專利名稱：多種常見性病快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是多種常見性病快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。
淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹的發(fā)病率占我國性病傳播疾病發(fā)病率的前四位。這四種性病也是全球性的主要性傳播疾性之一，發(fā)病率在逐年增加。臨床實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)通常是淋病患者尿道生殖道分泌物涂片、淋球菌培養(yǎng)和免疫熒光抗體檢測(cè)；沙眼衣原體的分泌物涂片檢查、直接熒光抗體檢測(cè)和酶免疫法；尖銳濕疣的細(xì)胞學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢查及分子雜交技術(shù)檢查；生殖器皰疹的細(xì)胞學(xué)檢查、組織培養(yǎng)檢查和抗體血清學(xué)檢查等等。目前發(fā)現(xiàn)除淋病和非淋菌性道炎患者的尿道生殖道分泌物可查出病原體外，尖銳濕疣患者的尿沉渣中有被病原體感染的細(xì)胞，生殖器皰疹侵入尿道因而在尿中可查見病原體。例如淋病的常規(guī)檢測(cè)是采用尿道生殖道究泌物的涂片檢查，在多形核白細(xì)胞內(nèi)查見革蘭氏雙球菌即可診斷，在男性淋病的診斷中，棉拭子要進(jìn)入尿道2厘米處取樣，但女性分泌物應(yīng)取宮頸管內(nèi)的，并且陰道分泌物有50％假陽性和50％的假陰性，因而不能用于診斷，應(yīng)用新的培養(yǎng)基對(duì)分泌物培養(yǎng)可增加陽性的檢出率。目前采用DNA擴(kuò)增技術(shù)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)快速檢測(cè)這些性病的方法已逐步在臨床上推廣應(yīng)用。這些常規(guī)檢測(cè)必需在具備顯微鏡、細(xì)菌培養(yǎng)箱和PCR儀等條件的化驗(yàn)室中進(jìn)行。這些檢查不僅需要特定的儀器設(shè)備，而且檢查費(fèi)時(shí)，需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能觀察結(jié)果，所需費(fèi)用較高。眾所周知，早期、快速的診斷是早期治療和切斷性病傳播途徑的關(guān)鍵步驟。由于性病的特殊性，檢查常在門診進(jìn)行，迫切需要一種特異、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)試紙條。
本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病的多種常見性病的快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹病原體的單克隆抗體膠體金免疫吸附(GCISA)實(shí)驗(yàn)原理制成，它能定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。
上述檢測(cè)試紙條的制備方法按以下步驟進(jìn)行1)制備檢測(cè)用免疫原及抗原采用淋球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株制備淋球菌外膜蛋白pIA、pIB的粗制品，將非淋球菌性尿道炎的主要病原體沙眼衣原體血清型D-K的基本顆粒作為其抗原，將尖銳濕疣的病原體人乳頭瘤病毒(HPV-6,11型)顆粒作為其抗原，將生殖器皰疹的病原單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作為抗原；2)單克隆抗體的制備與篩選將1)中四種性病的抗原分別用雜交瘤技術(shù)將免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合得到一種可以產(chǎn)生抗體的雜交瘤，具體是免疫6周齡雌性Bab/c小鼠，免疫5次。取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行融合，融合后的細(xì)胞接種于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基上，用間接ELISA法篩選并克隆化，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)將雜交細(xì)胞注入經(jīng)產(chǎn)數(shù)胎的雌性Bab/c小鼠腹腔中，收集腹水，-20℃保存，抗體純化，最終獲得18株分別抗各種性病病原體的單克隆抗體細(xì)胞株，經(jīng)鑒定，這18株單克隆抗體均為IgG1類，親和常數(shù)在2×108-1×109之間；3)制備兔抗性病病原體抗原的免疫血清，用大耳白兔，雄性，體重2千克左右，將含不同抗原的性病病原體分別用生理鹽水稀釋進(jìn)行免疫，經(jīng)試血清抗體滴度后頸動(dòng)脈放血，4℃存放過夜后分離血清凍存，進(jìn)行抗體純化；4)制備膠體金標(biāo)記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，按比例與不同性病病原體的單克隆抗體混合進(jìn)行標(biāo)記，膠體金標(biāo)記抗體的制備是用終濃度為0.05％PEG穩(wěn)定標(biāo)記后的膠體金顆粒，于4℃下濃縮純化離心1至3次，沉淀物保存于原體積3-10％的保存液中于4℃保存；5)檢測(cè)試紙條的制備選擇適當(dāng)?shù)臐舛葘⒚庖哐蹇贵w和金標(biāo)記抗體分別固定于不同的載體上，經(jīng)粘合、切割等步驟制備成檢測(cè)試紙。
具體將兔抗性病病原體血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于1-5％牛血清白8蛋白內(nèi)37℃封閉1-3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗后，室溫涼干，4℃密封保存。
或者是①將兔抗多種性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于1-5％牛血清白蛋白內(nèi)37℃封閉1-3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗數(shù)次，室溫涼干，4℃密封保存，②在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，加入抗多種性病的單克隆抗體標(biāo)記的膠體金溶液20-60μl，室溫涼干，4℃密封保存，③分別取大小適合的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和大小適合的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在大小適合的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
其檢測(cè)方法是膠體金酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(GCISA)在聚苯乙烯塑料板每槽內(nèi)加入硝酸纖維素膜免疫條帶一條，加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,PH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，侵濕后加入經(jīng)室溫靜置后的標(biāo)本上清液50μl在槽內(nèi)混勻，立即加入抗性病單克隆抗體標(biāo)記的膠體金溶液20-60μl，室溫下反應(yīng)時(shí)間為3-5分鐘，后用洗液(上液中Tween-20為50ul，無BSA)漂洗后觀察結(jié)果，或者將樣品直接加入已剪切粘接的試紙條的空白端，15分鐘后判讀結(jié)果。陽性對(duì)照條內(nèi)呈紅色圓點(diǎn)，陰性對(duì)照條內(nèi)則不出現(xiàn)紅色圓點(diǎn)。試紙的靈敏度為250ng/ml，可在常溫下存儲(chǔ)一年。
本發(fā)明的檢測(cè)試紙條是一種能定性診斷多種常見性病的快速檢測(cè)試紙條，使用該試紙條能夠定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎，尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。這種方式試紙條具有高度的特異性和靈敏度，還具有穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，并且不用特殊儀器，費(fèi)用較低廉，操作簡(jiǎn)便易學(xué)，短時(shí)間內(nèi)(15分鐘)就能判讀結(jié)果，適合于基層醫(yī)療單位和大規(guī)模體檢查使用，也適合于患者的自查。從而達(dá)到早期、快速的診斷出多種常見的性病，使患者得到早期、及時(shí)和有效的治療，并切斷性病傳播的可能途徑。這對(duì)人民身體健康和社會(huì)的安定團(tuán)結(jié)都重要意義，具有良好的市場(chǎng)前景的經(jīng)濟(jì)效益。
實(shí)施例1、制備檢測(cè)用免疫原及抗原采用常規(guī)試驗(yàn)方法，淋球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株制備淋球菌外膜蛋白pIA、pIB的粗制品，將非淋球菌性尿道炎的主要病原體沙眼衣原體血清型D-K的基本顆粒作為其抗原，將尖銳濕疣的病原體人乳頭瘤病毒(HPV-6,11型)顆粒作為其抗原，將生殖器皰疹的病原單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作為抗原；
2、單克隆抗體的制備與篩選1)免疫小鼠及制備脾淋巴細(xì)胞將上述四種性病抗原，分別加0.4mlPBS(PH7.4)，與0.4ml完全弗氏佐劑充分混合，并將0.2ml所得乳化液注射到6周齡雌Bab/c小鼠皮下。初次免疫兩周后，再將0.2ml如上法制得的乳化液注入小鼠皮下。再過兩周后，同法制得乳化液0.5ml注入小鼠腹腔。又兩周后在小鼠尾靜脈注入0.2ml含上述性病抗原的PBS溶液。三天后從已免疫小鼠的體內(nèi)分離脾臟并將其擠壓使細(xì)胞分散。將如此得到的淋巴細(xì)胞懸浮于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液MEM中，離心洗滌兩次(1400rpm,6min,37℃)，將淋巴細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)液中，即可分別獲得不同抗原的細(xì)胞融合的小鼠淋巴細(xì)胞。2)細(xì)胞融合收獲處于生長(zhǎng)期小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0懸浮于MEM中，并離心洗滌兩次(1400rpm,6min,37℃)，然后將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)液中，即獲得細(xì)胞融合的小鼠骨髓瘤細(xì)胞。
將3.5×108個(gè)上述淋巴細(xì)胞和2.71×108個(gè)上述骨髓瘤細(xì)胞置于50ml離心管內(nèi)混合后離心(1400rpm,6min,37℃)，去上清，緩慢加入MEM至10ml，離心(800rpm,6min,37C)去上清，將細(xì)胞重新懸浮于14mlHA T培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)板上加樣后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5％二氧化碳，95％空氣，濕度100％)。
3)雜交瘤細(xì)胞的篩選；按上述方法培養(yǎng)2至4周后，用ELISA方法檢測(cè)已證實(shí)有細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)板中的培養(yǎng)物上清液中是否含有抗上述抗原的抗體，結(jié)果在960個(gè)培養(yǎng)板上的小井中有26個(gè)產(chǎn)生了抗體。在這些小井中加入上述抗原后，有18個(gè)能被抗原所抑制，進(jìn)而證實(shí)這18個(gè)培養(yǎng)小井中有產(chǎn)生上述抗原的雜交瘤細(xì)胞，選擇出4株針對(duì)上述四種性病抗原的雜交瘤細(xì)胞株。
4)雜交瘤細(xì)胞克隆采用有限稀釋法即連續(xù)稀釋至培養(yǎng)小井的最終細(xì)胞濃度為10個(gè)/ml，再接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml內(nèi)含1個(gè)細(xì)胞，對(duì)所選的4株細(xì)胞進(jìn)行再克隆，并對(duì)每個(gè)小井的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行抗體ELISA檢測(cè)。
5)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體將在含有15％FCS的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的4株細(xì)胞株的培養(yǎng)細(xì)胞移入不含F(xiàn)CS的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至幾乎所有細(xì)胞死亡，對(duì)其培養(yǎng)液進(jìn)行離心得到含有單克隆抗體的上清液，并對(duì)抗體進(jìn)行純化鑒定。經(jīng)鑒定，可以產(chǎn)生抗體的雜交瘤經(jīng)篩選純化后可得18株分別抗各種性病病體的單克隆抗體細(xì)胞株。
6)在小鼠腹腔內(nèi)大量產(chǎn)生單克隆抗體分別將懸浮有2×106不同抗原細(xì)胞株的PBS溶液0.5ml注入6周齡雌性Bab/c小鼠的腹腔內(nèi)。約一周后小鼠體重顯著增加，于注射細(xì)胞后的第7、9、11天用注射器收集腹水，離心得到腹水的上清液，并對(duì)腹水上清液進(jìn)行抗體含量檢測(cè)。
3、制備兔抗性病病原體抗原的免疫血清將含上述不同的抗原用生理鹽水混合稀釋至總量2ml，注射進(jìn)體重2千克左右的雄性耳白兔腹腔，兩周后再次免疫一次。檢測(cè)兔血清中針對(duì)不同抗原的抗體滴度后，采用頸動(dòng)脈放血收集血液，4℃存放過夜后分離血清凍存，對(duì)抗體進(jìn)行純化。
4、制備膠體金標(biāo)記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，即取1％HauCl4水溶液1ml，加重蒸餾水至100ml，迅速加入枸櫞酸三鈉水溶液2ml，5分鐘后出現(xiàn)橙紅色，制得膠體金16nm。按1∶1比例與多種性病的單克隆抗體溶液在磁性攪拌下混合，10分鐘后再加入50g/l牛血清白蛋白水溶液至終濃度為10g/l。用終濃度為0.05％PEG穩(wěn)定標(biāo)記后的膠體金顆粒，于4℃下1500r/min1小時(shí)。濃縮純化離心兩次，沉淀物保存于原體積6％的保存液(0.01mol/l,PH7.2PBS溶液，含0.5mg/ml PEG和1/10000NaN3)中于4℃保存。
5、檢測(cè)試紙條的制備將兔抗淋球菌血清IgG等量混合后，以不同含量抗體以0.5ul/點(diǎn)打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干。將膜置于4％牛血清白蛋白內(nèi)37℃封閉3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗3次，室溫涼干，4℃密封保存；或者①將兔抗多種性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗體以0.5ul打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于4％牛血清白蛋白內(nèi)37℃封閉3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗3次，室溫涼干，4℃密封保存；②在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20μl，加入抗多種性病的單克隆抗體標(biāo)記的體金溶液60μl，室溫涼干，4℃密封保存，③分別取0.5×2.5厘米大小的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和0.5×3厘米大小的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在0.5×8厘米的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
取患者的尿道生殖道的分泌物、或尿液、或皰疹內(nèi)液等樣品，浸濕試紙條的樣品端，陽性者試紙條內(nèi)膠體金單抗區(qū)域呈紅色圓點(diǎn)，陰性者試紙條內(nèi)膠體金單抗體區(qū)域則不出現(xiàn)紅色圓點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種多種常見性病快速檢測(cè)試紙條，其特征在于利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹原體的單克隆抗體膠體金免疫吸附(GCISA)實(shí)驗(yàn)原理制成，它能定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行1)制備檢測(cè)用免疫原及抗原采用淋球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株制備淋球菌外膜蛋白pLA、pIB的粗制品，將非淋球菌性尿道炎的主要病原體沙眼衣原體血清型D-K的基本顆粒作為其抗原，將尖銳濕疣的病原體人乳頭瘤病毒(HPV-6,11型)顆粒作為其抗原，將生殖器皰疹的病原單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作為抗原；2)單克隆抗體的制備與篩選將1)中四種性病的抗原分別用雜交瘤技術(shù)將免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合得到一種可以產(chǎn)生抗體的雜交瘤；3)制備兔抗性病病原體抗原的免疫血清；4)制備膠體金標(biāo)記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，按比例與不同性病病原體的單克隆抗體混合進(jìn)行標(biāo)記；5)檢測(cè)試紙條的制備選擇適當(dāng)?shù)臐舛葘⒚庖哐蹇贵w和金標(biāo)記抗體分別固定于不同的載體上，經(jīng)粘合、切割等步驟制備成檢測(cè)試紙。
3.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于制備兔抗性病病原體抗原和免疫血清是用大耳白兔，雄性，體重2千克左右，將含不同抗原的性病病原體分別用生理鹽水稀釋進(jìn)行免疫，經(jīng)試血清抗體滴度后頸動(dòng)脈放血，4℃存放過夜后分離血清凍存，進(jìn)行抗體純化。
4.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于膠體金標(biāo)記抗體的制備是用終濃度為0.05％PEG穩(wěn)定標(biāo)記后的膠體金顆粒，干4℃下濃縮純化離心1-3次，沉淀物保存于原體積3-10％的保存液中于4℃保存。
5.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于2)中所得可以產(chǎn)生抗體的雜交瘤經(jīng)篩選純化后可得18株分別抗各種性病病體的單克隆抗體細(xì)胞株。
6.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于檢測(cè)試紙條的制備是將兔抗性病病原體血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于1-5％牛血清白8蛋白內(nèi)37℃封閉1-3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗后，室溫涼干，4℃密封保存。
7.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于檢測(cè)試紙條的制備也可是①將兔抗多種性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗體打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于1-5％牛血清白蛋白內(nèi)37℃封閉1-3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗數(shù)次，室溫涼干，4℃密封保存，②在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，加入抗多種性病的單克隆抗體標(biāo)記的膠體金溶液20-60μl，室溫涼干，4℃密封保存，③分別取大小適合的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和大小適合的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在大小適合的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
全文摘要
本發(fā)明是一種多種常見性病快速檢測(cè)試紙條,其特征在于利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹原體的單克隆抗體膠體金免疫吸附(GCISA)實(shí)驗(yàn)原理制成,它能定性診斷出淋病、非淋菌性尿道炎、尖銳濕疣和生殖器皰疹中的一種或合并存在的多種性病。這種方式試紙條具有高度的特異性和靈敏度,還具有穩(wěn)定性好,重復(fù)性好,并且不用特殊儀器,費(fèi)用較低廉,操作簡(jiǎn)便易學(xué),短時(shí)間內(nèi)(15分鐘)就能判讀結(jié)果,適合于基層醫(yī)療單位和大規(guī)模體檢查使用,也適合于患者的自查。
文檔編號(hào)G01N33/571GK1307238SQ0011268
公開日2001年8月8日 申請(qǐng)日期2000年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月2日
發(fā)明者謝伯林, 徐林, 楊上川, 郭仁, 彭小忠, 張翔 申請(qǐng)人:昆明廣博科技有限公司