本發(fā)明屬于基因工程及腦血管醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
缺血性腦卒中，又被稱為腦梗塞或腦梗死（中醫(yī)則稱之為中風(fēng)），是指由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化。在我國(guó)，隨著社會(huì)發(fā)展及居民生活方式和飲食習(xí)慣的不斷改變，腦卒中已經(jīng)成為目前我國(guó)人口死亡原因第二位的疾病，嚴(yán)重威脅居民健康。
目前根據(jù)循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)，在積極干預(yù)高血壓、糖尿病、高膽固醇血病、腦血管狹隘等缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素的同時(shí)，抗血小板聚集治療是有效防治腦梗死的基石，可顯著降低中風(fēng)的復(fù)發(fā)率和死亡率。而氯吡格雷是繼阿司匹林之后一個(gè)重要的噻吩并吡啶類抗血小板藥物，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)心腦血管疾病（如心肌梗塞、中風(fēng)或血管性死亡等）具有良好的防治作用。氯吡格雷作為前體藥物，必須通過CPY450酶代謝，生成能抑制血小板聚集的活性代謝物。氯吡格雷的活性代謝產(chǎn)物選擇性的抑制二磷酸腺苷（ADP）與其血小板P2Y12受體的結(jié)合及繼發(fā)的ADP介導(dǎo)的糖蛋白GPIIb/IIIa復(fù)合物的活化，因此抑制血小板聚集。通過阻斷釋放的ADP誘導(dǎo)的血小板活化聚集途徑也可抑制除ADP以外的其他激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板聚集，達(dá)到良好的治療效果。
盡管服用氯吡格雷可以使大部分缺血性腦卒中患者獲得良好收益，但是近年來越多越多的研究發(fā)現(xiàn)，不同患者對(duì)其具有不同的藥物反應(yīng)性。其中，據(jù)報(bào)道，約有4～30%患者服用氯吡格雷后未能達(dá)到充分抑制血小板聚集的作用，卻引發(fā)一系列不良后果，這種現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗。如何克服氯吡格雷抵抗成為廣大臨床醫(yī)生和研究者熱切關(guān)注的問題。眾多遺傳因素，如代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體、核受體基因多態(tài)性被認(rèn)為與其具有緊密關(guān)聯(lián)。單核苷酸多態(tài)性（SNP）被認(rèn)為賦予了個(gè)體不同的表型性狀，以及對(duì)于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)性。因此如果患者在一些重要的相關(guān)調(diào)控基因上具有不同的SNP型，則會(huì)導(dǎo)致不同患者對(duì)氯吡格雷的治療具有不同的反應(yīng)性，因此相關(guān)SNP可能是氯吡格雷抵抗的關(guān)鍵因素。通過篩查氯吡格雷作用的相關(guān)的SNP譜，可以用來篩選氯吡格雷防治的受益人群。如果能夠通過相關(guān)的SNP組合確定哪些缺血性腦卒中患者適合服用氯吡格雷，哪些患者不適合氯吡格雷治療，就能夠在發(fā)病初期確定最佳的用藥方案，減少藥物濫用，達(dá)到良好的治療效果。然而，目前臨床上仍然缺少相關(guān)SNP用于指導(dǎo)合理用藥，是臨床上急需解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種與抗血小板藥氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關(guān)的SNP位點(diǎn)，可用于采用抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中患者的臨床用藥指導(dǎo)，預(yù)防藥物抵抗，增強(qiáng)治療效果。具體是通過分離和研究服用抗血小板藥物氯吡格雷的缺血性腦卒中患者的外周血DNA中的SNP，尋找與氯吡格雷反應(yīng)性差異高度相關(guān)的位點(diǎn)，并研制出可臨床或人群應(yīng)用的氯吡格雷防治缺血性腦卒中的相關(guān)試劑盒，為缺血性腦卒中的防治藥物選擇提供指導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是提供一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關(guān)的SNP標(biāo)志物。
本發(fā)明另一目的是提供上述標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物。
本發(fā)明的再一目的是提供上述標(biāo)志物及其特異性擴(kuò)增引物與特異性延伸引物在制備抗血小板藥物氯吡格雷防治缺血性腦卒中的輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的是提供用于缺血性腦卒中防治用藥指導(dǎo)的輔助診斷試劑盒。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關(guān)的SNP標(biāo)志物，所述SNP標(biāo)志物為 rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的組合，其序列依次分別如SEQ ID NO.1～5所示。上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物為：
rs6686001特異性擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7示；
rs2302429特異性擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
rs2242480特異性擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；
rs4244285特異性擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；
rs2046934特異性擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
上述SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物為：
rs6686001的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.8所示；
rs2302429的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.11所示；
rs2242480的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.14所示；
rs4244285的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.17所示；
rs2046934的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.20所示。
本發(fā)明篩選的上述SNP位點(diǎn)，與抗血小板藥氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關(guān)，可用于采用抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中患者的臨床用藥指導(dǎo)，預(yù)防藥物抵抗，增強(qiáng)治療效果。具體是通過分離和研究服用抗血小板藥物氯吡格雷的缺血性腦卒中患者的外周血DNA中的SNP，尋找與氯吡格雷反應(yīng)性差異高度相關(guān)的位點(diǎn)，并研制出可臨床或人群應(yīng)用的氯吡格雷防治缺血性腦卒中的相關(guān)試劑盒，為缺血性腦卒中的防治藥物選擇提供指導(dǎo)。
因此，以下所述應(yīng)用在都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)：
所述SNP標(biāo)志物在制備與抗血小板藥物氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關(guān)的輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
所述特異性擴(kuò)增引物和/或所述特異性延伸引物在制備與抗血小板藥物氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關(guān)的輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
所述SNP標(biāo)志物及其特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延伸引物在制備指導(dǎo)治療缺血性腦卒的用藥方案的制劑或試劑盒方面的應(yīng)用。
一種與氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關(guān)的輔助診斷試劑盒，該試劑盒中含有檢測(cè)外周血DNA中rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的組分。該試劑盒用于檢測(cè)定外周血DNA中rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的SNP標(biāo)志物組合。
進(jìn)一步地，所述組分包括權(quán)利要求2所述特異性擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求3所述特異性延伸引物。
更進(jìn)一步，優(yōu)選地，所述組分還包括基因檢測(cè)所需的試劑。
優(yōu)選地，所述基因檢測(cè)所需的試劑包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去離子水、標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌返取?/p>
本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料等，采用光比濁法檢測(cè)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率來判定患者是否發(fā)生氯吡格雷抵抗，采用Sequenom MassARRAY基因分型進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)等。具體地，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：
（1）建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。
（2）基因型檢測(cè)：選擇缺血性腦卒中患者將其分為氯吡格雷抵抗組和氯吡格雷非抵抗組，在與氯吡格雷相關(guān)通路范圍內(nèi)找出與防治缺血性腦卒中相關(guān)的陽(yáng)性SNP位點(diǎn)。
（3）氯吡格雷防治缺血性腦卒中的輔助診斷試劑盒的研制：將腦卒中患者根據(jù)是否發(fā)生氯吡格雷抵抗進(jìn)行分層，根據(jù)檢測(cè)出的氯吡格雷相關(guān)SNP基因型分布頻率，找出層間具有顯著差異的SNP，開發(fā)輔助診斷試劑盒。
本發(fā)明選擇了313例缺血性腦卒中患者，其中抵抗組106例，非抵抗組207例。將這兩組人群經(jīng)進(jìn)行檢測(cè)后獲得相關(guān)結(jié)果。
根據(jù)Sequenom MassARRAY的檢測(cè)，本發(fā)明人檢測(cè)并比較得到了在氯吡格雷抵抗組和非抵抗組之間基因型分布頻率在測(cè)層間存在明顯差異的SNP包括rs6686001，rs2302429，rs2242480，rs4244285，rs2046934。
單因素和多因素回歸分析結(jié)果均表明，這5個(gè)SNP與缺血性腦卒中患者的氯吡格雷抵抗現(xiàn)象存在著顯著關(guān)聯(lián)。
進(jìn)一步分析這5個(gè)SNP的組合用于氯吡格雷治療缺血性腦卒中輔助診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠很好的區(qū)分氯吡格雷抵抗和氯吡格雷有效的缺血性腦卒中人群。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于氯吡格雷防治缺血性腦卒中的輔助診斷的試劑盒，包含測(cè)定受試者血DNA標(biāo)本中上述SNP的特異性引物、特異性熒光探針對(duì)和其他檢測(cè)試劑。
具體而言，這5個(gè)SNP的組合，或者這5個(gè)SNP的特異性引物及特異性熒光探針對(duì)的組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于氯吡格雷治療缺血性腦卒中的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的自身狀況，采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
另外，本發(fā)明還提供了一種抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中患者的臨床用藥指導(dǎo)方法，是對(duì)每個(gè)SNP的基因型進(jìn)行評(píng)分，以野生純合型=“0”，其它=“1”，根據(jù)如下公式計(jì)算危險(xiǎn)分值：
危險(xiǎn)分值=（0.749 × rs6686001評(píng)分）+（0.810 × rs2302429評(píng)分）-（0.543 × rs2242480評(píng)分）+（0.671 × rs4244285評(píng)分）-（0.714 × rs2046934評(píng)分）；
根據(jù)危險(xiǎn)分值來評(píng)估受試者是否適合服用氯吡格雷進(jìn)行缺血性腦卒中的防治；cutoff值為0.2275，危險(xiǎn)分值小于0.2275為氯吡格雷抵抗的低風(fēng)險(xiǎn)人群，可以服用氯吡格雷防治缺血性腦卒中；而危險(xiǎn)分值大于0.2275為氯吡格雷抵抗的高風(fēng)險(xiǎn)人群，不宜服用氯吡格雷防治缺血性腦卒中。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明提供的標(biāo)志物序列改變作為氯吡格雷治療缺血性卒中的輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：
（1）SNP標(biāo)志物是一種新型基因生物標(biāo)志物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，在疾病初期就可檢出結(jié)果，可以有效提高疾病診斷及治療相關(guān)的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為缺血性腦卒中患者的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
（2）采用科學(xué)系統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系，本發(fā)明人應(yīng)用Sequenom MassARRAY基因分型方法以獲取疾病候選基因相關(guān)的SNP組合，以上方法保證了SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用。
（3）本發(fā)明獲得的與缺血性腦卒中患者的氯吡格雷抵抗現(xiàn)象相關(guān)的SNP標(biāo)志物和特異性引物，并進(jìn)行了相關(guān)輔助診斷試劑盒的研制。根據(jù)檢測(cè)情況，與臨床的氯吡格雷抵抗現(xiàn)象關(guān)聯(lián)分析，綜合考慮了每個(gè)SNP與氯吡格雷抵抗的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度，通過危險(xiǎn)分值來評(píng)估受試者是否適合服用氯吡格雷進(jìn)行結(jié)缺血性卒中的預(yù)防和治療，對(duì)于具有高抵抗風(fēng)險(xiǎn)的患者采取替代藥物（如替格瑞洛，阿司匹林等），指導(dǎo)臨床用藥，提高藥物療效。
附圖說明
圖1是缺血性腦卒中患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的ROC曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。
實(shí)施例1 研究樣本的選擇收集和樣品資料的整理
1、樣本選擇
（1）年齡 40～80歲，性別不限；
（2）符合全國(guó)第四屆腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)CT或MRI證實(shí)；
（3）以75mg/天（含首次以300mg負(fù)荷劑量服用）口服氯吡格雷5天以上 （含5天）。
2、發(fā)明人共選擇了313例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行單個(gè)Sequenom MassARRAY基因分型的實(shí)驗(yàn)樣品，并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
實(shí)施例2 樣品的血小板聚集率的檢測(cè)——氯吡格雷抵抗的判定
1、采用光比濁法進(jìn)行血小板聚集試驗(yàn)。取EDTA抗凝全血（1：9）2.7 ml，以800rpm離心5min，提取富含血小板血漿，再以3000rpm離心15min，提取貧血小板血漿，血小板計(jì)數(shù)為10～20×109/L，用PPP 調(diào)整 PRP至200～300×109/L，以PPP作空白對(duì)照，37℃預(yù)熱3min，以10μM ADP為誘導(dǎo)劑，光比濁法測(cè)定患者的血小板聚集率。
2、測(cè)定缺血性腦卒中患者服服用氯吡格雷前（day0）和服用氯 吡格雷后（day5）血小板聚集率。若服藥后血小板抑制率小于 10% 或 服用后血聚值 >50%，則認(rèn)為發(fā)生氯吡格雷抵抗；按照此標(biāo)準(zhǔn)將納入患者分為氯吡格雷抵抗組和非抵抗組。
3、通過臨床檢測(cè)患者服用氯吡格雷前后的血小板聚集率的變化，得出有106例病人存在氯吡格雷抵抗現(xiàn)象，207例病人不抵抗。
實(shí)施例3外周血DNA中SNP標(biāo)志物的分型掃描
在上述符合條件的313例缺血性腦卒中患者（其中抵抗組106例，非抵抗組207例）經(jīng)Sequenom MassARRAY分型檢測(cè)獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為：
1、酚-氯仿法提取外周血基因組DNA
（1）取 EDTA 抗凝全血 100 μl，加無菌雙蒸水 200 μl 混勻；
（2）加入 6 M 碘化鈉 200 μl，混勻；
（3）加入氯仿/異戊醇（24：1，v/v）400 μl，反復(fù)混勻，靜置 10 min； 12000 rpm 離心 10 min，吸取上層清液置另一離心管；
（4）向上清液加入異丙醇 300 μl 混勻，靜置 3 min，12000 rpm 離心 10 min， 棄上清；
（5）加入預(yù)冷的 70% 乙醇 500 μl，靜置 3 min，12000 rpm 離心 3 min，棄 去乙醇；
（6）重復(fù)步驟（5）一次，倒置片刻；
（7）樣品放入真空干燥器至完全干燥后，加入TE緩沖液 40 μl 重懸 DNA， 待 DNA 充分溶解后，進(jìn)行純度和濃度的測(cè)定，以- 20℃條件保存。
通常能得到50～100ng/μl DNA，純度(紫外260D與280D比值)在1.6～2.0。
2、DNA 濃度及純度測(cè)定
（1）取樣品20 μl，加超純水至600 μl，充分混勻，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)分 別為260 nm、280 nm、320 nm 時(shí)的OD值，計(jì)算DNA的濃度和純度。
（2）DNA濃度(μg/ml)= (OD260－OD320)×50μg/ml×稀釋倍數(shù)（稀釋30倍）
（3）DNA 純度= (OD260－OD320) / (OD280－OD320)
標(biāo)準(zhǔn) DNA 純度比值為1.8；比值>1.9，表明有RNA污染；比值< 1.6，表 明有蛋白質(zhì)等污染，可用氯仿/異戊醇再次抽提純化。本次所用DNA全部合格。
實(shí)施例4 SNP的Sequenom MassARRAY基因分型：
1、取受試者樣本，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR反應(yīng)和SNP測(cè)定，檢測(cè)并比較氯吡格雷抵抗組和非抵抗組的缺血性腦卒中患者不同基因型的分布差異。
具體方法如下：
（1）引物設(shè)計(jì)：
登錄 Sequenom 網(wǎng)站，利用在線 Assay Design Suite 設(shè)計(jì) Sequenom IPLEX 引（https://seqpws1.sequenom.com/AssayDesignerSuite.html#design:new = Genotyping）
（2）PCR 反應(yīng)體系:
DNA陣列質(zhì)譜基因分型PCR體系為7 μL，其中包括DNA 2 μL，去離子水3.3 μL，10×PCR Buffer with 20 mM MgCl2 0.5 μL，25 mM MgCl2 0.4 μL，25 mM dNTP Mix 0.1 μL，1 μM Primer Mix 0.5 μL，5 U/μL PCR Enzyme 0.2 μL。
（3）PCR反應(yīng)條件如表1：
表1 PCR反應(yīng)條件
（4）SAP反應(yīng)體系：SAP反應(yīng)體系為9 μL，其中包括7 μL PCR產(chǎn)物，去離子水1.53 μL，SAP buffer 0.17 μL，SAP enzyme 0.3 μL。
（5）SAP反應(yīng)條件如表2：
表2 SAP反應(yīng)條件
（6）延伸反應(yīng)體系延伸反應(yīng)體系為11 μL，其中包括9 μL SAP產(chǎn)物，去離子水0.619 μL，iPLEX buffer 0.2 μL，iPLEX termination mix 0.2 μL，Extension primer mix 0.94 μL，iPLEX enzyme 0.041 μL。
（7）延伸反應(yīng)條件如表3：
表3 延伸反應(yīng)條件
（8）芯片點(diǎn)樣及數(shù)據(jù)獲取：用15mg CLEAN 樹脂為樣本除鹽后，應(yīng)用MassARRAY RS1000 將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到96-pad Spectro CHIP上，使用MassARRAY Typer工作站進(jìn)行打譜操作，通過Typer 4軟件獲取數(shù)據(jù)及圖譜。
2、數(shù)據(jù)處理和分析：
利用logistic回歸模型比較在氯吡格雷抵抵抗組和非抵抗組中目標(biāo)基因頻率的分布差異，篩選出存在顯著性差異的5個(gè)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)SNP。具體5個(gè)SNP標(biāo)志物及其擴(kuò)增引物序列見表4和表5。
表4 5個(gè)SNP標(biāo)志物序列
表5 SNP標(biāo)志物的擴(kuò)增引物序列
注：F：Fowward Primer，上游引物序列；R：Reverse Primer，下游引物序列；E：Extended Primer，延伸引物序列。
實(shí)施例5 利用危險(xiǎn)度評(píng)分方法分析SNP與氯吡格雷抵抗的關(guān)系
1、根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明人通過對(duì)抵抗組和非抵抗組樣品進(jìn)行基因型分布頻率的比較，最終選擇出5個(gè)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的，以單個(gè)回歸系數(shù)為權(quán)重，進(jìn)一步求得危險(xiǎn)分值，繪制ROC來評(píng)價(jià)診斷的靈敏性和特異性，進(jìn)而分析這些對(duì)服用抗血小板藥物氯吡格雷發(fā)生抵抗的情況進(jìn)行診斷。對(duì)5個(gè)標(biāo)志物的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)SNP以70.9%的AUC將適合服用氯吡格雷和不適合服用氯吡格雷的腦卒中患者分開（如圖1所示）。
2、因此，本發(fā)明人證明了采用rs6686001， rs2302429， rs2242480， rs4244285， rs2046934的組合能夠很好地區(qū)分適合服用氯吡格雷和不適合服用氯吡格雷的人群。
也就是說，這5個(gè)SNP的組合區(qū)分出的適合服用氯吡格雷的人群適合用這類藥物進(jìn)行預(yù)防或者治療，區(qū)分出的不適合服用氯吡格雷的人群則建議更換其他抗血小板藥物（如替格瑞洛，阿司匹林等）進(jìn)行防治。
實(shí)施例6
運(yùn)用卡方檢驗(yàn)用于分類變量或者t檢驗(yàn)用于連續(xù)性變量比較人口學(xué)特征等在研究對(duì)象組間分布的差異。用logistic回歸分析模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
為了進(jìn)一步研究這5個(gè)SNP構(gòu)成的綜合指征用于評(píng)價(jià)輔助診斷的效果，我們構(gòu)建了一個(gè)數(shù)學(xué)模型，綜合考慮每個(gè)SNP與氯吡格雷抵抗發(fā)生的聯(lián)系強(qiáng)度。具體來說，我們對(duì)每個(gè)SNP的基因型進(jìn)行評(píng)分，以野生純合型=“0”，其它=“1”，以單個(gè)SNP分析時(shí)的logistic回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個(gè)SNP的情況給每個(gè)研究對(duì)象確定一個(gè)危險(xiǎn)分值。
危險(xiǎn)分值的計(jì)算方法如下：
危險(xiǎn)分值=（0.749 × rs6686001評(píng)分）+（0.810 × rs2302429評(píng)分）-（0.543 × rs2242480評(píng)分）+（0.671 × rs4244285評(píng)分）-（0.714 × rs2046934評(píng)分）。
獲得的危險(xiǎn)分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于關(guān)聯(lián)研究的313例樣本中。根據(jù)危險(xiǎn)分值來評(píng)估受試者是否適合服用氯吡格雷進(jìn)行缺血性腦卒中的防治，cutoff值為0.2275，并據(jù)此估算風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)估危險(xiǎn)分值為小于0.2275為氯吡格雷抵抗的低風(fēng)險(xiǎn)人群，可以服用氯吡格雷防治中風(fēng)。而危險(xiǎn)分值大于0.2275為氯吡格雷抵抗的高風(fēng)險(xiǎn)人群，建議換用其它藥物治療。
表6 病例組與對(duì)照組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件（SPSS 21.0）完成工。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平P值設(shè)為0.05，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。
實(shí)施例7吡格雷防治缺血性腦卒中相關(guān)的輔助診斷試劑盒的制作
1、試劑盒的制作和操作流程是基于Sequenom MassARRAY基因分型技術(shù)。
Sequenom MassARRAY對(duì)候選基因通路上單個(gè)檢測(cè)后，在是否發(fā)生氯吡格雷抵抗這一因素下，確定缺血性腦卒中患者基因型分布頻率層間具有顯著差異的，以此作為氯吡格雷防治缺血性腦卒中輔助診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與非氯吡格雷防治缺血性腦卒中輔助診斷相關(guān)的SNP（rs6686001，rs2302429，rs2242480，rs4244285，rs2046934）組成相應(yīng)試劑盒。
試劑盒含有一批SNP特異性引物包括下列引物的引物序列（rs6686001的引物序列為SEQ ID NO.1-3，rs2302429的引物序列為SEQ ID NO.4-6，rs2242480的引物序列為SEQ ID NO.7-9，rs4244285的引物序列為SEQ ID NO.10-12，rs2046934的引物序列為SEQ ID NO.13-15）。
試劑盒還可以含有相應(yīng)技術(shù)所需的常用試劑，如：dNTPs，MgCl2，雙蒸水，Taq酶等，以及用于確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照等。
2、此試劑盒的價(jià)值在于只需要外周血而不需要其它組織樣品，通過最精簡(jiǎn)和特異的引物檢測(cè)SNP，再通過SNP譜指導(dǎo)缺血性腦卒中患者中氯吡格雷的使用，不僅穩(wěn)定，檢測(cè)方便，且精確，可以輔助提高藥物治療的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實(shí)踐，可以幫助指導(dǎo)診斷和更有效的個(gè)體化治療。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大學(xué)，廣州中大南沙科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)園有限公司
<120> 一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 標(biāo)志物rs4244285
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ttcccactat cattgattat ttcccrggaa cccataacaa attacttaaa a 51
<210> 5
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<212> DNA
<213> 標(biāo)志物rs2046934
<400> 5
tctggtgaaa taaaaagatt acaaaygtca tttcaaattc ccaagatgta g 51
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<212> DNA
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ccaaaggtcc ccagg 15
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ccctccttct ccatgta 17
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<213> rs2046934延伸引物
<400> 20
catcttggga atttgaaatg ac 22