本發(fā)明涉及分子標(biāo)記應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一組與清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

清遠(yuǎn)麻雞作為國內(nèi)馳名的優(yōu)質(zhì)地方品種，深受消費(fèi)者喜愛。標(biāo)準(zhǔn)清遠(yuǎn)麻雞的外貌特征為：公雞胸部為純黑色無雜色，背部整體為紅色，其飛羽半紅半黑；母雞胸部顏色為淺橙色無雜色，背部褐色且有不規(guī)則分布的麻點(diǎn)。

實(shí)際育種過程中育種者一般通過觀察個(gè)體表型對清遠(yuǎn)麻雞的羽色進(jìn)行選擇，但是由于羽色的復(fù)雜性，關(guān)于其羽色的選育進(jìn)展到一定程度后，進(jìn)展非常緩慢，始終有一定比例（5～10%）的非標(biāo)準(zhǔn)羽色（如：公雞的胸部有黃色的橫斑存在，母雞的胸部有黑色的橫斑存在）。育種者為了解決羽色統(tǒng)一的問題一般采用測交的方法，其做法是標(biāo)記每只母雞個(gè)體的蛋，待出孵后至羽色穩(wěn)定觀察并記錄其羽色，根據(jù)后代羽色淘汰不合格的父母代母雞。該方法有以下缺點(diǎn)：（1）周期長，從入孵到能夠判定羽色至少需要3個(gè)月時(shí)間；（2）工作量大，每只母雞的蛋必須標(biāo)記清楚；（3）過程繁瑣，容易出錯(cuò)，其過程為首先需要在產(chǎn)蛋舍記錄每只種蛋的母親，然后需要在孵化機(jī)內(nèi)對種蛋分組孵化，出雛后對分組的個(gè)體帶翅號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，然后是60日齡左右的時(shí)候?qū)﹄u只進(jìn)行表型鑒定確認(rèn)需要淘汰的母雞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種與清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色相關(guān)的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述分子標(biāo)記的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種選育清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色個(gè)體的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一組與清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色相關(guān)的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為MC1R基因從N端起第668位的T/C堿基突變，和第730位的G/A堿基突變，和第854位的T/C堿基突變，和第883位的A/G堿基突變，和第1100位的A/C堿基突變。

本發(fā)明檢測了具有標(biāo)準(zhǔn)羽色的清遠(yuǎn)麻雞相關(guān)突變位點(diǎn)組成的單倍型情況。結(jié)果顯示所檢測的24個(gè)個(gè)體中的48個(gè)單倍型中，有44個(gè)為hap_1（對應(yīng)野生型等位基因e+），4個(gè)為非e+等位基因，上述結(jié)果初步說明了e+等位基因是導(dǎo)致清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色的致因突變。

因此，若樣本DNA序列的第668位的T/C堿基突變，和第730位的G/A堿基突變，和第854位的T/C堿基突變，和第883位的A/G堿基突變，和第1100位的A/C堿基突變，即為清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色。

因此本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在清遠(yuǎn)麻雞羽性狀輔助選擇中的應(yīng)用。

不同的毛色相關(guān)基因的變異導(dǎo)致了個(gè)體不同的毛色表型。通過研究確認(rèn)了清遠(yuǎn)麻雞羽色相關(guān)的基因變異，當(dāng)把控制清遠(yuǎn)麻雞羽色的等位基因純合后，羽色則不再出現(xiàn)分離；符合清遠(yuǎn)麻雞羽色標(biāo)準(zhǔn)的公母雞交配，總會(huì)出現(xiàn)一定比例不符合清遠(yuǎn)麻雞羽色標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體，這是生產(chǎn)中不想出現(xiàn)的。本發(fā)明通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法選擇符合要求的個(gè)體，淘汰不合格的個(gè)體，從而建立清遠(yuǎn)麻雞純系，該純系純繁時(shí)99.5%的個(gè)體符合清遠(yuǎn)麻雞的羽色要求。

本發(fā)明還提供一種篩選標(biāo)準(zhǔn)羽色清遠(yuǎn)麻雞的方法，具體是測定待測清遠(yuǎn)麻雞MC1R基因的N端起第668位、第730位、第854位、第883位和第1100位的堿基，如果第668位、第730位、第854位、第883位和第1100位的堿基分別是T、G、T、A、A，則待測清遠(yuǎn)麻雞為標(biāo)準(zhǔn)羽色清遠(yuǎn)麻雞，否則不是標(biāo)準(zhǔn)羽色清遠(yuǎn)麻雞。

更具體地，所述方法是設(shè)計(jì)引物MC1R-F和MC1R-R，對待測清遠(yuǎn)麻雞的MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，若擴(kuò)增產(chǎn)物從N起第668位的堿基為T，第730位的堿基為G，第854位的堿基為T，第883位的堿基為A，第1100位的堿基為A，則待測清遠(yuǎn)麻雞為標(biāo)準(zhǔn)羽色的清遠(yuǎn)麻雞，否則，待測清遠(yuǎn)麻雞為雜合羽色的清遠(yuǎn)麻雞；所述引物MC1R-F和MC1R-R的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：DNA 1μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL、MC1R-F 0.3μL、MC1R-R 0.3μL，雙蒸水補(bǔ)足30μL。

優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增的條件為：（1）95℃ 3min，94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 60s，35個(gè)循環(huán)；（2）72℃ 3min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一組與清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色相關(guān)的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為MC1R基因從N端起第668位的T/C堿基突變，和第730位的G/A堿基突變，和第854位的T/C堿基突變，和第883位的A/G堿基突變，和第1100位的A/C堿基突變；利用該分子標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增待測樣本，即可挑出清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色的純合子，從而剔除清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色的雜合子個(gè)體，將其遺傳背景統(tǒng)一，建立清遠(yuǎn)麻雞純系；該純系自繁時(shí)99.5%的個(gè)體符合清遠(yuǎn)麻雞的羽色要求。該方法準(zhǔn)確率接近100%，操作簡便，用時(shí)短，速度快，從拿到待檢個(gè)體血樣到?jīng)Q定被檢個(gè)體的選淘只需要2天時(shí)間，每人每天至少可以完成144個(gè)體的檢測，具有廣泛且實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若無特別說明，實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法和技術(shù)，試劑或材料均為通過商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1 標(biāo)準(zhǔn)羽色清遠(yuǎn)麻雞相關(guān)基因突變檢測

一、引物設(shè)計(jì)與合成

以NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列（GenBank：D78272.1，序列如SEQ ID NO：1所示）為模板，利用genetool設(shè)計(jì)引物，引物序列以及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1，引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

二、被檢個(gè)體樣本采集

選擇符合清遠(yuǎn)麻雞羽色標(biāo)準(zhǔn)的清遠(yuǎn)麻雞24個(gè)個(gè)體。采用一次性注射器從雞翅下靜脈中抽取約1mL血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約200μL 2%無菌EDTA（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝劑的1.5mL離心管中，輕輕搖勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、DNA 抽提

基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法（奧斯泊F等，1998）：

（1）取全血30μL置于1.5mL離心管，分別加入470μL1×SET緩沖液、12.5μL20%SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55℃水浴過夜；

（2）取出樣本于1.5mL離心管，加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

（3）取上清，再次加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

（4）取上清，加入500μL氯仿-異戊醇（23：1）輕搖20min，10,000rpm離心10min；

（5）取上清，加入1mL冰無水乙醇（-20℃），來回?fù)u擺以沉淀DNA，10,000rpm離心10min后倒出乙醇；

（6）用1mL75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱內(nèi)烘干；

（7）待DNA完全干燥后加入300μL滅菌后的雙蒸水溶解，50℃水浴鍋中過夜以溶解DNA；

（8）存放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

四、PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系：DNA 1μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL、MC1R-F 0.3μL、MC1R-R 0.3μL，雙蒸水補(bǔ)足30μL。

反應(yīng)條件為：（1）95℃ 3min，94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 60s，35個(gè)循環(huán)；（2）72℃ 3min。

反應(yīng)后進(jìn)行測序：（1）測序所得結(jié)果采用DNAstar中SeqMan功能模塊進(jìn)行拼接組裝，利用MegAlign模塊進(jìn)行序列比對篩選變異位點(diǎn)。并且將每個(gè)個(gè)體的測序結(jié)果整理出來，雜合子使用簡并堿基代碼標(biāo)記；（2）將步驟（1）中整理的測序結(jié)果，導(dǎo)入軟件DNAsp5.0，輸出被檢個(gè)體的單倍型情況，結(jié)果如表2。

對上述結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3，結(jié)果說明，清遠(yuǎn)麻雞羽色的致因等位基因?yàn)閔ap_1（即e+），可用該等位基因?qū)η暹h(yuǎn)麻雞的羽色進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。

實(shí)施例2 清遠(yuǎn)麻雞羽色的分子標(biāo)記輔助選擇

由實(shí)施例1中的結(jié)果可知，控制清遠(yuǎn)麻雞羽色的等位基因是hap_1（即e+），本實(shí)施例通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法，將上述等位基因（hap_1）純合的個(gè)體挑選出來組成新的群體進(jìn)行自繁，并且觀察后代的羽色情況。

經(jīng)過分子標(biāo)記輔助選擇，hap_1等位基因純合的公雞個(gè)體10只，母雞個(gè)體100只。

將純合的個(gè)體挑選出來組成新的群體進(jìn)行自繁的過程為：

（1）人工受精以及集蛋

用選出的個(gè)體組成新的群體進(jìn)行自繁，混精受精。組成新群體7天后開始集蛋。連續(xù)集蛋7天。

（2）孵化：按照孵化要求將搜集的種蛋進(jìn)行孵化。

（3）后代羽色表型的觀察統(tǒng)計(jì)

將得到的580羽后代（公295，母285）飼養(yǎng)至120天，觀察羽色情況。結(jié)果顯示293只公雞羽色符合清遠(yuǎn)麻雞公雞的標(biāo)準(zhǔn)羽色，284只的母雞符合清遠(yuǎn)麻雞母雞的標(biāo)準(zhǔn)羽色，后代99.5%的個(gè)體符合清遠(yuǎn)麻雞的羽色要求。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一組與清遠(yuǎn)麻雞標(biāo)準(zhǔn)羽色相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1538

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增片段

<400> 1

atcccaaggt acacagtgac ccgctgtgca cggtgcccca gcatggctca gcccccagct 60

accggggcac aggctgtcat gtgcgtgccc acccttctca ggaggaggag ccgagggagc 120

cagctttaaa tcaggacaga gaaagggccc tttcttcccc atcaccgccg ctgagccctc 180

tctgagctcc ggatacgccg ggcagtgccg gtggggaggg cggccgagac agcggagtcc 240

ccgcgctgct gcccagaggg ctcccgggtg ggggaccgct tccccatcct tgtgcctggg 300

gtgcagaggt gcccacatcc cctctgcctc gtgaccgcgt gctgcgggag cactggtggg 360

gctggttggg cgcacggggg ctttgtaggt gctgcagttg tgcctcgggg ccacggcctc 420

cagccagggc ggtccctggg ggctgaggcc ggggccatgt cgatgctggc ccccctgcgc 480

ctcgtgcgcg agccctggaa cgccagtgag ggcaaccaga gcaatgccac ggccggggcc 540

ggaggtgcct ggtgccaggg gctggacatc cccaatgagc tcttcctgac gctggggctg 600

gtgagcctgg tggagaacct gctggtggtg gccgccatcc tcaagaacag gaatctgcac 660

tcgcccatgt actacttcat ctgctgcctg gccgtctccg acatgctggt gagcgtcagc 720

aacctggccg agacgctctt catgctgctg atggagcacg gcgtgctggt gatccgcgcc 780

agcatcgtcc gccacatgga caatgtcatc gacatgctca tctgcagctc cgtcgtgtcc 840

tccctctcct tcctgggggt catcgccgtg gaccgctaca tcaccatctt ctatgcgctg 900

cgctaccaca gcatcatgac gctgcagcgc gccgtggtca ccatggccag cgtctggctg 960

gccagcaccg tctccagcac cgtcttaatc acctactacc gcaacaacgc catcctgctc 1020

tgcctcattg gcttcttcct cttcatgctg gtcctcatgc tggtgctcta cattcacatg 1080

ttcgcgctgg cgcgccacca cgtgcgcagc atctccagcc agcagaagca gcccaccatc 1140

taccgcacca gcagcctgaa gggagccgtc acgctcacca tcctgctggg agtcttcttc 1200

atctgctggg ggcccttctt cttccacctc atcctcatcg tcacctgccc caccaacccc 1260

ttctgcacct gcttcttcag ctatttcaac ctcttcctca tcctcatcat ctgcaattca 1320

gtggtcgatc ccctgatcta tgccttccgg agccaggagc tccggcggac gctgcgggag 1380

gtggtgctgt gctcctggta ggaggcggca cagacaggag gatggatgga tggatggatg 1440

gacggatgga cggatggatg gatggacaaa cagatgggtg gatggacaga tgggtggatg 1500

gacaaacaga cgcaccgcgg ggtgtcccct gggtgccc 1538

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> MC1R-F

<400> 2

atcccaaggt acacagtgac 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> MC1R-R

<400> 3

gggcacccag gggacacc 18