-3 ;。
[0010]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒,設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶;隔板設(shè)在盒體內(nèi),外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上,外源性參照瓶內(nèi)裝有外源性參照,莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑,實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶內(nèi)裝有實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑。
[0011]所述外源性參照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作濃度可為 5nmol。
[0012]所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/μ L的MMLV酶、IOm mo I dNTP混合液、5XRT 緩沖液(所述 5XRT 緩沖液由 250m mo I Tris_HCl、375m mo I KCl U 5m mo IMgCl2、50mmol DTT 組成)、40 單位 / μ L 的 RNA 酶抑制劑、IOm mo I 的 MgCl2'I μ mo I 的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品(這里的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品是指人工合成的miRNA,濃度為IOOnmol)。
[0013]所述miRNA的特異逆轉(zhuǎn)錄引物由hsa-miR-26a_2的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成:
[0014]所述hsa-miR-26a_2的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGAAACAAG-3 ;;
[0015]所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.45 1-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;;
[0016]所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ IDN0.55 ; -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;。
[0017]所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液(IOXTaq緩沖液包括 IOOmmol Tris-HCl, 500m mo I KCl )> 10m mol 的 MgCl2、5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、10mmo I dNTP混合液、IOOmL無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。[0018]所述特異正向引物由hsa-miR-26a_2的特異引物、外源性參照cel-miR-39的特異引物和內(nèi)源性參照U6的特異引物組成:
[0019]所述hsa-miR-26a_2的特異引物的核苷酸序列為:
[0020]SEQ ID N0.65 ; -TCCCCTGCCTATTCTTGATTA-3 ;;
[0021]所述外源性參照cel-miR-39的特異引物的核苷酸序列為:
[0022]SEQ ID N0.75 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;;
[0023]所述內(nèi)源性參照U6的特異引物的核苷酸序列為:
[0024]SEQ ID N0.85 ; -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ;。
[0025]所述通用反向引物的核苷酸序列為:
[0026]SEQ ID N0.95 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
[0027]所述AllGlo探針由hsa-miR-26a_2的特異探針、內(nèi)源性參照U6的特異探針和外源性參照cel-miR-39的特異探針組成;
[0028]所述hsa-miR-26a-2的特異探針的核苷酸序列為:
[0029]SEQ ID N0.1OMAR-TTGCACTGGATACGACGAAACAA-MAR ;
[0030]所述內(nèi)源性參照U6的特異探針的核苷酸序列為:
[0031]SEQ ID N0.11JUP-CGATACAGAGAAGAT`TAGCATGGCCCC-JUP ;
[0032]所述外源性參照cel-miR-39的特異探針的核苷酸序列為:
[0033]SEQ ID N0.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
[0034]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2的檢測方法,其步驟如下:
[0035]I)采用常規(guī)方法提取樣本中miRNA,若為血清/血漿或其他體液樣本,則在樣本充分裂解后加入所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒提供的濃度為5nmol的外源性參照cel-miR-395 μ L,立即進(jìn)行漩渦震蕩15s ;若為細(xì)胞或組織樣本,則無需加入外源性參照cel-miR-39 ;
[0036]2)采用所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA ;
[0037]3)采用所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增;
[0038]4)綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù),設(shè)定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline),進(jìn)行結(jié)果分析。
[0039]所述AllGlo 探針可米用美國 AlleLogic Biosciences Corporation 公司的突光定量探針,它擁有普通Taqman, Taqman-MGB及分子信標(biāo)(molecular beacon)探針?biāo)袃?yōu)點(diǎn),克服了目前這幾種探針的最大弊端,它打破了傳統(tǒng)Taqman —端報(bào)告基團(tuán)一端淬滅基團(tuán)的限制,利用了美國AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見波長的特制熒光染料,標(biāo)記在寡核苷酸上面互為報(bào)告基團(tuán)和粹滅基團(tuán),而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火溫度)的化學(xué)基團(tuán),提高探針特異性,雜交特異性大大提高,在雜交水解之后兩端標(biāo)記的染料又全部變?yōu)閳?bào)告基團(tuán),提高熒光增量。
[0040]所述AllGl0探針具有以下優(yōu)勢:①提高Tm值(可達(dá)10°C以上),探針更短可以達(dá)到15~16個(gè)堿基,可以適用A,T含量比較高的序列設(shè)計(jì)探針;②加大了多重?zé)晒舛康倪x擇,因?yàn)槊糠N染料即是報(bào)告基團(tuán)又是淬滅基團(tuán),打破傳統(tǒng)Taqman探針因波長原因標(biāo)記選擇困難,不受淬滅基團(tuán)波長限制;③大大提高信噪比,無背景信號,空間距離近,更好的淬滅效果;④成本較低,價(jià)格僅相當(dāng)于Taqman-MGB探針的一半,具有MGB探針?biāo)袃?yōu)勢。
[0041]本發(fā)明采用了 AllGl0探針技術(shù),建立了能檢測miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,與taqman-MGB探針法相比,線性范圍均能達(dá)到7個(gè)數(shù)量級。本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度最低可達(dá)10拷貝/yL,最高可達(dá)IO7拷貝/yL。
[0042]本發(fā)明采用了 AllGl0探針技術(shù),設(shè)計(jì)了特異性引物和相應(yīng)的AllGl0探針,探針分別標(biāo)記2種特殊熒光基團(tuán)(MAR、JUP),并對該技術(shù)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種AllGl0探針熒光定量PCR技術(shù)檢測hsa-miR-26a-2的方法,應(yīng)用前景廣闊。
[0043]本發(fā)明的有益效果如下:
[0044]本發(fā)明提供了一種基于AllGlo探針RT-qPCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒和檢測方法,其特異性和敏感性高,可快速準(zhǔn)確檢測樣本中miRNA的含量,與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢:
[0045]1.與northern blot,miRNA芯片相比,AllGlo探針檢測的特異性和敏感性均要高,價(jià)格比miRNA芯片要便宜;
[0046]2.與taqman-MGB探針相比,AllGl0探針采用相同的熒光基團(tuán),互為報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán),一方面釋放的熒光信號更強(qiáng),另一方面本底信號更低;而且合成程序簡單,價(jià)格僅相當(dāng)于Taqman-MGB的一半。
[0047]3.相比目前普遍采用的基于SYBGreen染料檢測miRNA方法,基于AllGlo探針檢測miRNA的反應(yīng)時(shí)間大大縮短,而且敏感性與特異性要明顯高于基于SYBGreen檢測miRNA的方法;
`[0048]4.本發(fā)明建立了基于AllGlo探針的RT-qPCR檢測hsa-miR-26a_2的方法,適合于作為篩選miRNA的臨床樣本驗(yàn)證,為進(jìn)一步研究miRNA在相關(guān)疾病中扮演的作用起到推動(dòng)作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049]圖1為本發(fā)明基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒實(shí)施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]實(shí)施例1
[0051]參見圖1,本發(fā)明所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒實(shí)施例,設(shè)有盒體1、隔板2、外源性參照瓶3、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶5 ;隔板2設(shè)在盒體I內(nèi),外源性參照瓶3、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶5插在隔板2上,外源性參照瓶3內(nèi)裝有外源性參照,莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑,實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶5內(nèi)裝有實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑。
[0052]①所述外源性參照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,,其工作濃度可為5n mol,其作用在于監(jiān)測從miRNA提取到后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR全過程的反應(yīng)效率;
[0053]②莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT緩沖液(5XRT緩沖液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50m molDTT組成)、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mol的MgC12、I μ mol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品(這里的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品是指人工合成的miRNA,濃度為IOOn mol);
[0054]③實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份=IOXTaq緩沖液(10 X Taq緩沖液包括IOOmmolTris-HCl, 500m mol KCl)> 10m mol 的 MgCl2>5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、10m moldNTP 混合液、IOOmL無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。
[0055]實(shí)施例2
[0056]血清或血衆(zhòng)hsa-miR-26a_2的檢測,包括以下步驟:
[0057]1.收集血漿或血清:
[0058]抽取新鮮血液標(biāo)本2mL裝于EDTA抗凝管或無抗凝劑管中,立即將上述試管顛倒混勻6~8次,然后將上述試管置于離心機(jī)3000r離心IOmin,結(jié)束后取出置于試管架上,小心吸取上清置于新的1.5mL的無RNA酶的離心管中,將裝有上清的1.5mL的離心管置于離心機(jī)中13000r離心lOmin,結(jié)束后將上層血漿或血清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無RNA酶的離心管中(此步驟注意不要吸取到下層的細(xì)胞沉淀。),每管分裝400~500 μ L,取200 μ L用于下一步提取,其余血漿或血清于-80°C凍存。
[0059]2.提取 microRNA
[0060]采用天根生物科技有限公司的生產(chǎn)的miRNA提取試劑盒(DP501),按照操作說明書進(jìn)行樣本(血漿或血清)miRNA提取,其中200 μ L血漿或血清在加入同等體積的裂解液劇烈震蕩30s后靜置5min,然后加入外源性參照celnir-39 (其工作濃度為5n mol) 5 μ L,后按照說明書操作進(jìn)行,最后用30 μ L的去核酶水溶解miRNA,于核酸分光光度儀器NanoDrop2000上分別測定濃度和純度,取純度A260/A280比值在1.6~2.2之間,取濃度2~20ng/ μ L的已提取的miRNA用于下游的逆轉(zhuǎn)錄,其余的miRNA均于_80°C凍存。
`[0061]3.miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄:
[0062]3.1將逆轉(zhuǎn)錄所需成分于室溫下溶解,震蕩混勻后置于冰上;請按照表1配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
[0063]表1
[0064]
【權(quán)利要求】
1.基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒,其特征在于所述hsa-miR-26a-2 為一種人源性miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.15 ; -CCUAUUCUUGAUUACUUGUUUC-3 ;; 所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒,設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶;隔板設(shè)在盒體內(nèi),外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上,外源性參照瓶內(nèi)裝有外源性參照,莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑,實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶內(nèi)裝有實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑。
2.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒,其特征在于所述外源性參照采用cel-miR-39,所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作濃度為 5nmol。
3.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒,其特征在于所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mo I dNTP混合液、5 X RT緩沖液、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mo I的MgCl2U μ mo I的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品,濃度為IOOn mo I ;所述5XRT緩沖液由250m mo I Tris-HCl,375m mo I KCl U 5m mo I MgCl2,50m mo I DTT 組成。
4.如權(quán)利要求3所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒,其特征在于所述miRNA的特異逆轉(zhuǎn)錄引物由hsa-miR-26a-2的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成; 所述hsa-miR-26a-2的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAG TCGGCAATTGCACTGGATACGACGAAACAAG-3 ;; 所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.45 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;; 所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ IDN0.55 ; -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;。
5.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒,其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份:10 X Taq緩沖液、IOm mo I的MgCl2、5單位/μ L的Taq聚合酶、IOm moldNTP混合液、IOOmL無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針;所述10XTaq緩沖液包括IOOm mol Tris-HCl, 500mmol KCl0
6.如權(quán)利要求5所述基于AlIGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒,其特征在于所述特異正向引物由hsa-miR-26a-2的特異引物、外源性參照cel-miR-39的特異引物和內(nèi)源性參照U6的特異引物組成; 所述hsa-miR-26a-2的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.65 ; -TCCCCTGCCTATTCTTGATTA-3 ;; 所述外源性參照cel-miR-39的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.75 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;; 所述內(nèi)源性參照U6的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.85 ; -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ;。
7.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒,其特征在于所述通用反向引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.95 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
8.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a_2檢測試劑盒,其特征在于所述AllGlo探針由hsa-miR-26a-2的特異探針、內(nèi)源性參照U6的特異探針和外源性參照cel-miR-39的特異探針組成; 所述hsa-miR-26a-2的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.1OMAR-TTGCACTGGATACGACGAAACAA-MAR ; 所述內(nèi)源性參照U6的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP ; 所述外源性參照cel-miR-39的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
9.基于411610探針熒光定量?0?的118&-1^1?-26&-2的檢測方法,其特征在于其步驟如下: 1)采用常規(guī)方法提取樣本中miRNA,若為血清/血漿或其他體液樣本,則在樣本充分裂解后加入所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒提供的濃度為5nmol的外源性參照cel-miR-395 μ L,立即進(jìn)行漩渦震蕩15s ;若為細(xì)胞或組織樣本,則無需加入外源性參照cel-miR-39 ; 2)采用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA ; 3)采 用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2檢測試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增; 4)綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù),設(shè)定合理的閾值和基線,進(jìn)行結(jié)果分析。
10.如權(quán)利要求9所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-26a-2的檢測方法,其特征在于所述AllGlo探針采用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的突光定量探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773873SQ201410041104
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】白永穎, 林凌青, 張忠英 申請人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院