一種基于疏水性電荷誘導磁性微球的抗體熒光標記新方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種基于疏水性電荷誘導磁性微球的抗體熒光標記新方法。
【背景技術】
[0002]隨著人們對健康的日益關注和醫(yī)療改革的深化，國內(nèi)體外診斷市場蓬勃發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計2012年體外診斷市場的規(guī)模超過167億元，2013年為215億元，并仍將以15?20%的速度繼續(xù)增長。體外診斷的重要途徑之一是采用標記抗體特異性地顯示抗體與目標分子之間的相互作用或通過放大效應提高檢測靈敏度。目前標記抗體的制備主要采用液相法(http://www.drmr.com/abcon/，2004)，存在對抗體的純度和濃度要求高、標記反應的偶聯(lián)程度不易控制、過程冗長和抗體活性易受影響等缺點。近年來，抗體固相標記法成為研究熱點(Journal of Molecular Recognit1n，2004，17:268 ;Proteomics，2014，14:14)，該方法可以較好地克服液相法存在的缺點，標記的同時兼具對抗體純化和濃縮的作用，因此具有良好的應用潛力。
[0003]固相標記材料的性能很大程度上取決于偶聯(lián)在材料表面的功能配基，功能配基決定了固相材料對抗體的吸附和解吸性能。目前，文獻已報道的配基包括金屬螯合配基和蛋白 A 親和配基(Journal of Molecular Recognit1n，2004，17:268 ；Journal ofImmunological Methods，2007，22:1)。其中金屬螯合配基對抗體的選擇性較差，對抗體的純度要求較高；而蛋白A親和配基雖然對抗體具有高度的特異性，但價格昂貴、抗體的吸附容量低，同時洗脫條件過酸易導致抗體活性損失(Journal of Chromatography A, 2014,1355:12)。疏水性電荷誘導層析(Hydrophobic charge induct1n chromatography,HCIC)是近年來發(fā)展起來的抗體分離新方法。HCIC功能配基包含疏水和荷電基團，在中性條件下，利用疏水相互作用實現(xiàn)蛋白的吸附，且具有耐鹽吸附的特性；隨后通過調(diào)節(jié)溶液PH，引入靜電排斥力協(xié)助解吸，可有效避免因親和力過高而導致的洗脫困難，實現(xiàn)快速洗脫(Molecular Simulat1n，2010，36:1096 ;B1technology Progress，2010，26:134)。因此，采用HCIC配基不僅能實現(xiàn)抗體固相標記中的選擇性吸附，又能在完成標記后高效回收抗體，降低固相標記過程對抗體純度和濃度的要求，并較好地保存抗體的活性。
[0004]目前抗體固相標記的操作過程復雜，涉及固相與抗體的混合、抗體與游離標記分子的混合以及標記分子和固相的分離等步驟，如何簡化過程，實現(xiàn)高效的抗體標記工藝，是固相標記方法推廣亟需解決的問題。磁分離技術可以從復雜的料液中簡便快速地分離目標物，實現(xiàn)對目標物質(zhì)的分離、富集、回收和再利用。磁分離技術中常用的材料是磁性瓊脂糖復合微球，該材料不僅具有優(yōu)良的磁響應性，同時瓊脂糖組分親水性好、生物相容性非特異性吸附低，同時表面富含羥基，可以方便的進行功能配基的偶聯(lián)。借助磁性復合微球在外加磁場作用下的磁性導向效應，促使微球快速分散和富集，有利于簡化固相標記的操作過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種基于疏水性電荷誘導微球的抗體熒光標記新方法。所述的一種基于疏水性電荷誘導微球的抗體熒光標記新方法，其特征在于包括如下步驟:
[0006]1)取適量待標記的抗體溶于由生理鹽水和0.5M pH 7-9的碳酸鈉緩沖液(9: 1)構成的孵育緩沖液中，與具有疏水性電荷誘導效應的磁性微球振蕩混合，4°C下，孵育0.5-8小時；
[0007]2)測定吸附前后溶液中抗體的濃度，計算抗體吸附量，在外加磁場輔助下，用孵育緩沖液洗滌3次，洗去未吸附的抗體以及其他雜質(zhì)；
[0008]3)根據(jù)計算的抗體吸附量，按照每毫克抗體加入0.01-20mg的異硫氰酸熒光素，將異硫氰酸熒光素緩慢添加至裝有磁性微球的三角瓶中，4°C下振蕩混合1-8小時，進行熒光標記；
[0009]4)標記完成后，在外加磁場的輔助下，用孵育緩沖液洗滌3次，除去游離的異硫氰酸熒光素；
[0010]5)采用1M醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4.0-5.5，4°C下振蕩混合5_30分鐘，回收標記抗體。
[0011]所述的一種基于疏水性電荷誘導微球的抗體熒光標記新方法，其特征在于所述的具有疏水性電荷誘導效應的磁性微球為偶聯(lián)有4-巰乙基吡啶或氨基咪唑的磁性瓊脂糖微球。
[0012]所述的一種基于疏水性電荷誘導微球的抗體熒光標記新方法，其特征在于所述的孵育緩沖液為生理鹽水和0.5M pH 7-9的碳酸鈉緩沖液按照質(zhì)量比9: 1的比例混合的緩沖液。
[0013]所述的一種基于疏水性電荷誘導微球的抗體熒光標記新方法，其特征在于所述的洗脫pH值為4.0-5.5。
[0014]本發(fā)明采用具有疏水性電荷誘導效應的磁性瓊脂糖微球進行抗體的熒光標記，充分發(fā)揮了疏水性電荷誘導微球的抗體吸附容量大、耐鹽吸附以及洗脫溫和便利等優(yōu)點，并結(jié)合磁性響應特點使得微球可以通過外加磁場的施加來實現(xiàn)微球與料液的快速分離，尤其在料液中含有細胞或其他固體雜質(zhì)時。因此，采用具有疏水性電荷誘導效應的磁性微球進行抗體熒光固相標記，可以降低對抗體濃度和純度的要求，擴大抗體標記的范圍，減少透析和凝膠過濾等步驟，極大地提高抗體熒光標記的效率。此外，微球的性質(zhì)穩(wěn)定，配基牢固，清洗再生方便。
【附圖說明】
[0015]附圖是采用本發(fā)明的方法吸附有熒光染料標記蛋白的介質(zhì)微球的激光共聚焦顯微圖。
【具體實施方式】
[0016]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的描述:
[0017]實施例1
[0018]取50mg待標記的抗體溶于50mL孵育緩沖液(生理鹽水和0.5M pH 7的碳酸鈉緩沖液的體積比為9: 1)，配制抗體溶液，與l.0g偶聯(lián)有4-巰乙基吡啶的磁性微球振蕩混合，4°C下，孵育0.5小時；測定吸附前后溶液中抗體的濃度，計算抗體吸附量為45mg/g，在外加磁場輔助下，用孵育緩沖液洗滌微球3次，洗去未吸附的抗體以及其他雜質(zhì)；加入
0.45mg異硫氰酸熒光素，4°C下振蕩混合8小時，進行熒光標記；標記完成后，在外加磁場的輔助下，用孵育緩沖液洗滌微球3次，除去游離的異硫氰酸熒光素；采用1M醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4，4°C下振蕩混合5分鐘，回收標記抗體。
[0019]實施例2
[0020]取50mg待標記的抗體溶于50mL孵育緩沖液(生理鹽水和0.5M pH 8的碳酸鈉緩沖液的體積比為9: 1)，配制抗體溶液，與l.0g偶聯(lián)有4-巰乙基吡啶的磁性微球振蕩混合，4°C下，孵育1小時；測定吸附前后溶液中抗體的濃度，計算抗體吸附量為42mg/g，在外加磁場輔助下，用孵育緩沖液洗滌微球3次，洗去未吸附的抗體以及其他雜質(zhì)；加入42mg的