本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，具體涉及一種采用新型雙熒光標記方法的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
：STR遺傳標記又稱微衛(wèi)星DNA，其廣泛存在于原核及真核生物基因組中，是一類由2～6個核苷酸為重復單元組成的幾十至一百多個的核苷酸重復序列。不同數(shù)目的核心序列呈串聯(lián)重復排列，而長度呈現(xiàn)多態(tài)性。根據(jù)兩端保守性序列，設計引物，進行PCR，然后通過聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳等檢測STR遺傳標記的多態(tài)性。個體識別DNA熒光檢測試劑盒主要采用目前應用最為廣泛的多重PCR復合擴增和多色熒光標記毛細管電泳檢測技術(shù)，用于生物學檢材的DNA基因分型。根據(jù)國內(nèi)外已有的和我們自己在STR基因座方面的研究成果，并依據(jù)這些基因座在人群中等位基因頻率分布的特點，我們選擇在人群中具有較高的多態(tài)性和雜合度的基因座，在這些基因座附近設計引物并分別在引物上標記熒光素，通過多重PCR擴增體系，對多態(tài)性STR基因座進行特異性擴增，然后與已知長度并標有熒光素的分子量標準品混合，在遺傳分析儀或測序儀上電泳并收集電泳信息，繼而對STR基因座的PCR產(chǎn)物分別進行長度和基因型分析，獲取所需數(shù)據(jù)，達到個體識別的目的。目前市場上國產(chǎn)試劑盒一般采用FAM、HEX、TAMRA、ROX、ATTO633對引物和內(nèi)標進行標記，測序儀采用的是單一激光，波長為488nm，而FAM，HEX，TAMRA，ROX和ATTO633這5種熒光染料激發(fā)波長卻分布在500nm-650nm。隨著染料激發(fā)波長的變大，相同量熒光標記產(chǎn)物，被測序儀激光激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號逐漸減少，TAMRA和ROX熒光效率遠遠低于FAM、HEX。特別的，ROX染料標記比FAM標記，相同量的產(chǎn)物，信號強度只有四分之一到八分之一，在這樣大的熒光效率差異下，獲得各個熒光通道間的較好的均衡性以及較高的靈敏度變的很困難。本發(fā)明使用一種新型雙熒光標記方法，可以實現(xiàn)熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET，fluorescenceenergytransfer)。熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當一個熒光分子(又稱為供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(又稱為受體)的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。FRET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為7～10nm時即可發(fā)生FRET；隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱。供體和受體之間FRET的效率，可以由E＝1/1+(R/R0)6反映，其中R表示供體和受體之間的距離，R0表示福氏半徑，依賴供體發(fā)射譜和受體激發(fā)譜的重疊程度，以及供體和受體能量轉(zhuǎn)移的偶極子的相對方位。目前市場上同類型的常染色體STR試劑盒見表1，本發(fā)明與Promega公司的PowerPlex21基因座的選擇完全一致，21個基因座包含了13個CODIS和新增的4個CODIS位點，3個在中國人群中具有很高多態(tài)性的PentaD，PentaE和D6S1043，以及一個性別識別位點Amelogenin。既包含了所有CODIS基因座，又選擇了3個高多態(tài)性的基因座，提高了整體的分辨率。這21個基因座也是目前能夠錄入常染色體數(shù)據(jù)庫的所有的21個基因座，所以，選擇這21個基因座是目前性價比最高的方案。表1與市面上主流商業(yè)化常染色體STR熒光檢測試劑盒基因座對比。注：粗體的為13個CODIS基因座，下劃線的為4個新增CODIS基因座。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種新型熒光染料的標記方法制備的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒，并應用于人類常染色體21個STR基因座的復合擴增，具有擴增快速、均衡性好、靈敏度高的特點，滿足中國人群個體識別，親子鑒定，常染色體DNA建庫需求。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種采用新型雙熒光標記方法的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒，包括：21對特異性引物的復合引物組、復合擴增21個基因座、反應混合液以及熱啟動Taq酶；所述復合擴增21個基因座包括Amelogenin，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，F(xiàn)GA，D2S1338，D19S433，D1S1656，D12S391，PentaD，PentaE和D6S1043；所述反應混合液的組成為：MgCl25mM、Tris-HCl125mMpH8.325℃，KCl125mM，dNTPs0.5mM，BSA1.5g/L；所述dNTPs為dATP、dTTP、dCTP、dGTP的等摩爾混合物；所述21對特異性引物的復合引物組的21個基因座的引物對的序列包括SEQIDNO.01-SEQIDNO.42；所述21對特異性引物的復合引物組的各STR基因座采用分別位于該基因座核心重復區(qū)兩側(cè)的一對引物擴增，其中每對引物中至少有一條引物采用新型雙熒光染料標記方法進行標記；所述21對特異性引物的復合引物組的21個基因座的引物對分為四組采用新型雙熒光染料標記方法進行標記；所述四組包括第一組：D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，PentaE；SEQIDNO.01-SEQIDNO.10；第二組：D8S1179，D21S11，D16S539，D2S1338，PentaD；SEQIDNO.11-SEQIDNO.20；第三組：D19S433，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D6S1043；SEQIDNO.21-SEQIDNO.32；第四組：Amelogenin，D1S1656，D5S818，D12S391，F(xiàn)GA；SEQIDNO.33-SEQIDNO.42。優(yōu)選地，所述新型雙熒光標記方法包括在引物5’端第一個堿基用FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一種進行標記；其中，用FAM、TAMRA和ROX標記的引物，引物5’和3’中間一個堿基用FAM進行標記；用HEX標記的引物，引物5’和3’中間一個堿基用HEX進行標記。本發(fā)明所述的采用新型雙熒光標記方法的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：將試劑盒內(nèi)試劑與樣品DNA混合、裝入PCR擴增管，置于熱循環(huán)儀上，進行PCR擴增，擴增程序為：95℃3min；94℃5s、60℃1min，26-28個循環(huán)；60℃終延伸10min；4-16℃保持；得到擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物在遺傳分析儀上進行熒光檢測，再用片段分析軟件分析基因測序儀上檢測到的數(shù)據(jù)；所述樣品DNA包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有機抽提法中任意一種方法提取的人基因組DNA，提取檢材的來源包括人的血液、血痕、精液、唾液、體液、毛發(fā)、肌肉或組織器官，或者利用免提取的濾紙、FTA卡、棉簽、紗布中任意一種載體收集的人類血液或口腔細胞。本發(fā)明所述的采用新型熒光染料標記方法的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒，可應用于中國人群的個體識別、親子鑒定、DNA建庫等方面。本發(fā)明的有益效果是：1、采用新型熒光標記技術(shù)，熒光效率高，從而擴增速度更快、均衡性更好，靈敏度更高；2、本試劑盒是包含21個常染色體STR基因座的高度復合擴增系統(tǒng)，21個基因座與我國DNA建庫錄入的21個基因座完全一致，系統(tǒng)高度兼容；3、本試劑盒具有很強的檢材適應性，即一種試劑盒可以擴增多種檢材的樣本，不同檢材的樣本包括：利用Chelex100法、磁珠提取法或有機法抽提法中任意一種提取的人基因組DNA及濾紙、FTA卡、棉簽、紗布等任意一種載體收集的人類血液或口腔細胞；4、本試劑盒通過設計特異性引物，具有較強的擴增特異性及溫度耐受性(退火溫度耐受范圍56-62℃，保證了在使用不同品牌或質(zhì)量的PCR擴增儀時均能得到較好的擴增結(jié)果)。對狗、豬、牛、羊、貓、雞、鼠、兔、魚和大腸桿菌DNA，10種不同種屬物種進行檢測，沒有擴增峰，表明本發(fā)明具有良好的種屬特異性；5、本發(fā)明通過在引物上標記具有FRET的TAMRA和ROX，極大地提高了TAMRA、ROX的熒光效率，縮小了與FAM、HEX的差距；毛細管電泳檢測時，相比使用常規(guī)熒光染料標記方法的STR復合擴增試劑盒，本發(fā)明具有更均衡、更快速的系統(tǒng)，同時具有更高的靈敏度。附圖說明圖1為實施例1中間熒光不同標記位置的引物A-H擴增D13S317的結(jié)果圖；圖2為實施例2中試劑盒等位基因分型標準物圖；圖3為實施例2擴增陽性標準品9947A的分型結(jié)果；圖4為實驗3中本發(fā)明試劑盒Z2015110011F擴增圖譜；圖5為實驗3中21DirectID樣本Z2015110011F擴增圖譜；圖6為實驗3中本發(fā)明試劑盒Z2015110071M擴增圖譜；圖7為實驗3中21DirectID樣本Z2015110071M擴增圖譜；圖8為實驗4中本發(fā)明雙熒光標記方法對DNA標準品9947A500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg五個濃度的擴增結(jié)果；圖9為實驗4中使用常規(guī)單熒光標記方法對DNA標準品9947A500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg五個濃度的擴增結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。如圖所示，本發(fā)明公開一種采用新型雙熒光標記方法的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒，包括：21對特異性引物的復合引物組、復合擴增21個基因座、反應混合液以及熱啟動Taq酶；所述復合擴增21個基因座包括Amelogenin，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，F(xiàn)GA，D2S1338，D19S433，D1S1656，D12S391，PentaD，PentaE和D6S1043；所述反應混合液的組成為：MgCl25mM、Tris-HCl125mMpH8.325℃，KCl125mM，dNTPs0.5mM，BSA1.5g/L；所述dNTPs為dATP、dTTP、dCTP、dGTP的等摩爾混合物；所述21對特異性引物的復合引物組的21個基因座的引物對的序列包括SEQIDNO.01-SEQIDNO.42；所述21對特異性引物的復合引物組的各STR基因座采用分別位于該基因座核心重復區(qū)兩側(cè)的一對引物擴增，其中每對引物中至少有一條引物采用新型雙熒光染料標記方法進行標記；所述21對特異性引物的復合引物組的21個基因座的引物對分為四組采用新型雙熒光染料標記方法進行標記；所述四組包括第一組：D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，PentaE；SEQIDNO.01-SEQIDNO.10；第二組：D8S1179，D21S11，D16S539，D2S1338，PentaD；SEQIDNO.11-SEQIDNO.20；第三組：D19S433，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D6S1043；SEQIDNO.21-SEQIDNO.32；第四組：Amelogenin，D1S1656，D5S818，D12S391，F(xiàn)GA；SEQIDNO.33-SEQIDNO.42。所述新型雙熒光標記方法包括在引物5’端第一個堿基用FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一種進行標記；其中，用FAM、TAMRA和ROX標記的引物，引物5’和3’中間一個堿基用FAM進行標記；用HEX標記的引物，引物5’和3’中間一個堿基用HEX進行標記。本發(fā)明所述的采用新型雙熒光標記方法的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：將試劑盒內(nèi)試劑與樣品DNA混合、裝入PCR擴增管，置于熱循環(huán)儀上，進行PCR擴增，擴增程序為：95℃3min；94℃5s、60℃1min，26-28個循環(huán)；60℃終延伸10min；4-16℃保持；得到擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物在遺傳分析儀上進行熒光檢測，再用片段分析軟件分析基因測序儀上檢測到的數(shù)據(jù)；所述樣品DNA包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有機抽提法中任意一種方法提取的人基因組DNA，提取檢材的來源包括人的血液、血痕、精液、唾液、體液、毛發(fā)、肌肉或組織器官，或者利用免提取的濾紙、FTA卡、棉簽、紗布中任意一種載體收集的人類血液或口腔細胞。本發(fā)明所述的采用新型熒光染料標記方法的21個短串聯(lián)重復序列復合擴增檢測試劑盒，可應用于中國人群的個體識別、親子鑒定、DNA建庫等方面。實施例1、引物設計及熒光標記在引物序列上位置的確定體系共擴增21個STR基因座，為Amelogenin，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，F(xiàn)GA，D2S1338，D19S433，D1S1656，D12S391，PentaD，PentaE和D6S1043。對上述21個基因座在其重復序列的側(cè)翼分別設計特異性引物。引物設計采用Oligo7軟件，每條引物Tm值接近60℃。擴增產(chǎn)物長度的最大范圍為75-500bp，對每對引物進行擴增測試并優(yōu)化，直至得到峰形鋒利、峰高較高的擴增峰。再經(jīng)過復合擴增測試，在56℃-63℃之間，不產(chǎn)生非特異擴增、均有目的峰，不發(fā)生其它相互作用或交叉反應。對狗、豬、牛、羊、貓、雞、鼠、兔、魚和大腸桿菌DNA均無擴增。引物序列同表2。本發(fā)明所述的新型熒光標記方法利用的是FRET原理，所以FRET的程度與熒光在引物上的位置有關(guān)。我們對它進行了研究與實際的測試。對D13S317的同一條引物，在不同位置標記熒光，熒光標記在太靠近3’端可能會影響引物結(jié)合模版，所以總長度為24bp的引物，我們選取了5’端2-14位標記中間熒光。5’第一個堿基“C”用TAMRA標記，用粗體表示。標記6-FAM的堿基用下劃線+粗斜體表示，如下表：A為常規(guī)單熒光標記的引物，B-I為中間熒光標記在不同位置的引物，擴增0.2-0.5ng的DNA提取樣本。A-I設置相同的PCR和電泳條件，僅僅熒光引物標記方式不同，實驗重復3次。為了避免熒光信號超過檢測上限值，將所有擴增產(chǎn)物稀釋10倍后再進行電泳。結(jié)果表明：D引物擴增的平均峰高最高，標記在5’第6位的熒光效率最高，相比單熒光標記的A引物，可提高至9.2倍。結(jié)果如下表和圖1：熒光標記引平均檢測峰A211.2B1712.6C1794.3D1941.1E1601.7F1497.1G1414.7H1244.9I1118.3可以看出，5’-3’之間增加一個短波長熒光標記可顯著提高長波長染料TAMRA的熒光效率，ROX的測試亦如此，此處不再贅述；短波長熒光標記的位置影響熒光效率，對于TAMRA，將6-FAM標記在5’第6位的熒光效率最高，為了使整個引物體系以及背景熒光均一，我們將本發(fā)明中所有熒光引物的中間熒光都標記在5’第6位堿基上，具體見表2。表2.本發(fā)明引物信息注：加粗字體的5’熒光標記的堿基，下劃線的為中間熒光標記的堿基，對應的熒光素為對應相同的加粗或下劃線標記。實施例2擴增體系的優(yōu)化及確定為使擴增均衡及，對引物濃度及擴增組分做了系列測試，最終確定了引物加量及擴增緩沖溶液的組分。試劑盒包括以下成份：2.5×的緩沖液成分及其濃度為：MgCl25mM，Tris-HCl125mM(pH8.3，25℃)，KCl125mM，dNTPs0.5mM，BSA1.5g/L。dNTPs是四種脫氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的等摩爾混合物。MarkerOrange-500按專利201610988458.1方法制備。本發(fā)明還提供了用于分析的等位基因分型標準物，各個基因座引物分別擴增對應等位基因，擴增產(chǎn)物組合而成。圖2為Allellicladder電泳圖譜。DNA標準品DNA9947A購自美國promega公司。熱啟動酶購自大連寶生物。本試劑盒在56-62℃退火溫度范圍內(nèi)都能良好擴增，擴增體系在各種反應熱循環(huán)儀上，如ABI9700、ABI2720、Bio-RadT100、博日LifePro等，采用以下的程序可以得到較好的結(jié)果：95℃預變性3分鐘；94℃變性5秒鐘，60℃退火延伸1分鐘，該步驟運行26-28個循環(huán)；60℃保溫10分鐘；4-16℃保溫。以9947A標準品DNA為模板，按下表加樣：組分加量(μL)2.5×PCRMix105×Primers55U/μL熱啟動TaqDNA聚合酶19947A0.5無核酸酶去離子H2O補至總體積為25uL在ABI9700上以程序95℃3分鐘；94℃5秒鐘，60℃1分鐘運行26個循環(huán)；60度10分鐘擴增。1μL擴增產(chǎn)物+0.5μL分子量內(nèi)標+10μL去離子甲酰胺加樣，在ABI3130XL上以1kv，1s進樣，15KV電壓進行電泳40min。結(jié)果以GeneMapper軟件進行分析。圖3為9947A擴增檢測結(jié)果圖譜，與理論分型一致。實施例3、比較本發(fā)明與其他商品化試劑盒分型的一致性為了檢測本發(fā)明與其他商品化試劑盒分型的一致性，本實施例選取了MicroreaderTM21DirectIDSystem作為參照對象，分別使用本發(fā)明與21DirectID試劑盒對1316個樣本(其中無關(guān)個體663個)進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)過ABI3100遺傳分析儀毛細管電泳進行分型，并對分型結(jié)果進行分析比對。21DirectID試劑盒按照其說明書操作，本發(fā)明使用步驟如下：3.1.聚合酶鏈式反應(PCR)擴增1)取緩沖液、引物混合物、Taq酶，按照下表配成混合液，振蕩混勻后分裝至PCR反應管中，每管25μL。本發(fā)明：組分加量(μL)2.5×PCRMix105×Primers55U/μL熱啟動TaqDNA聚合酶1模版DNA(來自血濾紙或FTA卡)1片1.2mm孔徑血痕無核酸酶去離子H2O補至總體積為25uL21DirectID：組分加量(μL)MicroreaderTM1.25×BufferB20MicroreaderTM21-D5×PrimerMix5MicroreaderTMTaqDNAPolymeraseII0.5模版DNA(來自血濾紙或FTA卡)1片1.2mm直徑反應終體積25.5uL2)按照本發(fā)明和21DirectID說明書，設置熱循環(huán)儀(ABI9700DNA擴增儀)參數(shù)，然后將PCR反應管放入儀器中開始擴增基因片段。本發(fā)明：95℃3分鐘；94℃5秒鐘，60℃1分鐘運行26個循環(huán)；60度10分鐘，4-16℃持續(xù)保溫，直至取出樣品。21DirectID：95℃2分鐘；94℃5秒鐘，60℃70秒運行28個循環(huán)；60度30分鐘，4-16℃持續(xù)保溫，直至取出樣品。3.2.擴增反應結(jié)束后，取出反應管，用ABI3100遺傳分析儀進行電泳和檢測。1)取(0.5μL分子量內(nèi)標+10μL去離子甲酰胺)×(樣品數(shù))配成混合液混勻后分裝，每管10μL。2)再分別加入1μL擴增產(chǎn)物或等位基因階梯(AllelicLadder)，簡短離心將液體收集到離心管管子底部樣品95℃變性4分鐘，然后迅速冰上冷卻4分鐘，使DNA完全變性并且保持變性狀態(tài)將樣品放入基因分析儀的樣品托盤中。3)設置儀器參數(shù)(本發(fā)明進樣電壓1kV，進樣時間1秒鐘；21DirectID進樣電壓3kv，10s)，開始電泳檢測大約40分鐘后，電泳結(jié)束，用GeneMapper軟件分析實驗數(shù)據(jù)得到圖譜和分型結(jié)果。3.3分型結(jié)果對比本發(fā)明與21DirectID都包含20個常染色體STR位點和一個Amelogenin性別位點。20個常染STR位點中，二者有19個位點相同，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，F(xiàn)GA，D2S1338，D19S433，D12S391，PentaD，PentaE，D6S1043。對上述19個位點以及Amelogenin的分型進行比對。通過對分型結(jié)果進行比對，1316個樣本(其中無關(guān)個體663個)的52640個等位基因，本發(fā)明與21DirectID兩個試劑盒的分型結(jié)果完全一致。對其中2個樣本分別用兩個試劑盒的擴增結(jié)果進行舉例，擴增圖見圖4-圖7。實施例4、本發(fā)明與常規(guī)標記方法擴增體系靈敏度比較對本發(fā)明擴增DNA模版的靈敏度進行測試，與常規(guī)單熒光標記的引物進行對比。分別配制本發(fā)明的雙熒光標記和單熒光標記的兩組引物池，引物濃度按各自最有條件組配，具體見下表。按實施例2配置擴增體系，加入倍比稀釋的DNA標準品9947A(500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg)，擴增程序按兩套引物各自最佳程序進行，具體如下：雙熒光標記引物組：95℃3分鐘；94℃5秒鐘，60℃1分鐘運行26個循環(huán)；60度10分鐘，4-16℃持續(xù)保溫，直至取出樣品。單熒光標記引物組：95℃3分鐘；94℃10秒鐘，60℃1分鐘，72度1分鐘，運行28個循環(huán)；60度30分鐘，4-16℃持續(xù)保溫，直至取出樣品。擴增反應結(jié)束后，取出反應管，用ABI3100遺傳分析儀進行電泳和檢測。1)取(0.5μL分子量內(nèi)標+10μL去離子甲酰胺)×(樣品數(shù))配成混合液混勻后分裝，每管10μL。2)再分別加入1μL擴增產(chǎn)物或等位基因階梯(AllelicLadder)，簡短離心將液體收集到離心管管子底部樣品95℃變性4分鐘，然后迅速冰上冷卻4分鐘，使DNA完全變性并且保持變性狀態(tài)將樣品放入基因分析儀的樣品托盤中。3)設置儀器參數(shù)(雙熒光標記進樣電壓1kV，進樣時間1秒鐘；單熒光標記進樣電壓3kv，10s)，開始電泳檢測大約40分鐘后，電泳結(jié)束，用GeneMapper軟件分析實驗數(shù)據(jù)得到圖譜和分型結(jié)果。常規(guī)單熒光標記的引物擴增的色間均衡性和整體峰高不如雙熒光標記的引物。采用雙熒光標記的引物，由于信號的提高，引物用量較常規(guī)單熒光標記引物用量要少。尤其TAMRA、ROX這兩種熒光發(fā)射波長大的熒光標記引物，常規(guī)單標記引物用量是雙標記引物用量的數(shù)倍，然而擴增信號強度及均衡性仍不及雙標記引物。盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。當前第1頁1 2 3