一種量子點(diǎn)熒光探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種量子點(diǎn)熒光探針，利用該探針能同時(shí)高靈敏檢測(cè)多種生物分子。
【背景技術(shù)】
[0002]能夠?qū)ι锓肿痈哽`敏、高特異地檢測(cè)，始終是人們努力的方向，在疾病的早期檢測(cè)、快速診斷、衛(wèi)生檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都具有重要意義。
[0003]量子點(diǎn)又稱為半導(dǎo)體納米晶或半導(dǎo)體納米粒子，是一種由II 一 VI族(如銫化鎘CdSe、碲化鎘CdTe)或III 一 V族(如InP、InAs)元素組成的納米顆粒，粒徑一般為I?10nm，由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級(jí)結(jié)構(gòu)，受激后可以發(fā)射熒光。作為一種新穎的半導(dǎo)體納米材料，與傳統(tǒng)的熒光染料相比，量子點(diǎn)具有不可比擬的優(yōu)勢(shì):可以通過改變量子點(diǎn)的尺寸改變量子點(diǎn)的發(fā)射譜，即可以制備多種不同發(fā)射不同顏色焚光的量子點(diǎn)；可以在同一光源下激發(fā)多種量子點(diǎn)產(chǎn)生不同顏色的焚光實(shí)現(xiàn)多通道觀測(cè)，使得操作變得簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低；量子點(diǎn)具有窄而對(duì)稱的發(fā)射光譜，其產(chǎn)生的熒光信號(hào)產(chǎn)生的相互干擾比較小；熒光強(qiáng)度高且抗光淬滅能力強(qiáng)(單個(gè)粒子的發(fā)光強(qiáng)度約100倍強(qiáng)于單個(gè)有機(jī)染料分子)。上述優(yōu)越的熒光性質(zhì)使得熒光量子點(diǎn)成為一種潛在的取代傳統(tǒng)有機(jī)染料的理想熒光基團(tuán)，并在分析檢測(cè)和生物醫(yī)學(xué)示蹤成像等領(lǐng)域中受到研究者們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。
[0004]另外，以磁性微球作為生化反應(yīng)的固相支持物對(duì)生物檢測(cè)方法具有重要意義。因其具備的超順磁性，無需復(fù)雜的設(shè)備(如離心機(jī))，僅借助磁鐵，便可簡(jiǎn)便高效地實(shí)現(xiàn)與其他物質(zhì)的分離與純化，故而被廣泛應(yīng)用于免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離和生物大分子純化等領(lǐng)域。磁性微球具有的高體表比，使其表面能結(jié)合大量的抗體，伴隨著輕微震蕩，磁性微球能夠均勻的分散在體系中，大大提高了抗原與抗體的結(jié)合效率，具有較以平板作為支持物更佳的動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)。
[0005]目前針對(duì)量子點(diǎn)信號(hào)的讀取方式主要有兩種，光譜分析和熒光圖像分析。光譜分析主要是通過記錄量子點(diǎn)發(fā)射峰的峰值來實(shí)現(xiàn)定量的目的，此方法對(duì)樣本體積量要求大，導(dǎo)致量子點(diǎn)產(chǎn)生的熒光信號(hào)會(huì)被分散在一個(gè)較大的體積內(nèi)(通常是0.1?ImL)，故而需要更多的量子點(diǎn)才能產(chǎn)生區(qū)別于背景信號(hào)的信號(hào)強(qiáng)度，檢測(cè)靈敏度低；另外，不同量子點(diǎn)的熒光發(fā)射信號(hào)之間會(huì)有些干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。而本發(fā)明擬通過熒光成像分析方法對(duì)富集在磁珠表面的量子點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)行直接讀取(包括顏色區(qū)分及熒光強(qiáng)度定量)，量子點(diǎn)信號(hào)被富集在磁珠表面，靈敏度得到較大的提升。至今，這方面的研究鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種量子點(diǎn)熒光探針，并將該量子點(diǎn)熒光探針用于同時(shí)高靈敏檢測(cè)多種生物分子。
[0007]本發(fā)明主要內(nèi)容包括:雙功能交聯(lián)劑長(zhǎng)鏈磺基琥珀酰亞胺4-[N_甲基馬來酉愛]-1-竣環(huán)己燒(Succinimidyl-4-[N-Maleimidomethyl]cyclohexane-l-carboxy-[6-amidocaproate, SMCC)與氨基量子點(diǎn)表面的氨基基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，在量子點(diǎn)表面生成馬來酰亞胺基。待標(biāo)記抗體用還原劑二硫蘇糖醇(Dith1threitol，DTT)還原，將二硫鍵還原成巰基，巰基再與馬來酰亞胺基團(tuán)形成共價(jià)鍵從而將抗體標(biāo)記到量子點(diǎn)上，由此獲得的量子點(diǎn)熒光探針既可以保持生物分子的活性，也防止了由于量子點(diǎn)及生物分子的聚集帶來的非特異性吸附。在生物分子檢測(cè)時(shí)，以磁珠或磁性微球作為反應(yīng)的固相支持物，使反應(yīng)體系完全懸浮在液相中，通過免疫反應(yīng)或分子雜交將溶液中將待測(cè)生物分子捕獲，再用量子點(diǎn)熒光探針去識(shí)別磁珠上的待測(cè)分子，磁珠或磁性微球上由于結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)物而產(chǎn)生量子點(diǎn)探針的熒光，這種熒光的顏色及信號(hào)的強(qiáng)弱反應(yīng)了待測(cè)生物分子的種類及數(shù)量，可以利用圖像識(shí)別軟件進(jìn)行識(shí)別及定量。
[0008]本發(fā)明所述的量子點(diǎn)熒光探針的制備和檢測(cè)的步驟包括:
[0009](I)量子點(diǎn)焚光探針的制備
[0010]首先，取10-50 yL 5-50mM長(zhǎng)鏈SMCC對(duì)50-500 yL的氨基量子點(diǎn)進(jìn)行活化，25°C，30-60min ;隨后采取脫鹽柱的方法進(jìn)行純化；用10_50mM DTT對(duì)100-500 μ L生物分子進(jìn)行還原，25°C，30-60min ;待脫鹽柱去除未反應(yīng)的抗體和其他雜質(zhì)后，將其與純化后的活化量子點(diǎn)于雜交儀中孵育，25°C，30-60min ;加入5_50 μ?β -巰基乙醇終止反應(yīng)，用柱層析分離純化后保存于免疫反應(yīng)增強(qiáng)液(1mM磷酸緩沖液PBS，PH 7.2、1-10%聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)、1-5%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、1_10%聚乙稀卩比略燒酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)中，4°C避光備用。
[0011](2)檢測(cè)反應(yīng)
[0012]每個(gè)反應(yīng)中加5000-10000顆磁珠捕獲探針，5_50nM量子點(diǎn)檢測(cè)探針，借助樣本稀釋液(含有5-10%小牛血清的1mM PBS)補(bǔ)齊體積到10_50ul/反應(yīng)，隨后加入10_50ul的不同濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品或者空白對(duì)照或者待測(cè)樣本中；在37°C震蕩孵育30-60min ;生化反應(yīng)完成后，用磁力分離器分離磁性微球，再用洗滌液(0.05%吐溫-2010mM PBS)的清洗1-3次，到顯微鏡下面進(jìn)行觀察、拍照。
[0013](3)圖像分析
[0014]由于不同直徑的量子點(diǎn)在紫外光的激發(fā)下可呈現(xiàn)不同的顏色，如紅色、綠色、黃色，利用自編程軟件Gray Quantifier首先將圖像轉(zhuǎn)換到HSI (Hue Saturat1n Intensity)顏色空間下，HIS顏色模型是用H(色調(diào))、S(飽和度)、I (亮度)三個(gè)參數(shù)來表示顏色的，不同的顏色對(duì)應(yīng)著不同的H值，通過計(jì)算不同顏色磁珠的H值，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同顏色量子點(diǎn)的區(qū)分。第二步在區(qū)分出不同量子點(diǎn)顏色的基礎(chǔ)上，對(duì)每一個(gè)磁珠統(tǒng)計(jì)其灰度值，當(dāng)量子點(diǎn)越亮的時(shí)候，其所對(duì)應(yīng)的灰度值就越大。最后分析測(cè)得的灰度值與靶標(biāo)物質(zhì)濃度之間的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的定量檢測(cè)。
[0015]本發(fā)明提供的熒光量子點(diǎn)探針及其檢測(cè)生物分子的特點(diǎn)是:
[0016]本發(fā)明提供的熒光量子點(diǎn)探針，具有熒光信號(hào)強(qiáng)、不易衰減、生物分子活性好，可實(shí)現(xiàn)多種生物分子的高靈敏檢測(cè)。
[0017]I)本發(fā)明提供的熒光量子點(diǎn)探針量子點(diǎn)產(chǎn)率高、熒光信號(hào)強(qiáng)，且不易衰減；所用量子點(diǎn)尺寸較小，直徑為5-8nm，具有較大的比表面積，可以結(jié)合較多的生物分子；由于使用雙功能交聯(lián)劑SMCC將生物分子定向標(biāo)記在量子點(diǎn)表面，可以較好地保持生物分子的活性，避免量子點(diǎn)及生物分子的聚集，提高檢測(cè)靈敏度。常規(guī)的量子點(diǎn)標(biāo)記方法采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(l-3-(dimethylamino)propyl-3-ethylcarbodiimide meth1dide, EDC)及 N-輕基硫代硫代琥泊酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide NHS)活化系統(tǒng)，將量子點(diǎn)的羧基及生物分子的氨基活化，同時(shí)抗體的羧基也會(huì)被活化，這樣會(huì)導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光產(chǎn)率低、量子點(diǎn)探針聚集、生物分子之間發(fā)生交聯(lián)等作用，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低。
[0018]2)采用磁性微球捕獲待測(cè)生物分子可以將量子點(diǎn)熒光探針的熒光信號(hào)富集在微球表面，使得較弱的熒光信號(hào)就能檢測(cè)得到，提高了檢測(cè)的靈敏度。而常規(guī)的檢測(cè)方法則是將有限的熒光信號(hào)分子分散在較大的液相體系里，需要較多的熒光信號(hào)分子才能檢測(cè)到，檢測(cè)靈敏度低。
[0019]3)對(duì)于富集在磁性微球上的不同粒徑的量子點(diǎn)熒光探針，在紫外光的激發(fā)下呈現(xiàn)出不同的顏色:綠色、黃色、紅色，采用C⑶拍照和灰度掃描軟件可以很準(zhǔn)確地對(duì)不同的熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別和定量，可以避免不同量子點(diǎn)熒光探針之間信號(hào)及背景信號(hào)的干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度。而常規(guī)的測(cè)定量子點(diǎn)熒光光譜的檢測(cè)方法易受到不同量子點(diǎn)的熒光信號(hào)及測(cè)定溶液背景信號(hào)的干擾，導(dǎo)致測(cè)定濃度的準(zhǔn)確性及靈敏度下降。
【附圖說明】
[0020]圖1基于熒光量子點(diǎn)探針的測(cè)定流程示意圖。其中a)為一種蛋白檢測(cè)原理示意圖，b)為三種蛋白檢測(cè)原理示意圖。
[0021]圖2基于熒光量子點(diǎn)探針的三種蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中圖2a是該方法同步檢測(cè)濃度范圍從0.9ng/mL到2000ng/mL的三種革巴標(biāo)蛋白的結(jié)果，圖2b是檢測(cè)范圍內(nèi)的線性關(guān)系區(qū)域(3.9ng/mL 到 125ng/mL)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023]實(shí)施例1:可檢測(cè)一種蛋白質(zhì)癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)的焚光量子點(diǎn)探針
[0024](I)量子點(diǎn)焚光探針的制備
[0025]首先，取10-50yL 5-50mM SMCC 對(duì) 50-500 μ L 的氨基量子點(diǎn) 625 (Qdot625)進(jìn)行活化，25°C，30-60min ;隨后采取脫鹽柱的方法進(jìn)行純化；用10_50mM DTT對(duì)100-500 μ L CEA檢測(cè)抗體進(jìn)行還原，25°C，30-60min ;待脫鹽柱去除未反應(yīng)的抗體和其他雜質(zhì)后，將其與純化后的活化量子點(diǎn)于雜交儀中孵育，25°C，30-60min ;加入5_50 μ L β -巰基乙醇終止反應(yīng)，分離純化后保存于1mM PBS(PH 7.2)中，4°C避光備用。
[0026](2)檢測(cè)反應(yīng)
[0027]每個(gè)反應(yīng)中加5000-10000顆離體的CEA捕獲抗體標(biāo)記的磁珠捕獲探針，5_50nMQdot625檢測(cè)探針，借助樣本稀釋液(含有5-10 %小牛血清的1mMPBS)補(bǔ)齊體積到10-50ul/反應(yīng)，隨后加入10-50ul的不同濃度的CEA標(biāo)準(zhǔn)品(2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、1.9、0.9、0ng/mL)或者待測(cè)樣本中；在37°(:震蕩孵育 30_60min ；生化反應(yīng)完成后，用磁力分離器分離磁性微球，再用洗滌液(0.05%吐溫-2010mM PBS)的清洗1-3次，到顯微鏡下面進(jìn)行觀察、CXD拍照。
[0028](3)圖像及結(jié)果分析
[0029]Qdot625在紫外光激發(fā)下發(fā)射紅色熒光，將不同濃度的CEA檢測(cè)結(jié)果用CXD拍照，對(duì)得到的三原色光模式圖像利用自編程軟件轉(zhuǎn)換成HIS模式，H也即是色調(diào)分量可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種顏色的定性，達(dá)到區(qū)分靶標(biāo)物質(zhì)的目的。同時(shí)，軟件亦可實(shí)現(xiàn)將RGB圖像轉(zhuǎn)化成灰度值的轉(zhuǎn)換，統(tǒng)計(jì)分析每一磁珠表面結(jié)合的量子點(diǎn)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)CEA的定量檢測(cè)。結(jié)果表明:CEA濃度在0.39?50ng/mL范圍進(jìn)行線性擬合，方程為:logy =0.58621ogx I 3.57223 (R2 = 0.988)，線性關(guān)系良好，我們將檢測(cè)信號(hào)高于空白對(duì)照(不含CEA的緩沖液作為樣品)的信號(hào)的平均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為檢測(cè)限，算得該方法的檢測(cè)限為38pg/mL，遠(yuǎn)低于CEA的臨床閾值(5ng/mL)，滿足臨床應(yīng)用需求。
[0030]實(shí)施例2:可檢測(cè)多種蛋白CEA、神經(jīng)稀醇化酶(neuron-specific enolase NSE)、細(xì)胞角蛋白片段19(CYFRA21-1)的熒光量子點(diǎn)探針
[0031](I)量子點(diǎn)焚光探針的制備
[0032]首先，取10-50