一種快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物測試制品制造領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝癌特異性標志物的快速、準確檢測對原發(fā)性肝癌的早期診療具有極其重要的意義。正常情況下，甲胎蛋白(AFP)主要來自胚胎的肝細胞，胎兒出生約兩周后甲胎蛋白從血液中消失，正常人血清中甲胎蛋白尚不足20ng/ml。肝細胞再生時期，某些胚胎癌、生殖細胞瘤、消化道癌癥、妊娠婦女血液中的AFP也有不同程度的升高。但是最值得注意的是肝癌患者，血液中的AFP濃度可以大幅度升高，并且是持久性升高，這是因為肝癌細胞能合成和分泌較多的AFP釋放入血液。所以，甲胎蛋白作為一種最廣泛、最有價值的特異性肝癌標志物，具有確立診斷、早期診斷、鑒別診斷的作用。
[0003]目前醫(yī)學(xué)上常用檢測甲胎蛋白的方法，如化學(xué)發(fā)光法、酶標法、放射免疫法檢測等，都需要配套有昂貴的檢測儀器或者冗繁的操作步驟，難以在基層醫(yī)療機構(gòu)和普通市民家庭普及。而目前市場上僅有需要滴加血清而不是全血來檢測的膠體金法檢測試紙條，對基層醫(yī)療機構(gòu)個普通市民來說，無疑血清的分離增大了檢測的難度、增長了檢測的時間，同時這也極大限制了其在快速診斷方面的普及。
[0004]因此，建立基于全血的甲胎蛋白檢測快速試紙檢測方法，成為市場迫切的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條及其制備方法，該試紙條操作簡單、便于攜帶，檢測快速靈敏度高，結(jié)果清晰易于判斷；該試紙條的制備方法操作簡單、便捷。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]—種快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條，包括PVC帶膠底板，在PVC帶膠底板上沿層析方向依次設(shè)有全血濾膜樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙；全血濾膜樣品墊的部分壓在金標墊上，金標墊部分壓在硝酸纖維素膜層上，吸水濾紙部分壓在硝酸纖維素膜層上；硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，且檢測線上標記有AFP單克隆抗體I，質(zhì)控線上標記有兔抗鼠抗體，金標墊上標記有AFP單克隆抗體II的膠體金免疫探針。
[0008]吸水濾紙壓在硝酸纖維素膜層上的部分與硝酸纖維素膜層重疊1.0?1.5mm ;金標墊壓在硝酸纖維素膜層上部分與硝酸纖維素膜層重疊1.0?1.5mm ;全血濾膜樣品墊壓在金標墊上的部分與金標墊重疊1.0?1.5mm。
[0009]全血濾膜樣品墊的孔徑為1.4?1.8 μ m。
[0010]檢測線距離金標墊的距離為0.6?0.8cm，檢測線和質(zhì)控線相距0.5?0.7cm。
[0011]本發(fā)明還公開了一種快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0012]I)用堿性溶液將膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)至8.5?9.0，然后將膠體金溶液與AFP單克隆抗體II混勻后，于4°C下靜置，然后加入牛血清蛋白BSA進行封閉，使混合體系中膠體金的終濃度為0.5%?1.5% ;
[0013]2)將經(jīng)步驟I)處理的混合體系離心，取沉淀，將沉淀用PBS緩沖液重懸至體積為離心前的10%?30%，制得濃縮的免疫探針，于4°C保藏；
[0014]3)取聚酯纖維素膜，用緩沖液浸泡處理后于37°C干燥，將步驟2)制得的免疫探針均勻涂抹在聚酯纖維素膜上，制得金標墊；
[0015]4)采用非接觸式點膜儀將AFP單克隆抗體I和兔抗鼠抗體在硝酸纖維素膜上分別劃出檢測線和控制線，劃線后在37°C真空環(huán)境下干燥，制得標記有AFP單克隆抗體I和兔抗鼠抗體的硝酸纖維素膜；
[0016]5)按層析方向，依次將全血濾膜樣品墊、金標墊、標記有AFP單克隆抗體I和兔抗鼠抗體的硝酸纖維素膜以及吸水濾紙組裝在PVC帶膠底板上，制得快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條。
[0017]步驟I)是按0.6?1.5mL膠體金溶液與10?15 μ g AFP單克隆抗體II的用量進行混合；所述堿性條件是指在PH值為8.5?9.0的條件下；在4°C下靜置時間為25?35min，封閉時間為35?45min ;膠體金顆粒是通過梓檬酸鹽還原氯金法制備得到，粒徑為20±3nmo
[0018]步驟2)所述離心是在10000?14000rpm的條件下，處理5?1min ；
[0019]步驟2)所用PBS緩沖液中含有0.5%?1.5%的BSA、0.03%?0.1%的疊氮化鈉、
0.5%?1.5%的蔗糖及0.5%?1.5%的吐溫-20。
[0020]步驟3)所述的緩沖液采用PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或Triton X-100中的一種或幾種，且緩沖液中含有0.5%?1%的PEG-2000、0.5%?1%的吐溫-20和0.5%?
1.5%的蔗糖；將免疫探針以10?20yL/cm的用量均勻涂抹在聚酯纖維素膜上。
[0021]步驟4)劃線時AFP單克隆抗體I和兔抗鼠抗體的使用量為I?2 μ L/cm。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0023]本發(fā)明公開的快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條，在PVC帶膠底板上沿層析方向依次設(shè)有全血濾膜樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙；攜帶有AFP單克隆抗體II和兔抗鼠抗體的硝酸纖維素膜粘貼在PVC帶膠底板上，硝酸纖維素膜的一端粘貼金標墊(噴涂有膠體金免疫探針的結(jié)合墊)，金標墊上粘貼有全血濾膜、吸水紙粘貼于硝酸纖維素膜的另一端上面。本發(fā)明的試紙條結(jié)構(gòu)設(shè)計合理，使用方便，適用于甲胎蛋白5min之內(nèi)的快速檢測，無需任何儀器設(shè)備，攜帶方便，特異性強，靈敏度高，檢測成本低。使用該試紙條時，只需微量的血液(約80μ1)就能在短時間內(nèi)測出血液中甲胎蛋白的含量，該試紙檢測范圍為10?200ng/ml，檢測時間在5分鐘以內(nèi)，即快速又靈敏，是一種非常適合在基層醫(yī)療機構(gòu)級普通市民家庭操作，隨時快速檢測血液中甲胎蛋白濃度的高效辦法。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025]圖2為本發(fā)明快速全血甲胎蛋白檢測試紙條檢測結(jié)果示意圖；
[0026]圖3為用甲胎蛋白標準品進行檢測結(jié)果照片；
[0027]圖中，從左至右依次濃度為Ong/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml ；
[0028]圖4為采用全血進行檢測的結(jié)果照片；
[0029]圖中，從左至右依次濃度為Ong/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml ο
[0030]其中，I為PVC帶膠底板；2為金標墊；3為吸水濾紙；4為質(zhì)控線；5為全血濾膜樣品墊；6為檢測線；7為硝酸纖維素膜。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0032]參見圖1，本發(fā)明的快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條，包括PVC帶膠底板1，在PVC帶膠底板I上沿層析方向依次設(shè)有全血濾膜樣品墊5、金標墊2、硝酸纖維素膜7和吸水濾紙3 ;全血濾膜樣品墊5的部分壓在金標墊2上，金標墊2的部分壓在硝酸纖維素膜層7上，吸水濾紙3部分壓在硝酸纖維素膜層7上；硝酸纖維素膜7上設(shè)有檢測線5和質(zhì)控線4，且檢測線6上標記有AFP單克隆抗體1，質(zhì)控線4上標記有兔抗鼠抗體，金標墊2上標記有AFP單克隆抗體2的膠體金免疫探針。
[0033]各部分之間存在1.0mm?1.5mm的重疊，具體的，吸水濾紙3壓在硝酸纖維素膜層上的部分與硝酸纖維素膜層重疊1.0?1.5mm ;金標墊壓在硝酸纖維素膜層上部分與硝酸纖維素膜層重疊1.0?1.5mm ;全血濾膜樣品墊壓在金標墊上的部分與金標墊重疊1.0?
1.5mmο
[0034]全血濾膜樣品墊5的孔徑為1.4?1.8 μπι ;試紙條的寬度為4?7mm，檢測線5和質(zhì)控線4相距0.5?07cm。
[0035]本發(fā)明的試紙長度的說明:硝酸纖維素膜的長度為2.5cm左右，金標墊的長度為0.5cm左右，全血濾膜樣品墊的長度為1.5cm左右，檢測線距離金標墊的距離為0.7cm。
[0036]本發(fā)明公開的快速檢測全血中甲胎蛋白的試紙條的制備方法，包括以下幾個步驟:
[0037]I)通過檸檬酸鹽還原氯金酸法制備形貌大小均一膠體金顆粒，顆粒的直徑為20nmo
[0038]2)制備膠體金免疫探針，根據(jù)高濃度鹽溶液可使不穩(wěn)定的膠體金發(fā)生凝聚的原理，調(diào)節(jié)其PH到8.5-9.0，修飾AFP單克隆抗體2。
[0039]修飾時將0.6-1.5ml膠體金與10-15 μ g AFP單克隆抗體2混合均勻后在4°C下靜置25-35分鐘。加入BSA進行封閉35-45分鐘，使其終濃度保持在0.5% -1.5%。在離心條件10000-14000rpm進行離心，沉淀物用含有0.5% -1.5% BSA、0.03% -0.1%疊氮化鈉、0.5% -1.5%蔗糖、0.5% -