本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腦卒中又稱“中風(fēng)”、“腦血管意外”(cerebralvascularaccident，CVA)。是一種急性腦血管疾病，是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性腦卒中又稱腦梗死，中醫(yī)稱之為中風(fēng)。本病系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。缺血性腦卒中依據(jù)發(fā)病機(jī)制的不同分為腦血栓形成、腦栓塞和腔隙性腦梗死等主要類型。其中腦血栓形成是腦梗死最常見的類型，約占全部腦梗死的60％，因而通常所說的‘腦梗死’實際上指的是腦血栓形成。缺血性腦卒中病因：由于缺血性腦卒中的主要分類——腦血栓形成的病因基礎(chǔ)主要為動脈粥樣硬化，因而產(chǎn)生動脈粥樣硬化的因素是發(fā)生腦梗死最常見的病因。由于動脈粥樣硬化好發(fā)于大血管的分叉處和彎曲處，故腦血栓形成的好發(fā)部位為頸動脈的起始部和虹吸部、大腦中動脈起始部、椎動脈及基底動脈中下段等。當(dāng)這些部位的血管內(nèi)膜上的斑塊破裂后，血小板和纖維素等血液中有形成分隨后黏附、聚集、沉積形成血栓，而血栓脫落形成栓子可阻塞遠(yuǎn)端動脈導(dǎo)致缺血性腦卒中。近期在全球范圍內(nèi)進(jìn)行的INTERSTROKE研究結(jié)果顯示：腦梗死風(fēng)險中的90％可歸咎于10個簡單的危險因素，它們依次是高血壓病、吸煙、腰臀比過大、飲食不當(dāng)、缺乏體育鍛煉、糖尿病、過量飲酒、過度的精神壓力及抑郁、有基礎(chǔ)心臟疾病和高脂血癥。腦卒中是我國繼心血管疾病、惡性腫瘤疾病之后的第三大致死性疾病，每年發(fā)病率為150/10萬，死亡率為120/10萬。腦卒中分為缺血卒中和出血性卒中。其中，臨床上缺血性卒中更為常見，約占全部腦卒中的70％。約有50％～75％的腦卒中與高血壓有關(guān)，高血壓史使腦卒中的風(fēng)險增加2.5倍以上。如果應(yīng)用更嚴(yán)格的高血壓定義——血壓＞160/90mmHg，這種風(fēng)險因素的相關(guān)性會增加。缺血性腦卒中的病死率約為10％，致殘率可達(dá)50％以上。存活者的復(fù)發(fā)率高達(dá)40％，缺血性腦卒中復(fù)發(fā)可嚴(yán)重削弱患者的日常生活和社會功能，而且可明顯增加死亡率。目前，識別引起腦卒中的原因是主要根據(jù)頭顱CT掃描，核磁共振成像技術(shù)和動脈造影。但CT、MRI掃描并不是完全可信的方法，因為在診斷早期CT對缺血性腦卒中只有16％的靈敏度，而對于出血性腦卒中卻有89％的靈敏度。20％缺血性腦卒中并不能夠被MRI掃描技術(shù)探測到。且影像診斷技術(shù)并不存在于所有診療中心中，這些都阻礙了腦卒中的快速診斷和藥物的及時應(yīng)用。生物標(biāo)志物是藥物研發(fā)過程中的有效工具，它提供了藥物性能及疾病進(jìn)程的相關(guān)信息，反映了具體的藥物治療效果。糖尿病及免疫性疾病等多種疾病都已經(jīng)根據(jù)生物標(biāo)志物進(jìn)行治療。然而，在腦血管病中生物標(biāo)志物仍相對缺乏。因此，探索缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物有著重要的意義。由于傳統(tǒng)診斷不足，找到診斷腦卒中的新穎的生物標(biāo)志成為了一種迫切的需求。針對辨認(rèn)生物學(xué)標(biāo)志物用iTRAQ和高分辨率的質(zhì)譜來進(jìn)行相對定量是一項很有前途的技術(shù)。識別體液中的缺血性腦卒中生物學(xué)標(biāo)志物對于影像學(xué)診斷具有輔助性作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)腦卒中的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供一種角蛋白，I型細(xì)胞骨架蛋白9(Keratin，typeIcytoskeletal9(KRT9))蛋白在作為缺血性腦卒中生物標(biāo)志物中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種檢測缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物包括KRT9蛋白或其活性片段；編碼所述KRT9蛋白的mRNA；編碼所述KRT9蛋白的基因。本發(fā)明的第二方面提供了所述生物標(biāo)志物在診斷缺血性腦卒中和/或評估罹患缺血性腦卒中風(fēng)險的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三方面提供了所述生物標(biāo)志物在評估腦卒中的治療效果或者判斷腦卒中的預(yù)后產(chǎn)品中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述產(chǎn)品包括芯片或試劑盒。優(yōu)選的，所述KRT9蛋白在缺血性腦卒中生物樣品中表達(dá)上調(diào)。優(yōu)選的，所述檢測包括基因水平的檢測和蛋白水平的檢測。如，所述基因水平的檢測包括real-timePCR法、Northernblot、Southernblot、基因芯片、原位雜交或RNA酶保護(hù)實驗等。所述蛋白水平的檢測包括免疫檢測、Westernblot或蛋白芯片等。為了簡化實驗程序，所述蛋白水平的檢測還包括蛋白檢測試劑盒，如ELISA檢測試劑盒、膠體金檢測試劑盒、免疫共沉淀試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒、免疫熒光試劑盒等。所述試劑盒中一般配備有相應(yīng)的使用說明書，說明書一般包括公司標(biāo)志及名稱、試劑盒名稱、試劑盒組成、保質(zhì)期、使用領(lǐng)域、使用方法等項目，用戶按照說明書不需或只需少量的優(yōu)化即可得到滿意的結(jié)果。優(yōu)選的，所述免疫方法為ELISA法檢測和/或膠體金檢測。所述ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒，所述的試劑盒包括：包被KRT9單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。本發(fā)明的第四方面提供了所述生物標(biāo)志物在篩選預(yù)防或治療腦卒中的藥物的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述KRT9蛋白在缺血性腦卒中生物樣品中表達(dá)上調(diào)。優(yōu)選的，所述的樣品為血液，如血清、血漿或全血。本發(fā)明的第五方面提供了能夠抑制血液中KRT9蛋白表達(dá)的物質(zhì)在制備預(yù)防或治療腦卒中藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第六方面提供了用于檢測腦卒中發(fā)生的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括檢測KRT9蛋白或其活性片段的物質(zhì)。優(yōu)選的，所述系統(tǒng)包括數(shù)據(jù)處理裝置，所述數(shù)據(jù)處理裝置內(nèi)設(shè)采集比較模塊a和處理模塊b，所述采集比較模塊a的功能為：采集并比較待測者與對照者的組織樣本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表達(dá)量；所述處理模塊b的功能為根據(jù)比較的結(jié)果按照如下方法確定待測者是否為腦卒中患者：若所述待測者的組織樣本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表達(dá)量顯著高于所述對照組的組織樣本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表達(dá)量，則所述待測者為或候選為腦卒中患者；反之，則所述待測者不為或候選不為腦卒中患者；所述對照者為健康人。優(yōu)選地，處理模塊b中判斷上調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是待測者的組織樣本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表達(dá)量比對照者至少提高30％。優(yōu)選地，處理模塊b中判斷上調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是待測者的組織樣本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表達(dá)量比對照者至少提高60％。優(yōu)選地，處理模塊b中判斷上調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是待測者的組織樣本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表達(dá)量比對照者至少提高90％。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與腦卒中相關(guān)的蛋白KRT9，并進(jìn)一步證實該KRT9蛋白或其活性片段在腦卒中組織中表達(dá)上調(diào)。利用該蛋白檢測腦卒中不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說明圖1本發(fā)明實施例2中的色譜圖；圖2本發(fā)明實施例3中的KRT9表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法。本發(fā)明的發(fā)明人對6例腦卒中樣本及6例對照樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行篩選，挑選出候選蛋白KRT9，現(xiàn)有研究中并沒有KRT9蛋白和腦卒中相關(guān)的報道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗證，證實了KRT9蛋白在缺血性腦卒中組織中表達(dá)上調(diào)，其相關(guān)產(chǎn)品可用于診斷、治療缺血性腦卒中。本發(fā)明的KRT9蛋白是在本發(fā)明之前的已知蛋白，其基本信息如下：NCBIReferenceSequence：NP_000217.2。本發(fā)明還采用ELISA檢測試劑盒檢測上述蛋白在缺血性腦卒中和正常人群中的表達(dá)，并驗證了該蛋白為缺血性腦卒中中表達(dá)上調(diào)。本發(fā)明應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜的方法鑒定急性缺血性腦卒中患者血清中導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂的蛋白標(biāo)志物。同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術(shù)由ABSCIEX公司研發(fā)的一種體外同種同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)。該技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白酶切后形成多肽，用iTRAQ同位素試劑標(biāo)記多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)。標(biāo)記后的肽段經(jīng)過液相分離，進(jìn)行一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜分析，在二級質(zhì)譜前，被標(biāo)記的不同樣本中的同一肽段表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比和其他理化性質(zhì)。而在二級質(zhì)譜中，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～121)的峰，根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。iTRAQ試劑包括三部分：報告部分、肽反應(yīng)部分、平衡部分。(1)報告部分有八種：113-121(無120)，因此iTRAQ試劑可同時標(biāo)記8組樣品。(2)肽反應(yīng)部分：能與肽段N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基發(fā)生共價連接而標(biāo)記上肽段。(3)平衡部分：保證被標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同。與傳統(tǒng)的雙向電泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢：(1)靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；(2)分離能力強(qiáng)，分析范圍廣，iTRAQ可以對任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；(3)高通量：同時對8個樣本進(jìn)行分析，提高了實驗通量，可同時對多個時間點(diǎn)或不同處理的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析；(4)結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；(5)自動化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。本發(fā)明的了KRT9基因的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次擴(kuò)增，然后再將多次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Soliod-PhasePeptideSynthesis，WHFreemanCo.，SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85：2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。本文使用的術(shù)語“表達(dá)上調(diào)”指對應(yīng)于所表達(dá)基因的序列，其中序列量的測量證明，與從正常個體或從通過腦卒中分期確定與腦卒中不同的已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學(xué)樣品中的同一蛋白相比，所述基因在從患腦卒中或通過腦卒中分期確定的腦卒中已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平升高。根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)上調(diào)”是指通過本發(fā)明方法雜交強(qiáng)度測量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表達(dá)升高，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。本文使用的術(shù)語“表達(dá)水平”指通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文所述的方法測定的給定核酸或蛋白質(zhì)的可測量。涉及本發(fā)明生物標(biāo)志物對應(yīng)的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接變體時，表達(dá)水平可以通過雜交或更多定量測量來測定，例如包括使用SYBR綠、TaqMan和分子信標(biāo)技術(shù)的定量實時RTPCR。本文使用的“對照”指未顯示任何OA癥狀并且未診斷為腦卒中或OA的個體或個體組。優(yōu)選地，所述對照個體未使用影響OA的藥物，并且未診斷為患有任何其他疾病。更優(yōu)選地，對照個體具有與測試樣本相比相似的性別、年齡和體重指標(biāo)(BMI)。根據(jù)本發(fā)明，“對照”還指分離自正常個體的樣品，包括分離自正常個體的總RNA或mRNA。取自對照個體的樣品可包括分離自樣本組織的RNA，其中RNA分離自樣本組織，所述樣本組織分離自組織移除時未診斷為OA并且未顯示任何OA癥狀的個體。本發(fā)明的生物學(xué)樣品血在本發(fā)明的一個方面中，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法從受試者中獲得血樣?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(特別是已知的采血方法)從受試者的任何身體部位(如指、手、腕、臂、腿、足、踝、胃和頸)取血。在一個具體的實施方案中，從受試者獲得靜脈血并根據(jù)本發(fā)明方法使用。可以使用真空管、注射器或蝶形針取血。采血量將取決于采血部位、本發(fā)明方法需要的量和受試者的舒適度而變化。如在多個具體的實施方案中，從受試者收集0.001mL、0.005mL、0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL或更多血。將血保存在K3/EDTA管中。在一個方面中，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的采血方法從正常個體或者從診斷為患腦卒中或懷疑患腦卒中的個體取全血。全血包括可直接使用的血，并包括已經(jīng)根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法(例如優(yōu)選在300-800×g溫和離心5-10分鐘)除去血清或血漿并且已經(jīng)從剩余血樣中分離了RNA或mRNA的血。在一個具體的實施方案中，將得自受試者的全血(即未分級血)與裂解緩沖液(如裂解緩沖液(1L)：0.6gEDTA；1.0gKHCO2，8.2gNH4Cl，用NaOH調(diào)整至到pH7.4)混合，離心樣品并保留細(xì)胞沉淀，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法提取RNA或mRNA(“裂解血”)(參閱如Sambrook等)。優(yōu)選使用全血，因為它避免了昂貴耗時的分離血中細(xì)胞類型的步驟(Kimoto，1998，Mol.Gen.Genet258：233-239；ChellyJ等，1989，Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：2617-2621；ChellyJ等，1988，Nature333：858-860)。在本發(fā)明的一些實施方案中，將收集自受試者的全血進(jìn)行分級(即分離成組分)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)從收集自受試者的全血分離血細(xì)胞。例如，可以對收集自受試者的血進(jìn)行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度離心。這種離心將紅細(xì)胞(血紅細(xì)胞)與各種類型的有核細(xì)胞和血漿分離開。具體地，F(xiàn)icoll-Hypaque梯度離心可用于分離外周血白細(xì)胞(PBL)，它們可根據(jù)本發(fā)明方法使用。其他全血分離方法按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行操作。在根據(jù)本發(fā)明方法使用前，任選地(但優(yōu)選)將收集的生物學(xué)樣品保存在低溫如4℃下。在一些實施方案中，在第一時間根據(jù)本發(fā)明方法使用樣品的一部分，而將一個或多個剩余的樣品部分保存一段時間以備后用。該段時間可以是1小時或更長、1天或更長、1周或更長、1月或更長、1年或更長或不確定。就長期保存而言，可以使用本領(lǐng)域熟知的保存方法，例如在冷凍溫度(如低于-80℃)保存。在一些實施方案中，作為保存樣品的補(bǔ)充或替代，將分離的核酸或蛋白質(zhì)保存一段時間(如1小時或更長、1天或更長、1周或更長、1月或更長、1年或更長或不確定)以備后用。實施例1樣本的收集取2015年06月到2015年12月期間在解放軍火箭軍總醫(yī)院就診缺血性腦卒中患者，病例組共收集6例，對照來源于同時期來解放軍火箭軍總醫(yī)院體檢但各項指標(biāo)均正常的健康志愿者，共收集6例，具體信息如表1所示。獲取所有研究對象的肘正中靜脈血，5ml，4度冰箱靜置1h，離心1500rpm、10min，取上清，離心1500rpm、10min，取上清，分裝保存于-80度冰箱。表1樣本信息實施例2iTRAQ實驗篩選差異蛋白一、所用儀器和試劑渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-901)恒溫孵浴器(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司，型號：HH.S4)真空冷凍干燥機(jī)(Thermo，型號：SPD2010-230)RIGOLL-3000高效液相色譜系統(tǒng)(北京普源精電科技有限公司)，流動相A：98％ddH2O，2％乙腈(pH10)；流動相B：98％乙腈，2％ddH2O(pH10)高效液相色譜儀：(ThermoScienticEASY-nLC1000System(NanoHPLC))，流動相A：100％超純水，0.1％甲酸；流動相B：100％乙腈，0.1％甲酸質(zhì)譜系統(tǒng)(Thermo，型號：Q-Exactive)Blue白蛋白IgG去除試劑盒(Sigma-Aldrich，貨號：PROTBA-1KT)DTT(Bio-Rad，貨號：161-0611，美國)碘乙酰胺(Bio-Rad，貨號：163-2109，美國)試劑盒中的DissolutionBuffer(ABSciex，PN：4381664)胰酶(Promega，貨號：V5111，美國)10K超濾管(milipore，PN：UFC5010BK)8標(biāo)試劑盒(ABSciex，PN：4390812，PN：4381664)Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2μg))色譜柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，(Agela，貨號：DC952505-0)乙腈(Merck，貨號：100030，德國)氨水(Sigma-Aldrich，貨號：17837，美國)二、iTRAQ定量實驗流程2.1樣本蛋白處理2.11、平衡柱子1)緩慢顛倒培養(yǎng)液，渦旋混勻培養(yǎng)液；2)取0.4ml培養(yǎng)液到柱子中，保證培養(yǎng)液是混勻的；3)將柱子放入2ml收集管中，以10000rpm(8000g)的速度離心5-10s；4)加0.4ml平衡緩沖液到柱子中，以10000rpm(8000g)的速度離心5-10s，將2ml收集管中的緩沖液倒掉，并將柱子再次放到原來的2ml離心管中；5)再加0.4ml平衡緩沖液到柱子中，以10000rpm(8000g)的速度離心20-40s，將2ml收集管中的緩沖液倒掉，并將柱子放到一個新的2ml離心管中。2.12、去除血清中的白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)1)加25-100ul血清樣本到處理過的柱子中，并在室溫下孵育5-10min；2)離心柱子和收集管，10000-12000rpm(8000-12000g)*60s；3)再將收集管中的洗出液加入到柱子中，室溫下孵育5-10min；這一步去除了超過5％的白蛋白；4)在同一個收集管中離心柱子10000-12000rpm(8000-12000g)*60s；5)經(jīng)過兩次洗脫留在收集管中的血清與第六步清洗步驟的液體混合；6)洗脫柱子中殘余未綁定蛋白：柱子中加入100ul平衡緩沖液，離心；10000-12000rpm(8000-12000g)*60s，將第4、6兩步驟收集管中得到的液體混合；7)去除白蛋白和IgG的血清可在-20℃長期貯存。2.2Bradford法蛋白定量采用Bradford法[MarionM.Bradford.AnalyticalBiochemistry，1976，72：248-254]測定樣本提取的蛋白濃度。得到各樣品蛋白濃度(見表2)表2蛋白樣品濃度2.3蛋白酶解(FilterAidedSamplePreparation，F(xiàn)ASP)1)蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于離心管中；2)加入終濃度25mMDTT，60度反應(yīng)1小時；3)加入終濃度50mM碘乙酰胺，室溫10分鐘；4)將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中，12,000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄掉收集管底部溶液；5)加入iTRAQ試劑盒中的DissolutionBuffer100μl，12,000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3次；6)更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量4μg(與蛋白質(zhì)量比1∶50)，體積50μl，37攝氏度反應(yīng)過夜；7)次日，12,000轉(zhuǎn)離心20分鐘，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；8)在超濾管中加入50μlDissolutionBuffer，12,000轉(zhuǎn)再次離心20分鐘，與上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的樣品。2.4iTRAQ標(biāo)記1)從冰箱中取出iTRAQ試劑，平衡到室溫，將試劑離心至管底；2)向每管試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底；2)取50μl樣品(100μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中；4)將iTRAQ試劑填加到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)2小時；5)加入100μl水終止反應(yīng)；6)為了檢測標(biāo)記效率及定量準(zhǔn)確性，從4組樣品中各取出1ul混合，用Ziptip脫鹽后進(jìn)行MALDI-TOF-TOF(ABSCIEX4800Plus)鑒定，確認(rèn)標(biāo)記反應(yīng)良好；7)混合標(biāo)記后的樣品，渦旋振蕩，離心至管底；8)真空冷凍離心干燥；9)抽干后的樣品冷凍保存待用；10)酶解肽段離線預(yù)分離及LC-MS/MS質(zhì)譜分析。2.5高pH條件下的反相色譜分離1)混合標(biāo)記后的樣品用100μl流動相A溶解，14000g離心20min，取上清待用；2)使用400μg酶解好的BSA進(jìn)行分離(柱溫45℃，檢測波長214nm)，檢測系統(tǒng)情況；3)取100μl準(zhǔn)備好的樣本上樣；4)流速0.7ml/min，分離梯度如表3所示，色譜圖如圖1所示。表3反相色譜分離梯度2.6納升級反相色譜-QExactive進(jìn)行蛋白質(zhì)分析1)將高pH反相分離得到的組份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸復(fù)溶；2)12,000轉(zhuǎn)離心10分鐘，吸取上清上樣；3)上樣體積10μl，采取夾心法上樣；4)LoadingPump流速350nl/min，15分鐘；5)分離流速300nl/min，分離梯度如表4所示。表4納升級反相色譜分離梯度三、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和結(jié)果數(shù)據(jù)庫的選擇是以所需物種、數(shù)據(jù)庫注釋完備性及序列可靠性為參考依據(jù)的。在本次實驗中選擇的數(shù)據(jù)庫來自UniProt(http://www.uniprot.org/)，數(shù)據(jù)庫本版為：UniProt_Susscrofa_201510.fasta。iTRAQ的質(zhì)譜分析是由ThermoQ-Exactive型質(zhì)譜完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件*.RAW采用Thermo公司的配套商用軟件ProteomeDiscoverer1.4處理。本次iTRAQ實驗共鑒定到272個總蛋白，其分析到差異蛋白14個。為了更好的理解差異蛋白的功能，我們對差異蛋白進(jìn)行了GeneOnlogy和信號通路分析，并對差異蛋白進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異蛋白KRT9，該蛋白在缺血性腦卒中樣本中表達(dá)上調(diào)。實施例3大樣本驗證差異蛋白KRT9的表達(dá)1、取樣取2014年01月到2015年12月期間在解放軍火箭軍總醫(yī)院就診缺血性腦卒中患者，病例組共收集20例，分別標(biāo)號為A1-A20，對照來源于同時期來解放軍火箭軍總醫(yī)院體檢但各項指標(biāo)均正常的健康志愿者，共收集10例，分別標(biāo)號為B1-B10。獲取所有研究對象的肘正中靜脈血，5ml，4度冰箱靜置1h，離心1500rpm、10min，取上清，離心1500rpm、10min，取上清，分裝保存于-80度冰箱。2、實驗過程實驗選用人角蛋白，I型細(xì)胞骨架蛋白9(KRT9)ELISA試劑盒(購買自廈門慧嘉生物科技有限公司)該人角蛋白，I型細(xì)胞骨架蛋白9(KRT9)ELISA檢測試劑盒操作步驟如下：(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300pg/ml，150pg/ml，75pg/ml，37.5pg/ml，18.5pg/ml，9pg/ml，4.5pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。(2)加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。(3)棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μl(取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制)，37℃，60分鐘。(4)溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡l-2分鐘，350μl/每孔，甩干。(5)每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液)100μl，37℃，60分鐘。(6)溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。(7)依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色(30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止)。(8)依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。(9)用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。3結(jié)果獲得7個標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，如表5所示，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。實驗得到了20個樣本的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中KRT9的濃度，其結(jié)果如表6所示。其中，樣品的OD值為三個副孔去背景后的OD均值。統(tǒng)計學(xué)分析表6中數(shù)據(jù)，可知20個樣本的濃度值在70-90pg/ml之間，對照樣本的濃度均值為54.904pg/ml，上述差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，上述結(jié)果表明，KRT9蛋白在缺血性腦卒中樣本中表達(dá)水平升高，提高在30％以上。表57個標(biāo)準(zhǔn)品的OD值標(biāo)準(zhǔn)品1234567濃度(pg/m1)4.5918.537.575150300OD值0.0810.1170.2200.3150.4330.5290.715表6樣品和對照的OD值和濃度值實施例4ELISA評價腦卒中的治療效果樣本選用實施例1中的6例缺血性腦卒中病人，KRT9蛋白的ELISA操作同實施例3，治療前檢測血清中KRT9蛋白水平，跟蹤隨訪這6位患者，療程結(jié)束后再檢測血清中KRT9蛋白水平，對比血清中KRT9蛋白含量變化，具體KRT9蛋白的表達(dá)水平參見表7。從表7中KRT9含量變化與治療效果的比較可以看出，臨床治療效果越顯著的患者，其血清中KRT9蛋白水平升高的越多；臨床治療效果不明顯的患者，其血清中KRT9蛋白水平無明顯變化。該結(jié)果表明，檢測血清中KRT9蛋白水平可對缺血性腦卒中治療效果進(jìn)行評估，即KRT9蛋白在評估腦卒中的治療效果或者判斷腦卒中的預(yù)后產(chǎn)品中有應(yīng)用前景。表7臨床檢測缺血性腦卒中治療前后KRT9水平雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3