一種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法及應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學免疫傳感技術(shù)領域，特別是涉及一種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法及應用。具體是采用AuNPs-PDDA-GR復合材料為基底材料制備一種檢測癌胚抗原的電化學免疫傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]癌胚抗原(CEA)是一個廣譜性腫瘤標志物，能反映出多種腫瘤的存在，扮演角色為功能性結(jié)腸癌配體，在大腸癌、乳腺癌和肺癌的輔助診斷，療效評價、病情控制和發(fā)展、監(jiān)測復發(fā)方面是一個較好的腫瘤標志物。目前測定CEA的免疫方法主要有酶聯(lián)免疫分析，熒光免疫分析，放射免疫分析等。這些方法靈敏可靠的優(yōu)點。但是存在一定的缺陷，如酶聯(lián)免疫分析和熒光免疫分析成本較高，并且存在試劑盒難以保存的問題，而放射性免疫分析的重現(xiàn)性較差，有輻射危害。電化學免疫傳感器由于所需儀器設備簡單，操作簡便，靈敏度高，選擇，成本低等優(yōu)點受到了廣泛關注。目前在疾病診斷領域面臨的主要挑戰(zhàn)是如何發(fā)展微型化、集成化和便攜化的監(jiān)測分析手段和設，建立一套簡單、快速、靈敏度高、能夠普遍推廣應用的方法。因此本發(fā)明制備了一種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器，將免疫學方法與電化學方法相結(jié)合，以K3Fe (CN)6S電化學探針，通過抗原抗體之間高度的特異性結(jié)合實現(xiàn)對CEA的檢測。
[0003]本發(fā)明AuNPs-PDDA-GR復合材料為基底材料，在此，PDDA作為導電聚合物一方面可以增加電極的導電性，另一方面可以改變石墨烯的表面性能阻止石墨烯團聚。I3DDA和石墨烯的協(xié)同效應可以使修飾電極具有更大有效面積，為AuNPs提供更多的依附位點，而AuNPs的量又能直接影響抗體在電極上的負載量。實驗中采用I3DDA-GN和AuNPs也將提高修飾電極的電子轉(zhuǎn)移途徑和生物兼容性。在本發(fā)明構(gòu)建的電化學免疫傳感成本低，穩(wěn)定性好，制備過程簡單，靈敏度高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是基于AuNPs-PDDA-GR復合材料為基底材料，構(gòu)建了一種無酶，無標記，穩(wěn)定性好，靈敏度高的電化學免疫傳感器；
本發(fā)明的目的之二是采用K3Fe(CN)6為電化學探針，通過抗原抗體之間高度的特異性結(jié)合實現(xiàn)對CEA的檢測。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
1.一種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法:
(I)用1.0 μπι,Ο.3 μπι,Ο.05 μπι的Al2O3拋光粉依次打磨直徑為4 mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min，氮氣吹干，取6~10 μ L AuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的AuNPs-PDDA-GR 得到 AuNPs-PDDA-GR/GCE ； (2)取50μ L 1.0-2.5 yg/mL的癌胚抗原抗體(ant1-CEA)標準溶液滴涂到電極表面，在4 °C冰箱中孵育12 h，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到ant1-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE ；
(3)取50μ L質(zhì)量分數(shù)為1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到電極表面，在37 V下孵育I h，以封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/ant 1-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE ；
(4)滴加50μ L濃度為0.1 pg/mL~10ng/mL的一系列不同濃度的癌胚抗原標準溶液用于與抗體特異性識別，在37 °C下孵育60 11^11，用？85(?!1 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器(CEA/BSA/anti_CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。
[0006]2.上述的AuNPs-PDDA-GR分散液的制備:
(I)PDDA-GR 的制備
稱取50 mg的氧化石墨烯(GO)溶于100 mL超純水中，超聲2 h得到均一分散的溶液，然后向該溶液中加入0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的TODA溶液，攪拌30 min。再向該溶液中加入0.5 mL 80%的水合肼，90 °(:油浴攪拌24 h，得到TODA-GR黑色懸濁液。離心洗滌至中性后重新分散到超純水中得到TODA-GR溶液；
(2)金納米溶液(AuNPs)的制備量取97 mL的超純水于錐形瓶，在攪拌下加入I mL 0.01 mol/L的HAuCljPl mL的0.03 mol/L檸檬酸二鈉，之后逐滴滴加I mL 0.047 mol/L的硼氫化鈉至溶液變?yōu)榱辆萍t色，再攪拌15 min得AuNPs溶液；
(3)AuNPs-PDDA-GR分散液的制備
取0.1 mL I3DDA-GR在攪拌的條件下加入到5 mL AuNPs溶液中，超聲60 min后攪拌30min，得到的混合溶液在9000轉(zhuǎn)離心10 min，用超純水洗滌3次后再重新分散到I mL超純水中，得到AuNPs-PDDA-GR分散液。
[0007]3.CEA 的檢測:
(1)實驗在電化學工作站上進行，采用三電極體系以所制備的免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極。在10 mL 2X 10 4 mol/L K3Fe(CN)f^PO-1 mol/L KCl的PBS (pH 7.4)緩沖溶液中進行測試；
(2)用差分脈沖伏安法對一系列不同濃度CEA標準溶液及未特異性結(jié)合CEA的電極進行檢測，掃描的電位區(qū)間為-0.2 V-0.6 V，掃描速度為100 mV/s，記錄示差脈沖伏安圖，根據(jù)所得的峰電流值和CEA濃度的關系，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替CEA標準溶液進行檢測。
[0008]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明以AuNPs-PDDA-GR復合材料為基底材料，一方面I3DDA和石墨烯的協(xié)同效應不僅能夠增加電極的導電性也能使修飾電極具有更大有效面積，為AuNPs提供更多的依附位點，另一方面AuNPs可以直接與抗體結(jié)合，將抗體固定在電極表面，無需使用交聯(lián)劑；；
(2)本發(fā)明制備的電化學免疫傳感器用于CEA的檢測，操作簡單，線性范圍寬，檢出限低，可以實現(xiàn)對CEA的簡單、快速、高靈敏檢測。線性范圍為0.1 pg/mL~10ng/mL，檢出限為0.05 pg/mL0
[0009]【附圖說明】:
圖1為不同濃度甲胎蛋白的電致化學發(fā)光強度圖；
圖2為不同濃度甲胎蛋白的相對電致化學發(fā)光強度與Igc的線性擬合圖。
[0010]其中，圖1中由a至Ij i的電致化學發(fā)光強度圖分別代表甲胎蛋白的濃度為0，
0.0001，0.0005，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，1，10 ng/mL。
[0011]【具體實施方式】:
為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。
[0012]實施例1 一種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法:
(1)用1.0 μπι,Ο.3 μπι,Ο.05 μπι的Al2O3拋光粉依次打磨直徑為4 mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min,氮氣吹干，取6 μ L AuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的AuNPs-PDDA-GR 得到 AuNPs-PDDA-GR/GCE ；
(2)取50μ L 1.0 μ g/mL的癌胚抗原抗體(ant1-CEA)標準溶液滴涂到電極表面，在4 °C冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到ant1-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE ；
(3)取50μ L質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到電極表面，在37°C下孵育I h，以封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/ant1-CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE ；
(4)滴加50μ L濃度為0.1 pg/mL~10ng/mL的一系列不同濃度的癌胚抗原標準溶液用于與抗體特異性識別，在37 °C下孵育60 11^11，用？85(?!1 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器(CEA/BSA/anti_CEA/AuNPs-PDDA-GR/GCE)。
[0013]實施例2 —種基于AuNPs-PDDA-GR復合材料的癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法:
(1)用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的Al2O3拋光粉依次打磨直徑為4 mm的GCE，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min，氮氣吹干，取8 μ L AuNPs-PDDA-GR分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的AuNPs-PDDA-GR得到 AuNPs-PDDA-GR/GCE ；
(2)取50μ L 2.0 μ g/mL的ant1-CEA標準溶液滴涂到電極表面，在4 °C冰箱中孵育12 h，用PBS (pH 7.4)緩沖