整合全血核酸提取、擴(kuò)增即可視化檢測(cè)腫瘤基因突變的微流控芯片及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種整合全血核酸提取、擴(kuò)增即可視化檢測(cè)腫瘤基因突變的微流控芯片、以及用所述微流控芯片進(jìn)行基因突變檢測(cè)的方法。所述微流控芯片包括細(xì)胞裂解室和細(xì)胞液濾過(guò)單元，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元的下游連通至基因擴(kuò)增及檢測(cè)池；所述上游和下游之間設(shè)有過(guò)濾器。本發(fā)明無(wú)需對(duì)全血中的核酸進(jìn)行提取，將全血稀釋后直接加入到芯片中，通過(guò)加熱裂解法在芯片上提取DNA，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)液中加入熒光染料鈣黃綠素作為指示劑，不需任何儀器，在1小時(shí)內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的可視化檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】整合全血核酸提取、擴(kuò)增即可視化檢測(cè)腫瘤基因突變的微 流控芯片及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因突變檢測(cè)方法和檢測(cè)芯片，尤其涉及一種整合全血核酸提 取、擴(kuò)增即可視化檢測(cè)腫瘤基因突變的微流控芯片、以及用所述微流控芯片進(jìn)行基因突變 檢測(cè)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓增殖性腫瘤（MPN)，主要包括慢性粒細(xì)胞白血?。–ML)、真性紅細(xì)胞增多癥 (PV)原發(fā)性血小板增多癥（ET)與原發(fā)性骨髓纖維化（PMF)等。2008年WHO血液系統(tǒng)腫瘤 的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，將是否存在JAK2 V617F基因突變列入PV、ET、PMF的診斷標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有的突變 檢測(cè)方法多為基于限制性長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)、擴(kuò)增特異性突變檢測(cè)系統(tǒng)（ARMS)、直接測(cè)序 及高分辨率烙解分析（high resolution melting, HRM)等技術(shù)。
[0003] 其中，RFLP基于凝膠介質(zhì)，其檢測(cè)操作的人力與時(shí)間成本較高、且由于存在酶切不 完全，易于污染等問(wèn)題，并不適合實(shí)驗(yàn)室高通量篩查的需求。ARMS雖然可用于檢測(cè)簡(jiǎn)單形式 的突變，且可通過(guò)熒光定量完成單次閉管檢測(cè)，但由于反應(yīng)體系過(guò)于復(fù)雜，無(wú)法對(duì)多種突變 進(jìn)行同時(shí)篩查。直接測(cè)序雖可直接獲得核酸的詳細(xì)序列信息，但目前技術(shù)成本仍然較高、檢 測(cè)靈敏度較低（20% )，且由于雙脫氧核苷酸終止技術(shù)具有極大的致畸毒性，并不適合小規(guī) 模實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢測(cè)。HRM是新型的基因分型技術(shù)，利用異源雙鏈間的錯(cuò)配所導(dǎo)致的熔解溫度 變異，可快速可靠的完成簡(jiǎn)單突變的篩查，但該方法對(duì)樣本前處理要求高，DNA模板中的殘 余蛋白及RNA、緩沖液的離子強(qiáng)度等因素均可導(dǎo)致熔解曲線漂移進(jìn)而影響結(jié)果判讀。
[0004] 目前常用的HRM分析方法如傳統(tǒng)產(chǎn)物熔解分析、小片段內(nèi)參法或非標(biāo)記探針?lè)ǖ?檢測(cè)靈敏度可達(dá)為5%。但JAK2 V617F突變?yōu)轶w細(xì)胞獲得性突變，如何提高檢測(cè)靈敏度對(duì) 于提高M(jìn)PN患者的早期診斷并提示臨床開(kāi)展區(qū)別于反應(yīng)性增生的早期治療干預(yù)具有重要 的現(xiàn)實(shí)意義。由于這些方法均需特殊儀器，操作繁瑣，因此建立簡(jiǎn)單、高靈敏度的用于MPN 患者的早期分子診斷已為目前亟需解決的問(wèn)題。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)是2000年日本學(xué)者發(fā)明的一種在一個(gè)溫度下進(jìn)行得的 基因擴(kuò)增技術(shù)，此技術(shù)已成功地應(yīng)用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測(cè)。此技術(shù)具有特 異性強(qiáng)、靈敏度高、響應(yīng)速度快、結(jié)果判定簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣、操作方便、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。 Minnucci 等（Minnucci G, et al. A novel, highly sensitive and rapid allele-specific loop-mediated amplification assay for the detection of the JAK2V617F mutation in chronic myeloproliferative neoplasms, Hematopoiesis, 2012, 97(9):1394-1400)利 用LAMP技術(shù)針對(duì)JAK2 V617F突變型DNA進(jìn)行了檢測(cè)，但是不能檢測(cè)出野生型及雜合型的 臨床樣本，且不能實(shí)現(xiàn)核酸提取、擴(kuò)增及檢測(cè)一體化。
[0006] 微流控技術(shù)是在微米尺度結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升級(jí)體積流體的技術(shù)與科學(xué)，可 以將分析裝備微型化、集成化和高通量化，直至將一個(gè)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室微縮到一塊幾平 方厘米的芯片上-即所謂"芯片實(shí)驗(yàn)室"。由于其具有分析速度快、可集成化、便于攜帶 等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于氨基酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等的檢測(cè)和分析。該技術(shù)的小尺度結(jié)構(gòu)增 強(qiáng)了流體的層流效應(yīng)、表面張力效應(yīng)和熱傳導(dǎo)效應(yīng)，使許多物理和化學(xué)過(guò)程發(fā)生了質(zhì)的變 化，為生物分子診斷提供了廣闊的應(yīng)用前景。微流控芯片（Microchip)與LAMP核酸分析 技術(shù)結(jié)合可實(shí)現(xiàn)多重，原位，定量，高通量和高集成地分析核酸分子，對(duì)于發(fā)展強(qiáng)大的生物 分子床邊快速診斷具有重大意義。Fang等利用LAMP-Microchip實(shí)現(xiàn)了甲型流感病毒的 檢測(cè)（Fang XE, et al. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip, Anal. Chem, 2011，83:690-695)，但其檢測(cè) 樣本為已提取的DNA、而非全血樣品，也不能實(shí)現(xiàn)微流控芯片上核酸提取、擴(kuò)增及檢測(cè)的一 體化。
[0007] 而目前針對(duì)全血的基因突變檢測(cè)，都需從全血中提取DNA或RNA，且需要相應(yīng)的檢 測(cè)系統(tǒng)，如PCR分析儀或凝膠電泳儀等，尚無(wú)用于整合全血核酸提取、擴(kuò)增及基因檢測(cè)的一 體化微流控芯片。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)僅能采用已提取DNA檢測(cè)、不能實(shí)現(xiàn)微流控芯片上核酸提取、 擴(kuò)增及檢測(cè)的一體化的缺陷，本發(fā)明提供了一種整合全血核酸提取、擴(kuò)增及可視化檢測(cè)腫 瘤基因突變的微流控芯片，以及利用所述微流控芯片進(jìn)行基因突變的檢測(cè)方法，尤其是 JAK2 V617F基因突變的檢測(cè)方法。
[0009] 本發(fā)明第一個(gè)方面是提供一種整合全血核酸提取、擴(kuò)增即可視化檢測(cè)腫瘤基因突 變的微流控芯片。
[0010] 本發(fā)明第一個(gè)方面所述的微流控芯片包括細(xì)胞裂解室和細(xì)胞液濾過(guò)單元；其中， 所述細(xì)胞裂解室設(shè)有樣品加入口和液體流出口；其中，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元的上游連通所 述細(xì)胞裂解室的液體流出口，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元的下游連通至基因擴(kuò)增及檢測(cè)池；所述 上游和下游之間設(shè)有過(guò)濾器，所述過(guò)濾器的濾孔孔徑優(yōu)選為25-35 μ m、例如30 μ m。 toon] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元與基因擴(kuò)增及檢 測(cè)池之間設(shè)有可閉合的通道。所述可閉合的通道可以是帶有夾子的彈性管、閥門(mén)中的任意 一種或幾種，更優(yōu)選為閥門(mén)，最優(yōu)選為螺絲閥。
[0012] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述細(xì)胞裂解室中，從所述樣品加入 口處，至液體流出口之間，設(shè)有樣品流動(dòng)通道。其中，所述樣品流動(dòng)通道可以是直線型、曲線 形或其組合，更優(yōu)選為曲線形，如Z型、S型、U型、C型等彎曲的形狀。
[0013] 其中，所述樣品流動(dòng)通道長(zhǎng)度優(yōu)選為至少20cm。
[0014] 其中，樣品加入口可以連通所述樣品流動(dòng)通道，或者可以位于所述樣品流動(dòng)通道 的上方。
[0015] 其中，所述樣品加入口可以是閥門(mén)，如單向閥、雙向閥或三通閥。其中，所述樣品加 入口也可以是橡膠件，將注射器從所述橡膠件中插入進(jìn)行注射，注射器拔出后，橡膠件在彈 性作用下將注射器形成的針口封閉。
[0016] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述濾器可以是至少一層過(guò)濾網(wǎng)、或 至少一層填料組成，或者由過(guò)濾網(wǎng)和填料的組合制成，并優(yōu)選為由多層濾網(wǎng)和/或多層填 料組成。
[0017] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元中，在液體進(jìn)口 與所述過(guò)濾器之間形成有一空間，優(yōu)選地，所述空間的體積由所述液體進(jìn)口至過(guò)濾器之間 逐步變大。
[0018] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述過(guò)濾器為中間放大、兩端內(nèi)縮的 形狀。更優(yōu)選地，所述過(guò)濾器下游一端的面積小于上游一端的面積。
[0019] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述微流控芯片還可以包括擴(kuò)增引 物。
[0020] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述微流控芯片還可以包括顯色劑。
[0021] 在本發(fā)明第一個(gè)方面的更優(yōu)選實(shí)施例中，所述微流控芯片為檢測(cè)JAK2 V617F基因 突變的微流控芯片，其中，所述顯色劑為鈣黃綠素，所述擴(kuò)增引物至少包括如下序列：
[0022] GCATCTTTATTATGGCAGAGAG ；
[0023] TGCTCTGAGAAAGGCATTA ；
[0024] GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0025] TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0026] GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0027] TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0028] GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC ；
[0029] GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC。
[0030] 本發(fā)明第二個(gè)方面是提供一種檢測(cè)基因突變的方法，包括：
[0031] 將全血樣品注射至一細(xì)胞裂解室，在所述細(xì)胞裂解室內(nèi)裂解；
[0032] 所述裂解室連通至細(xì)胞液濾過(guò)單元，所述濾過(guò)單元中設(shè)有過(guò)濾器，所述過(guò)濾器的 濾孔孔徑為25-35 μ m、例如30 μ m ;裂解液通過(guò)所述過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾；
[0033] 在所述細(xì)胞液濾過(guò)單元下游連接有擴(kuò)增及檢測(cè)池，擴(kuò)增及檢測(cè)池內(nèi)包被有擴(kuò)增引 物，過(guò)濾后的液體進(jìn)入所述擴(kuò)增及檢測(cè)池，加入顯色劑，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；通過(guò)顏色判斷是否 存在基因突變。
[0034] 在本發(fā)明第二個(gè)方面中，所述方法采用本發(fā)明第一個(gè)方面所述的微流控芯片進(jìn)行 實(shí)施。
[0035] 在本發(fā)明第二個(gè)方面中，所述全血樣品可以是全血的稀釋樣品，如用水稀釋的樣 品，全血與水按照1 : 10體積比稀釋。
[0036] 在本發(fā)明第二個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述基因突變?yōu)镴AK2 V617F基因突 變，所述顯色劑為鈣黃綠素，所述擴(kuò)增引物至少包括如下序列：
[0037] GCATCTTTATTATGGCAGAGAG ；
[0038] TGCTCTGAGAAAGGCATTA ；
[0039] GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0040] TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0041] GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0042] TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0043] GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC ；
[0044] GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC。
[0045] 其中，所述顯色劑為鈣黃綠素時(shí)，所述判斷是通過(guò)觀察擴(kuò)增即檢測(cè)池中是否出現(xiàn) 綠色產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)施。
[0046] 其中，所述裂解的溫度條件優(yōu)選為90_105°C、更優(yōu)選為92_100°C、更優(yōu)選為 95-98。。。
[0047] 其中，所述裂解的時(shí)間優(yōu)選為至少1分鐘，更優(yōu)選為至少1. 5分鐘，更優(yōu)選為至少 2分鐘，如1-5分鐘，更優(yōu)選為2-4分鐘，更優(yōu)選為3-3. 5分鐘。
[0048] 其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)的溫度條件優(yōu)選為60_70°C，更優(yōu)選為62_68°C，更優(yōu)選為 63-65。。。
[0049] 其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為至少30分鐘，更優(yōu)選為至少45分鐘，更優(yōu)選為 至少1小時(shí)，如30分鐘至5小時(shí)，更優(yōu)選為45分鐘至3小時(shí)，更優(yōu)選為1小時(shí)至2小時(shí)。
[0050] 應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明上述內(nèi)容中，各個(gè)方面以及各種實(shí)施例之間，可以由本領(lǐng)域 技術(shù)人員不受限制的進(jìn)行任意組合，并且所述組合也在本發(fā)明上述內(nèi)容范圍內(nèi)。
[0051] 如上所述，本發(fā)明提供了一種整合全血核酸提取、擴(kuò)增即可視化檢測(cè)腫瘤基因突 變的微流控芯片，以及用所述微流控芯片進(jìn)行基因突變檢測(cè)的方法，本發(fā)明無(wú)需對(duì)全血中 的核酸進(jìn)行提取，將全血稀釋后直接加入到芯片中，通過(guò)加熱裂解法在芯片上提取DNA，進(jìn) 行擴(kuò)增，反應(yīng)液中加入熒光染料鈣黃綠素作為指示劑，不需任何儀器，在1小時(shí)內(nèi)即可實(shí)現(xiàn) 對(duì)結(jié)果的可視化檢測(cè)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052] 圖1為本發(fā)明微流控芯片設(shè)計(jì)示意圖；
[0053] 圖2為本發(fā)明微流控芯片中裂解液濾過(guò)單元放大結(jié)構(gòu)示意圖；
[0054] 圖3為本發(fā)明方法的JAK2 V617F雜合突變患者的全血樣本檢測(cè)結(jié)果照片。

【具體實(shí)施方式】
[0055] 參照?qǐng)D1，本發(fā)明的一種實(shí)施例中，微流控芯片分為細(xì)胞裂解室1，細(xì)胞液濾過(guò)單 元2及基因擴(kuò)增及檢測(cè)池3,其中，在細(xì)胞液濾過(guò)單元2及基因擴(kuò)增及檢測(cè)池3之間設(shè)計(jì)螺 絲閥4進(jìn)行流體控制。芯片制作采用軟光刻技術(shù)及微加工技術(shù)，SU-8光刻膠制作陽(yáng)模，激 光雕刻技術(shù)制作微反應(yīng)擴(kuò)增池陽(yáng)模，最終制作PDMS-玻璃雜合微流控芯片。
[0056] 如圖2所示，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元2包括殼體以及殼體內(nèi)的過(guò)濾器21，裂解液從液 體入口 22進(jìn)入后，通過(guò)過(guò)濾器21進(jìn)行過(guò)濾。如圖2所示，過(guò)濾器可以是多層濾網(wǎng)結(jié)構(gòu)，也 可以是多層填料結(jié)構(gòu)，當(dāng)使用多層填料結(jié)構(gòu)時(shí)，填料之間形成液體通道，用于過(guò)濾。
[0057] 在液體入口 22和過(guò)濾器21之間，形成有空腔，并且空腔逐步增大直至過(guò)濾器21 位置。過(guò)濾器21由上至下逐步變大、達(dá)到最大處逐步內(nèi)縮，形成類(lèi)似于梭形的形狀。
[0058] 以檢測(cè)JAK2 V617F基因突變?yōu)槔?，設(shè)計(jì)針對(duì)JAK2 V617F基因突變的野生型及突 變型的LAMP反應(yīng)引物，如下：
[0059] F3 ：GCATCTTTATTATGGCAGAGAG
[0060] B3 ：TGCTCTGAGAAAGGCATTA
[0061] J2M ：GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC
[0062] ASO-W ：TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC
[0063] J2W ：GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC
[0064] ASO-M ：TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC
[0065] FIP ：GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC
[0066] BIP ：
[0067] GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC
[0068] 反應(yīng)體系：5 μ mol/1 F3 I μ 1、5 μ mol/1 B3 I μ 1、40 μ mol/1 FIP I μ 1、 40ymol/l BIP 1μ1、40μπιο1/1 J2M 1μ1、40μπιο1/1 ASO-W 1μ1、40μπιο1/1 J2W Ιμ?、 40ymol/l ASO-M 1 μ IUO X Thermopol 2. 5 μ I, dNTPUOOmM Mg2+3yl,FD UBst DNA 1 μ 1> Calcein 1 μ 1〇
[0069] 檢測(cè)方法如下：
[0070] 將引物通過(guò)注入-蒸發(fā)法包被與芯片對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增基檢測(cè)池3中，完成功能化芯片。 選擇JAK2 V617F雜合突變的患者，將1 μ 1全血與去離子水I : 10稀釋后直接注入芯片細(xì) 胞裂解室1，關(guān)閉螺絲閥4,95°C裂解3分鐘。開(kāi)啟螺絲閥4,裂解液通過(guò)裂解液濾過(guò)單元2 后進(jìn)入擴(kuò)增基檢測(cè)池3,關(guān)閉螺絲閥，然后在擴(kuò)增基檢測(cè)池中加入含有鈣黃綠素的反應(yīng)液。 用未固化的聚二甲基硅氧烷封堵進(jìn)出口，于65°C熱板上反應(yīng)1小時(shí)。直接根據(jù)擴(kuò)增池中是 否產(chǎn)生綠色產(chǎn)物判斷結(jié)果，如圖3所示。
[0071] 從圖3中可以看出，本發(fā)明采用全血樣品進(jìn)行檢測(cè)，與陽(yáng)性對(duì)照相似，JAK2 V617F 基因突變野生型、以及突變型均得到了綠色產(chǎn)物，這說(shuō)明：本發(fā)明所述的芯片和方法能夠采 用全血樣品為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)JAK2 V617F基因突變。
[0072] 附圖中各附圖標(biāo)記含義如下：
[0073] 1-細(xì)胞裂解室；
[0074] 11-樣品加入口；
[0075] 2-裂解液濾過(guò)單元；
[0076] 21-過(guò)濾器；
[0077] 22-液體進(jìn)口；
[0078] 3-擴(kuò)增及檢測(cè)池；
[0079] 4-螺絲閥；
[0080] NC-陰性對(duì)照擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0081] M-包被野生型引物及探針擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0082] W-包被突變引物及探針擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0083] PC-陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。
[0084] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種整合全血核酸提取、擴(kuò)增即可視化檢測(cè)腫瘤基因突變的微流控芯片，其特征在 于，包括細(xì)胞裂解室和細(xì)胞液濾過(guò)單元；所述細(xì)胞裂解室設(shè)有樣品加入口和液體流出口； 其中，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元的上游連通所述細(xì)胞裂解室的液體流出口，所述細(xì)胞液濾 過(guò)單元的下游連通至基因擴(kuò)增及檢測(cè)池；所述上游和下游之間設(shè)有過(guò)濾器，所述過(guò)濾器的 濾孔孔徑為25-35 ii m。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述細(xì)胞液濾過(guò)單元與基因擴(kuò)增 及檢測(cè)池之間設(shè)有可閉合的通道。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述閉合通道為螺絲閥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述細(xì)胞裂解室中，從所述樣品加 入口處，至液體流出口之間，設(shè)有曲線形樣品流動(dòng)通道。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述樣品流動(dòng)通道長(zhǎng)度至少為 20cm〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述過(guò)濾器由多層濾網(wǎng)和/或多層 填料組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，還包括擴(kuò)增引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，還包括顯色劑。
9. 一種檢測(cè)基因突變的方法，其特征在于，包括： 將全血樣品注射至一細(xì)胞裂解室，在所述細(xì)胞裂解室內(nèi)裂解； 所述裂解室連通至細(xì)胞液濾過(guò)單元，所述濾過(guò)單元中設(shè)有過(guò)濾器，所述過(guò)濾器的濾孔 孔徑為25-35 y m ;裂解液通過(guò)所述過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾； 在所述細(xì)胞液濾過(guò)單元下游連接有擴(kuò)增及檢測(cè)池，擴(kuò)增及檢測(cè)池內(nèi)包被有擴(kuò)增引物， 過(guò)濾后的液體進(jìn)入所述擴(kuò)增及檢測(cè)池，加入顯色劑，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；通過(guò)顏色判斷是否存在 基因突變。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因突變?yōu)镴AK2V617F基因突變，所 述顯色劑為鈣黃綠素，所述擴(kuò)增引物至少包括如下序列： GCATCTTTATTATGGCAGAGAG ； TGCTCTGAGAAAGGCATTA ； GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ； TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ； GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ； TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ； GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC ； GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK104312913SQ201410554594
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】關(guān)明, 汪驊, 張心菊, 吳之源, 許笑, 劉維薇, 周丹秋 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院