本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中單核苷酸多態(tài)性rs55882956在篩查麻風(fēng)患者中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
麻風(fēng)，又名Hansen’s病，是一種由麻風(fēng)分枝桿菌(M.Leprae)引起的傳染性疾病，主要侵犯皮膚和周圍神經(jīng)。2014年，全球有213,889例新發(fā)病例。盡管目前存在有效的治療方法，但在一些國家，特別是發(fā)展中國家，麻風(fēng)仍是致畸和導(dǎo)致一些社會問題的主要原因。為了解麻風(fēng)易感性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，麻風(fēng)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)定位了17個常見變異位點，揭示了固有免疫與適應(yīng)性免疫在麻風(fēng)發(fā)病中的作用。然而，這些常見的風(fēng)險變異位點大部分位于非編碼區(qū)，僅能夠部分解釋麻風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險。目前，還沒有對蛋白編碼區(qū)域的變異，特別是低頻變異和罕見變異，進行系統(tǒng)研究。而這些變異已證實與一些疾病的遺傳易感性相關(guān)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何篩查麻風(fēng)患者與檢測麻風(fēng)易感性。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了下述任一用途：
A1)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備篩查麻風(fēng)患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；
A2)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備檢測麻風(fēng)易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；
A3)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備檢測與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
A4)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
B1)人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備篩查麻風(fēng)患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；
B2)人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備檢測麻風(fēng)易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；
B3)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在篩查麻風(fēng)患者中的應(yīng)用；
B4)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在檢測麻風(fēng)易感性中的應(yīng)用；
B5)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在檢測與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的中的應(yīng)用；
B6)檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的中的應(yīng)用；
B7)人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在篩查麻風(fēng)患者中的應(yīng)用；
B8)人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在檢測麻風(fēng)易感性中的應(yīng)用。
rs55882956是人染色體19p13.2上的一個二等位多態(tài)性的SNP位點，屬于低頻變異(MAF＝3.63％)，位于TYK2基因的外顯子中，該變異是轉(zhuǎn)換(A/G，在其互補鏈上則為T/C)。所述rs55882956基因型是AA、AG或GG。所述AA是rs55882956位點為A的純合型，所述GG是rs55882956位點為G的純合型，所述AG是rs55882956位點為A和G的雜合型。所述檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型具體可為檢測rs55882956的核苷酸種類。
上述用途中，所述檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為擴增包括rs55882956在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和/或單堿基延伸引物。
上述用途中，所述AA和所述AG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型在正常人群體中的比例。所述產(chǎn)品可包括所述PCR引物和/或所述單堿基延伸引物。
上述用途中，所述麻風(fēng)具體可為中國人群麻風(fēng)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了含有檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品。
本發(fā)明所提供的含有檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品，為a)-d)中的任一種產(chǎn)品：
a)檢測與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品；
b)鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品；
c)篩查麻風(fēng)患者產(chǎn)品；
d)檢測麻風(fēng)易感性產(chǎn)品。
上述產(chǎn)品中，所述檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為擴增包括rs55882956在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和/或單堿基延伸引物。
上述產(chǎn)品中，所述麻風(fēng)具體可為中國人群麻風(fēng)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述M1)或M2)的方法：
M1)篩查麻風(fēng)患者的方法，包括：檢測待測對象基因組中rs55882956位點的基因型，如rs55882956位點的基因型為AA基因型，所述待測對象為或候選為麻風(fēng)患者；如rs55882956位點的基因型為AG基因型，所述待測對象為或候選為麻風(fēng)患者；如rs55882956位點的基因型為GG基因型，所述待測對象為或候選為非麻風(fēng)患者；
M2)檢測麻風(fēng)易感性的方法，包括：檢測待測對象基因組中rs55882956位點的基因型，如rs55882956位點的基因型為AA基因型，所述待測對象易感或候選易感麻風(fēng)；如rs55882956位點的基因型為AG基因型，所述待測對象易感或候選易感麻風(fēng)；如rs55882956位點的基因型為GG基因型，所述待測對象不易感或候選不易感麻風(fēng)。
上述方法中，所述麻風(fēng)具體可為中國人群麻風(fēng)。
上述方法中，檢測待測對象基因組中rs55882956位點的基因型可采用所述檢測rs55882956的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)進行。
實驗證明，rs55882956的風(fēng)險等位基因為A，該等位基因在麻風(fēng)患者群體中的比例比該等位基因在正常健康人群中的比例高45.73％。rs55882956的P值是1.04×10-6，且rs55882956的相對危險度是1.30，說明rs55882956是與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。rs55882956的三個基因型中，AA基因型的個體和AG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，GG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例。
本發(fā)明在實際應(yīng)用中，可將檢測rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測其它的與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查麻風(fēng)患者的產(chǎn)品。
其中，檢測人基因組中rs55882956的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為通過下述至少一種方法確定rs55882956的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器：DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜、SNP芯片、TaqMan探針技術(shù)和Sequenom MassArray技術(shù)。其中，利用Sequenom MassArray技術(shù)確定rs55882956的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括PCR引物對、基于單堿基延伸反應(yīng)的延伸引物、磷酸酶、樹脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜)和/或Sequenom MassArray技術(shù)所需要的其他試劑和儀器；利用TaqMan探針技術(shù)確定rs55882956的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括TaqMan探針、PCR引物對、定量PCR儀、進行基因分型的模塊和/或TaqMan探針技術(shù)所需要的其他試劑；SNP芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片和/或基于熒光分子DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片。在本發(fā)明的一個實施例中，利用的是Illumina公司的Infinium Human Exome BeadChip芯片。
所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為由試劑或試劑盒和儀器組成的系統(tǒng)，如由引物和DNA測序儀組成的系統(tǒng)，由PCR試劑和DNA測序試劑和DNA測序儀組成的系統(tǒng)，由TaqMan探針、PCR引物對、定量PCR儀和進行基因分型的模塊以及TaqMan探針技術(shù)所需要的其他試劑組成的系統(tǒng)，由探針、PCR引物對以及連接酶檢測反應(yīng)(LDR)所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng)，由PCR引物對、單堿基延伸引物、芯片、PCR儀、進行基因分型的模塊和/或Sequenom MassArray技術(shù)所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng)。
采用PCR引物擴增包括rs55882956在內(nèi)的基因組DNA片段，以得到的PCR擴增產(chǎn)物為模板，采用單堿基延伸引物進行單堿基延伸反應(yīng)，對得到的延伸產(chǎn)物的序列進行檢測，確定rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)和基因型。所述PCR引物在序列上沒有特殊要求，只要能擴增出包括rs55882956在內(nèi)的基因組DNA片段即可。所述延伸引物根據(jù)人基因組中rs55882956上游(不包括該SNP位點)設(shè)計，所述延伸引物的最后1位核苷酸對應(yīng)于人基因組中rs55882956的前1位核苷酸。所述延伸引物也可根據(jù)人基因組中rs55882956下游(不包括該SNP位點)設(shè)計，所述延伸引物的第1位核苷酸對應(yīng)于人基因組中rs55882956的后1位核苷酸。
本發(fā)明中，所述PCR引物可由rs55882956-F和rs55882956-R組成；
所述rs55882956-F是如下a1)至a4)中的任一種單鏈DNA：
a1)序列表中序列10所示的單鏈DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA；
a3)與a1)或a2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；
a4)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA；
所述rs55882956-R是如下b1)至b4)中的任一種單鏈DNA：
b1)序列表中序列11所示的單鏈DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA；
b3)與b1)或b2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；
b4)在嚴格條件下與b1)或b2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA。
所述單堿基延伸引物(rs55882956-E)可為如下c1)至c4)中的任一種單鏈DNA：
c1)序列表中序列12所示的單鏈DNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA；
c3)與c1)或c2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；
c4)在嚴格條件下與c1)或c2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA。
a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA為在序列10所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個核苷酸得到的單鏈DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA為在序列11所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個核苷酸得到的單鏈DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA為在序列12所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個核苷酸得到的單鏈DNA。
這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的序列10、序列11或序列12所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
上述85％以上同一性，可為85％、90％或95％以上的同一性。
在本發(fā)明的實施例中，rs55882956應(yīng)用SEQUENOM基因分型平臺即分子量陣列技術(shù)，SequenomSNP檢測過程結(jié)合多重PCR技術(shù)、MassARRAY iPLEX單堿基延伸技術(shù)，和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight，MALDI-TOF)進行分型檢測。將包含SNP位點區(qū)域的DNA模板通過PCR技術(shù)擴增，再使用特異的延伸引物與PCR產(chǎn)物進行單堿基延伸反應(yīng)。由于多態(tài)性位點堿基不同，延伸產(chǎn)物不同的末端堿基將導(dǎo)致延伸后的產(chǎn)物分子量的差異，因此由SNP多態(tài)性引起的堿基差異通過分子量的差異而體現(xiàn)，通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)，檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小，應(yīng)用專用的分析軟件，通過判斷分子量的差異而進行SNP分型檢測。
本發(fā)明在一個來自中國人群的樣本(7048例麻風(fēng)患者和14398例健康者)中發(fā)現(xiàn)rs55882956是與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。可將檢測rs55882956的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測其它的與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查麻風(fēng)患者的產(chǎn)品。
附圖說明
圖1為應(yīng)用固定效果模型對所有樣本(7,048例病例和14,398例健康對照)進行meta分析的結(jié)果。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、rs145562243、rs149308743、rs76418789、rs146466242、rs55882956、rs780668和rs181206是與麻風(fēng)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性
方法：發(fā)明人通過三個階段對中國人群中的7,048例麻風(fēng)患者及14,398例正常對照進行蛋白編碼區(qū)域的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究。首先，通過外顯子芯片對1,648例麻風(fēng)患者和2,318例正常對照的40,491個編碼區(qū)域的SNP位點(MAF>0.1％)進行分析(第一階段)。然后在中國北方人群(3,169例麻風(fēng)患者和9,814例正常對照)中對34個候選SNP位點進行驗證(第二階段)。最后在另外選取的中國南方人群(2,231例麻風(fēng)患者和2,266例正常對照)以及第一、二階段的所有樣本中對8個候選位點進行驗證(第三階段)。
研究對象
外顯子芯片發(fā)現(xiàn)階段(第一階段)的研究對象為中國北方地區(qū)的1,670例麻風(fēng)患者和2,321例正常對照。驗證階段(第二階段)將39個變異位點在中國北方地區(qū)的另外的3,169例麻風(fēng)患者和9,814例正常對照中進行驗證。最終對篩選出的8個變異位點的重復(fù)驗證階段(第三階段)選擇的研究對象為中國南方地區(qū)的三個獨立樣本以及第一、二階段的所有樣本：(1)四川省906例麻風(fēng)患者和878例正常對照；(2)云南省829例麻風(fēng)患者和589例正常對照；(3)貴州省496例麻風(fēng)患者和799例正常對照。麻風(fēng)患者和正常對照均為中國漢族人群，并且在地域上是相匹配的。研究對象的臨床信息見表1。
表1、研究對象信息
其中，麻風(fēng)患者的診斷標準是符合下述4條中的2條或2條以上，或符合第3條者確立診斷：1、皮損伴有感覺障礙及閉汗，或有麻木區(qū)；2、周圍神經(jīng)受累，表現(xiàn)為神經(jīng)干粗大伴相應(yīng)功能障礙；3、皮損組織切片或組織液涂片查到麻風(fēng)桿菌；4、病理可見特征性改變。
正常對照(正常健康人)的診斷標準：無麻風(fēng)史且無麻風(fēng)的家族史(包括麻風(fēng)患者的一級、二級和三級親屬)；無其他傳染病病史；無其他自身免疫性疾病病史、系統(tǒng)性疾病病史及家族史。
本研究已通過山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、山東省皮膚病性病防治研究所倫理審查委員會批準。
分型與質(zhì)控
選用Illumina公司的Infinium Human Exome BeadChip芯片對1,670例麻風(fēng)患者及2,321例正常對照進行分型，芯片上共有對1,998例中國人樣本進行全外顯子組測序鑒定出的27,089個(在>1例樣本中存在)非同義編碼區(qū)域變異。排除非編碼區(qū)變異和MAF<0.1％的變異，對40,491個編碼區(qū)域變異進行關(guān)聯(lián)分析。在驗證階段和重復(fù)驗證階段，選用Sequenom MassARRAY system(Agena Bioscience)，QuantStudioTM 12K Flex Real-Time PCR(Applied Biosystems)和7900HT Fasr Real-Time PCR System(Applied Biosystems)進行分型研究。質(zhì)控過濾標準如下：排除不確定群體的變異、檢出率<90％且不符合Hardy-Weinberg平衡定律(P<1×10-3)、樣本檢出率<95％的情況。
統(tǒng)計學(xué)分析
在第一階段，通過GMMAT-v0.7進行表型和單個變異基因型之間的關(guān)聯(lián)性分析。在第二、三階段，通過PLINK中的線性回歸模型對MAF>1％的SNPs進行關(guān)聯(lián)性分析，利用PLINK中Fisher's確切概率法對MAF<1％的SNPs進行關(guān)聯(lián)分析。利用固定效果模型(通過META-v7.0軟件對MAF>1％的SNPs采用逆方差法，對MAF<1％的SNPs采用z-統(tǒng)計量組合方法進行分析)。對發(fā)現(xiàn)階段、驗證階段、重復(fù)驗證階段三部分結(jié)合起來的數(shù)據(jù)進行meta分析。同時符合p<1.23×10-6(0.05/40,491)的變異為有統(tǒng)計學(xué)意義的外顯子組的變異。對于第二和第三階段的關(guān)聯(lián)分析，p<0.05并且和發(fā)現(xiàn)階段具有相同效應(yīng)的變異為具有統(tǒng)計學(xué)意義的位點。利用Cochran’sQ檢驗對獨立樣本的異質(zhì)性進行分析，p<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
外顯子組發(fā)現(xiàn)階段分析
對1,670例麻風(fēng)患者和2,321例正常對照的273,028個變異位點進行分型。通過主成分分析確定所有樣本均為中國血統(tǒng)，并且發(fā)現(xiàn)在麻風(fēng)患者和正常對照中具有較好的基因型的匹配。經(jīng)過一系列樣本和變異位點的過濾，共發(fā)現(xiàn)40,491個MAF>0.1％的編碼區(qū)變異位點(38,068個非同義突變和2,423個同義突變)，后將其在1,648例麻風(fēng)患者和2,318例健康對照中進行分析。
全外顯子分析發(fā)現(xiàn)在MHC區(qū)域內(nèi)有較強的關(guān)聯(lián)性。去除MHC區(qū)域內(nèi)的所有變異位點后，剩余SNP位點的Q-Q圖符合零分布，表明將人群混雜因素導(dǎo)致的外顯子關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的可能性降到最低(lambda value＝0.99)。同時，對不同MAF閾值(MAF>0.5％,MAF>1％和MAF>5％)的SNP位點進行Q-Q圖的分析，與上述結(jié)果一致。
通過研究發(fā)現(xiàn)，五個提示有關(guān)聯(lián)性(P<1.0×10-3)的編碼區(qū)域的變異位點(四個常見變異和一個低頻變異)也包括在之前報道的GWAS發(fā)現(xiàn)的位點內(nèi)。四個常見變異位點與之前報道的SNP位點有較強的連鎖不平衡，僅有低頻變異(IL-23R基因rs76418789)為獨立的。另外，Q-Q圖(去除MHC區(qū)域內(nèi)SNP位點)尾端分布與標準零分布的Q-Q圖存在偏差，表明存在新的關(guān)聯(lián)位點，有38個新的編碼區(qū)域內(nèi)的變異位點被發(fā)現(xiàn)具有關(guān)聯(lián)性(P<1.0×10-3)。
為進一步研究低頻變異和罕見變異的作用，通過SKAT-O和berden-test的方法對排除MHC區(qū)域內(nèi)的變異位點及已知位點中的5個編碼區(qū)域的變異位點和38個新的編碼區(qū)域內(nèi)的變異位點(P<1.0×10-3)后的SNP位點進行分析。兩種方法均證明基因關(guān)聯(lián)性并非偶然。
驗證階段分析
在中國北方區(qū)域內(nèi)的3,169例麻風(fēng)患者和9,814例健康對照中對38個新發(fā)現(xiàn)的編碼區(qū)域的變異位點及之前GWAS發(fā)現(xiàn)的一個低頻編碼區(qū)域的變異位點進行分型。有34個變異位點可成功分型，其中15個位點在發(fā)現(xiàn)階段和驗證階段是一致的(在驗證階段，P<0.05，OR值的效應(yīng)與發(fā)現(xiàn)階段一致)，6個位點在發(fā)現(xiàn)階段和驗證階段均具有外顯子組分析的統(tǒng)計學(xué)意義(P<1.23×10-6)且沒有遺傳異質(zhì)性，這6個位點分別為：NCKIPSD基因rs145562243(P＝1.44×10-8,OR＝4.35)，CARD9基因rs149308743(P＝4.99×10-10,OR＝4.75)，IL23R基因rs76418789(P＝6.28×10-9,OR＝1.37)，F(xiàn)LG基因rs146466242(P＝1.44×10-10,OR＝1.45)，SLC29A3基因rs780668(P＝2.89×10-7,OR＝1.14)和IL27基因rs181206(P＝5.92×10-7,OR＝0.83)(表3)。
另外，兩個編碼區(qū)域的變異位點：TYK2基因rs55882956(P＝2.75×10-5,OR＝1.29)和USP49基因rs75746803(P＝3.45×10-6,OR＝1.28)在發(fā)現(xiàn)階段和驗證階段與麻風(fēng)均具有一致性和關(guān)聯(lián)性，但僅剛剛達到外顯子組分析的統(tǒng)計學(xué)意義(P<5.0×10-5)(表3)。
其中，對rs145562243、rs149308743、rs76418789、rs146466242、rs55882956、rs780668和rs181206分型采用Sequenom MassARRAY system(Agena Bioscience)，QuantStudioTM 12K Flex Real-Time PCR(Applied Biosystems)和7900HT Fasr Real-Time PCR System(Applied Biosystems)進行，具體方法如下：
1.rs181206、rs780668、rs76418789、rs149308743、rs145562243和rs55882956 的分型
rs181206、rs780668、rs76418789、rs149308743、rs145562243和rs55882956這6個SNP應(yīng)用SEQUENOM基因分型平臺即分子量陣列技術(shù)，SequenomSNP檢測過程結(jié)合多重PCR技術(shù)、MassARRAY iPLEX單堿基延伸技術(shù)，和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight，MALDI-TOF)進行分型檢測。將包含SNP位點區(qū)域的DNA模板通過PCR技術(shù)擴增，再使用特異的延伸引物與PCR產(chǎn)物(表2)進行單堿基延伸反應(yīng)。由于多態(tài)性位點堿基不同，延伸產(chǎn)物不同的末端堿基將導(dǎo)致延伸后的產(chǎn)物分子量的差異，因此由SNP多態(tài)性引起的堿基差異通過分子量的差異而體現(xiàn)，通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)，檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小，應(yīng)用專用的分析軟件，通過判斷分子量的差異而進行SNP
分型檢測。
表2、6個SNP分型引物
操作步驟如下：
6個SNP采用Sequenom MassArray(San Diego，USA)平臺驗證，每個樣本約用到15ngDNA。首先提取外周血的基因組DNA，標準化后，樣本DNA經(jīng)多重PCR反應(yīng)擴增包括SNP位點在內(nèi)的基因組DNA片段，擴增產(chǎn)物進行SNP位點特異性單一鏈的延伸，延伸產(chǎn)物脫鹽并轉(zhuǎn)移到384孔的芯片上。質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)進行等位基因的檢測，采用Sequenom MassARRAY分型軟件對檢測結(jié)果進行分析。
1.1、全血標本采集
在知情同意，并簽署書面同意書的情況下采集研究對象外周靜脈血5ml，放置于EDTANa2抗凝管中，置-80℃冰柜儲存?zhèn)溆谩?/p>
1.2、DNA濃度標準化包括如下步驟：
1)利用NanoDrop-1000濃度測試儀準確測定每一份需要標準化的樣本DNA濃度和OD比值(A260/A280、A260/A230)。
2)建立電子表格，排定每個樣本孔需要加入的DNA編號。
進行Sequenom MassArray分型的樣本，在每96孔板上留有空白對照和重復(fù)樣本對照。
3)按照電子表格的順序，加入已測定濃度的DNA。
對于進行Sequenom MassArray分型的樣本要求實驗濃度為12-30ng/μl，一般以18ng/μl為佳。并且A260/A280比值介于1.5-2.0之間、A260/230介于1.5-2.3，如DNA濃度高于18ng/μl則加入適量FG3，將濃度標化至18ng/μl；如DNA濃度低于12ng/μl，則重新從血液提取合格的DNA。濃度在12-18ng/μl間直接加入。
離心后貼上粘性錫箔紙，并用標記筆標上樣本板標號、樣本類型、來源地等信息。
4)在平板離心機上，3000g離心3分鐘，存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
1.3、利用各SNP的正向引物和反向引物進行多重PCR
1.4、SNP位點特異性單一鏈的延伸反應(yīng)
其中，延伸引物根據(jù)人基因組中SNP位點上游(不包括該SNP位點)設(shè)計，所述延伸引物的最后1位核苷酸對應(yīng)于人基因組中該SNP位點的前1位核苷酸。
1.5、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制
1)對分型的SNP進行call rate計算，去除call rate<95％的SNP或等位基因頻率<0.01的SNPs；
2)對SNP進行遺傳平衡檢驗，去除偏離遺傳平衡定律的SNP(對照樣本中Hardy-Weinberg平衡檢驗的P≦0.001)。
3)在Sequenom MassArray系統(tǒng)中查看SNP的分型聚類圖，去除聚類圖分堆不清的SNP。
4)樣本質(zhì)控：直接去除分型失敗的樣本。
將通過質(zhì)控的樣本和SNP進行統(tǒng)計分析。
1.6、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
利用Plink 1.07軟件對分型成功并通過質(zhì)控的SNP在病例組和對照組做基因表型相關(guān)性分析，用Cochran-Armitage trend檢驗每個樣本的基因型和表型的關(guān)聯(lián)性，然后用Cochran-Mantel-Haenszel綜合分析所有樣本的基因型和表型的相關(guān)性。用Q檢驗來評價個體間的異質(zhì)性，本次實驗中，以p<0.05作為檢驗水準。多重logistic回歸分析用于檢測區(qū)域內(nèi)的信號的獨立性。檢驗水準α以0.05除以通過質(zhì)量控制的SNP數(shù)目為檢驗水準。Q檢驗用于評估遺傳異質(zhì)性的顯著性，對SNP校正檢測后P值小于0.05者視為有顯著遺傳異質(zhì)性。
2.rs146466242的分型
rs146466242應(yīng)用7900HT/Taqman基因分型系統(tǒng)進行SNP分型。
引物及探針序列為：
正向引物rs146466242-F:CCACATAAACCTGGGTCCTTATTAA(序列19)
反向引物rs146466242-R:GGAAAGATCTGATATCTGTAAAGCAAGTG(序列20)
探針1rs146466242-P1:CTTGGATGATCTTTAC(序列21)，5′端由報告熒光染料FAM標記，3′端由淬滅熒光染料NFQ標記
探針2rs146466242-P2:CTTGGATGATCTTAAC(序列22)，5′端由報告熒光染料VIC標記，3′端由淬滅熒光染料NFQ標記
操作步驟如下：
分別抽取每個對象的外周靜脈血5ml，提取基因組DNA，分別基因組DNA(DNA濃度均在50-100ng/微升之間)。
實時熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為：基因組DNA 1μL、2×TaqMan GT master mix(Life technology公司)2.5μL、20×TaqMan探針混合物0.65μL、去離子水0.85μL。將上述反應(yīng)體系加入96孔PCR板中，采用ABI 7900實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃變性30秒，60℃退火1分鐘，40個循環(huán)。
上述反應(yīng)體系中，20×TaqMan探針混合物包括擴增包括rs146466242在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物對和成套探針，其中PCR引物對由上述正向引物和反向引物組成，成套探針由探針1和探針2組成。
反應(yīng)結(jié)束后，采用7900System SDS software進行基因型分型，確定各研究對象rs146466242位點的基因型。
重復(fù)驗證分析
為了進一步驗證8個非同義變異位點(6個外顯子組分析具有統(tǒng)計學(xué)意義的位點和2個提示可能相關(guān)的位點)是否具有關(guān)聯(lián)性，又在中國南方區(qū)域選取三個獨立樣本共2,231例麻風(fēng)患者和2,266例正常對照。然后對所有樣本(7,048例病例和14,398例健康對照)進行分型，其中，對rs145562243、rs149308743、rs76418789、rs146466242、rs55882956、rs780668和rs181206分型采用的具體方法同驗證階段。
然后應(yīng)用固定效果模型對所有樣本(7,048例病例和14,398例健康對照)進行meta分析。7個編碼突變顯示了三個階段中的一致性關(guān)聯(lián)，無異質(zhì)性證據(jù)，并且在所有樣本中有外顯子的顯著性差異(P<0.05/40,491＝1.23×10-6)：兩個罕見突變，位于3p21.31的NCKIPSD基因rs145562243(MAF＝0.4％,P＝1.71×10-9,OR＝4.35)和位于9q34.3的CARD9基因rs149308743(MAF＝0.5％,P＝2.09×10-8,OR＝4.75)；三個低頻變異，位于1p31.3的IL23R基因rs76418789(MAF＝4.32％,P＝1.03×10-10,OR＝1.36)，位于1q21.3的FLG基因rs146466242(MAF＝3.54％,P＝3.39×10-12,OR＝1.45)和位于19p13.2的TYK2基因rs55882956(MAF＝3.63％,P＝1.04×10-6,OR＝1.30)；兩個常見變異，位于10q22.1的SLC29A3基因rs780668(MAF＝42％,P＝2.17×10-9,OR＝1.14)和位于16p11.2的IL27基因rs181206(MAF＝15％,P＝1.08×10-7,OR＝0.83)。雖然在所有獨立性樣本分析中，位于6p21.1的USP49基因rs75746803顯示出一致性，但該位點低于外顯子顯著性水平(MAF＝4.8％,P＝3.57×10-6,OR＝1.25)(表3和圖1)。
7個SNP在7048例麻風(fēng)患者和14398例正常對照中的基因型頻率如表4和表5所示。結(jié)果表明：rs145562243的三個基因型中，TC基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，CC基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例；
rs149308743的三個基因型中，TC基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，CC基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例；
rs76418789的三個基因型中，AA基因型的個體和AG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，GG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例；
rs146466242的三個基因型中，AA基因型的個體和AT基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，TT基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例；
rs55882956的三個基因型中，AA基因型的個體和AG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，GG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例；
rs780668的三個基因型中，TT基因型的個體和TC基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，CC基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例；
rs181206的三個基因型中，AA基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體中的比例，GG基因型和AG基因型的個體在麻風(fēng)患者群體中的比例分別低于對應(yīng)基因型的個體在正常人群體中的比例。
表4、SNP在麻風(fēng)患者和正常群體中的基因型個體數(shù)
表5、SNP在麻風(fēng)患者和正常群體中的基因型頻率
表6、SNP在麻風(fēng)患者群體中的等位基因頻率(％)和與對照相比的變化量
注表4和表5中，rs145562243的基因型中，A1*A1表示CC，A1*A2表示TC，A2*A2表示TT；
rs149308743的基因型中，A1*A1表示CC，A1*A2表示TC，A2*A2表示TT；
rs76418789的基因型中，A1*A1表示AA，A1*A2表示AG，A2*A2表示GG；
rs146466242的基因型中，A1*A1表示AA，A1*A2表示AT，A2*A2表示TT；
rs55882956的基因型中，A1*A1表示AA，A1*A2表示AG，A2*A2表示GG；
rs780668的基因型中，A1*A1表示TT，A1*A2表示TC，A2*A2表示CC；
rs181206的基因型中，A1*A1表示GG，A1*A2表示AG，A2*A2表示AA。
利用二分類的logistic回歸模型(log-additive模型)計算麻風(fēng)患者群體和正常人群體中基因頻率差異性P值，確定SNP有無顯著性意義，其中基因型采用可加模型進行統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs145562243、rs149308743、rs76418789、rs146466242、rs55882956、rs780668和rs181206的各等位基因的基因頻率在正常人群體和麻風(fēng)患者群體中均有顯著性差異。
由表6可知，rs145562243的風(fēng)險等位基因為T，該等位基因在麻風(fēng)患者中的基因頻率為0.0039，在正常對照中的基因頻率為0.0004，與正常對照相比，該等位基因在麻風(fēng)患者中增加了875.00％；rs149308743的風(fēng)險等位基因為T，該等位基因在麻風(fēng)患者中的基因頻率為0.0055，在正常對照中的基因頻率為0.0006，與正常對照相比，該等位基因在麻風(fēng)患者中增加了816.67％；rs76418789的風(fēng)險等位基因為A，該等位基因在麻風(fēng)患者中的基因頻率為0.0610，在正常對照中的基因頻率為0.0432，與正常對照相比，該等位基因在麻風(fēng)患者中增加了41.20％；rs146466242的風(fēng)險等位基因為A，該等位基因在麻風(fēng)患者中的基因頻率為0.0558，在正常對照中的基因頻率為0.0354，與正常對照相比，該等位基因在麻風(fēng)患者中增加了57.63％；rs55882956的風(fēng)險等位基因為A，該等位基因在麻風(fēng)患者中的基因頻率為0.0529，在正常對照中的基因頻率為0.0363，與正常對照相比，該等位基因在麻風(fēng)患者中增加了45.73％；rs780668的風(fēng)險等位基因為T，該等位基因在麻風(fēng)患者中的基因頻率為0.4648，在正常對照中的基因頻率為0.4213，與正常對照相比，該等位基因在麻風(fēng)患者中增加了10.33％；rs181206的風(fēng)險等位基因為A，該等位基因在麻風(fēng)患者中的基因頻率為0.8829，在正常對照中的基因頻率為0.8503，與正常對照相比，該等位基因在麻風(fēng)患者中增加了3.83％。
實驗結(jié)果表明，rs145562243、rs149308743、rs76418789、rs146466242、rs55882956、rs780668和rs181206的多態(tài)性或基因型或等位基因頻率可用于麻風(fēng)患者的篩查。
另外，通過對樣本中年齡和性別信息進行聯(lián)合檢驗，分析了年齡和性別比例的影響。兩個常見突變和三個低頻突變SNPs中的(年齡和性別)未調(diào)整和調(diào)整的ORs非常相似(表7)，揭示了這些SNPs的關(guān)聯(lián)性分析中，性別和年齡有較小的作用。
表7、性別和年齡對兩個常見突變和三個低頻突變SNP影響的分析結(jié)果
次等位基因/主等位基因；
OR,OR根據(jù)次等為基因計算；
(f)指固定效應(yīng)模型。
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