人絨毛膜促性腺激素腫瘤標(biāo)志物過糖基化修飾的檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人絨毛膜促性腺激素（hCG)腫瘤標(biāo)志物過糖基化修飾（hCG-H)的 檢測試劑盒，特別涉及一種聯(lián)合不同抗體同時對病料中hCG和hCG-H進(jìn)行檢測的試劑盒，屬 于腫瘤免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤和癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一，早期的發(fā)現(xiàn)和診斷以及正確治 療手段的選用是防治腫瘤癌癥疾病的關(guān)鍵。很多癌癥患者體內(nèi)某些生物分子的水平和結(jié)構(gòu) 會發(fā)生變化，這類分子往往可以作為發(fā)現(xiàn)癌癥的生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物中相當(dāng)大一 部分是糖蛋白。很多疾病尤其是腫瘤的糖蛋白會發(fā)生糖鏈變長、分支增多、結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜等 糖基化異?，F(xiàn)象，即過糖基化。通過測定病料里的生物標(biāo)志物水平可對這些疾病進(jìn)行早期 診斷，同時可以在治療過程中監(jiān)控生物標(biāo)志物的水平來判斷治療效果，從而及時選擇最有 效的治療方法。多種癌癥病人，如：絨毛膜癌、侵襲性葡萄胎等，在疾病的發(fā)生過程中其hCG 的含量和糖基化均會發(fā)生異常。監(jiān)測hCG含量及糖鏈結(jié)構(gòu)的變化對多種疾病的預(yù)防及早期 診斷具有非常重要的意義。體外免疫診斷方法可以通過抗體特異結(jié)合的方式測定病人樣本 里的生物標(biāo)志物水平從而早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤癌癥疾病，現(xiàn)已有多種針對hCG的免疫診斷 產(chǎn)品上市，但這些診斷產(chǎn)品忽略了過糖基化對診斷結(jié)果的影響，在實際應(yīng)用中可能會存在 以下問題：
[0003] (1)現(xiàn)有的免疫診斷試劑是基于標(biāo)志物與抗體的結(jié)合能力不受糖基化影響的假設(shè) 之上，未考慮病人hCG糖基化的個體差異。而糖基化可能會改變蛋白的結(jié)構(gòu)，從而影響抗原 與抗體的親和力，最終導(dǎo)致測量結(jié)果發(fā)生偏差。
[0004] (2)現(xiàn)有的免疫診斷試劑產(chǎn)品只能對生物標(biāo)志物hCG的蛋白總量進(jìn)行定量分析， 而無法從結(jié)構(gòu)上區(qū)分糖基化異常的hCG-Η和普通的hCG。
[0005] 如果在hCG檢測中能夠區(qū)別正常糖基化與過糖基化的hCG，將會大大增強(qiáng)疾病診 斷結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性。篩選出能夠識別糖基化發(fā)生變化的抗體是檢測hCG過 糖基化的關(guān)鍵，將會引導(dǎo)新一代的癌癥診斷試劑的研究開發(fā)。
[0006] 現(xiàn)在雖然有報道能夠特異性識別hCG C〇re20-糖基化異常的抗體，但是能夠直接 識別癌癥病人hCG中N-糖基化修飾異常的抗體還未能找到，主要是由于N-糖基化修飾的 微不均一性和弱免疫原性造成的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測hCG過糖基化程度的檢測試劑盒，本 試劑盒采用親和力受hCG的N-糖基化修飾變化影響顯著和基本不受影響的抗體聯(lián)用的方 式同時更客觀的檢測hCG的蛋白總量和N-糖基化修飾程度。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明通過免疫親和純化等手段從生殖細(xì)胞腫瘤患者的樣本中分離純化過糖基 化hCG-H并用質(zhì)譜技術(shù)分析其N-糖鏈結(jié)構(gòu)。篩選親和力受糖基化變化影響最顯著的抗hCG 抗體和親和力受糖基化變化影響最小的抗體。利用篩選出的抗體通過磁微粒技術(shù)和發(fā)光標(biāo) 記技術(shù)制備具有商業(yè)化前景的新一代腫瘤免疫診斷試劑盒。
[0010] 發(fā)明詳述
[0011] -種人絨毛膜促性腺激素腫瘤標(biāo)志物過糖基化修飾的檢測試劑盒，包括：
[0012] 包被有捕獲抗體的磁珠，
[0013] 所述捕獲抗體為具有與抗原h(huán)CG結(jié)合受糖基化影響最小的特性的捕獲抗體；
[0014] 與抗原h(huán)CG結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體B，
[0015] 所述與抗原h(huán)CG結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體B是具有與抗原h(huán)CG結(jié)合 受糖基化影響最小的特性的檢測抗體B ;
[0016] 與抗原h(huán)CG結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體C，
[0017] 所述與抗原h(huán)CG結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體C是具有與抗原h(huán)CG結(jié)合 受糖基化影響最大的特性的檢測抗體C ;
[0018] 以及抗體稀釋液、樣品稀釋液、洗滌液、底物液和終止液。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的捕獲抗體與抗原結(jié)合的抗原表位為未被糖鏈覆蓋的區(qū) 域。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的與抗原結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體B與抗 原結(jié)合的抗原表位為未被糖鏈覆蓋，但不同于捕獲抗體的抗原表位。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的與抗原結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體C與抗 原結(jié)合的抗原表位包含有能夠全部或部分被糖鏈覆蓋的區(qū)域。
[0022] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述檢測人絨毛膜促性腺激素腫瘤標(biāo)志物過糖基化 修飾試劑盒的制備方法。
[0023] 上述檢測人絨毛膜促性腺激素腫瘤標(biāo)志物過糖基化修飾的試劑盒的制備方法，包 括如下步驟：
[0024] (1)包被有捕獲抗體的磁珠的制備方法，步驟如下：
[0025] 將2mg磁珠置于離心管中，加入pH 5. 0，IOmM的MEST溶液500 μ L渦旋混勾，磁性 分離，棄去上清，重復(fù)上述步驟；
[0026] 用500 μ L MEST溶液重懸，加入2. 5mg的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，渦旋混勻，于室溫下活化30min，棄上清，用MEST洗滌，然后用 pH 8. 0的50mM磷酸鹽緩沖溶液洗滌磁珠；
[0027] 取150 μ g抗體MCA-A，用pH 8. 0的50mM磷酸鹽緩沖溶液配置成(λ 3mg/mL的溶液 加入到磁珠中，室溫反應(yīng)3h，然后經(jīng)磁性分離，棄上清；
[0028] 再加入lwt%牛血清白蛋白溶液500 yL室溫下封閉30min，磁性分離，棄上清，用 pH 8. 0的50mM磷酸鹽緩沖溶液洗滌并重懸至1 μ g/mL，制得包被有捕獲抗體的磁珠；
[0029] (2)與hCG結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體B的制備方法，步驟如下：
[0030] 分別取Img抗體MCA-B，加入10mg/mL的偶聯(lián)劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液（購自 Sigma公司），室溫靜置20min，加入0. lmol/L甘氨酸溶液10 μ L，室溫靜置5min，除鹽后，收 集活化的抗體；
[0031] 取I. 5mg堿性磷酸酶，加入5mg/mL的交聯(lián)劑琥泊酰亞胺-4-環(huán)已燒-1-碳酸酯溶 液，室溫靜置30min，除鹽，收集活化的堿性磷酸酶；
[0032] 將活化的抗體和活化的堿性磷酸酶混合，4°C靜置過夜，用Supperdex-200凝膠純 化柱純化得到堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體溶液，用磷酸鹽緩沖液重懸至1 μ g/mL，制得與hCG結(jié) 合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體B ;
[0033] (3)與hCG結(jié)合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體C的制備方法，步驟如下：
[0034] 分別取Img抗體MCA-C，加入10mg/mL的偶聯(lián)劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液（購自 Sigma公司），室溫靜置20min，加入0. lmol/L甘氨酸溶液10 μ L，室溫靜置5min，除鹽后，收 集活化的抗體；
[0035] 取I. 5mg堿性磷酸酶，加入5mg/mL的交聯(lián)劑琥泊酰亞胺-4-環(huán)已燒-1-碳酸酯溶 液，室溫靜置30min，除鹽，收集活化的堿性磷酸酶；
[0036] 將活化的抗體和活化的堿性磷酸酶混合，4°C靜置過夜，用Supperdex-200凝膠純 化柱純化得到堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體溶液，用磷酸鹽緩沖液重懸至1 μ g/mL，制得與hCG結(jié) 合的偶聯(lián)堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測抗體C ;
[0037] (4)按現(xiàn)有技術(shù)配制稀釋液、洗滌液、底物溶液和終止液，然后包裝后，即得檢測人 絨毛膜促性腺激素腫瘤標(biāo)志物過糖基化修飾的檢測試劑盒。
[0038] 所述步驟（1)、（2)和（3)中捕獲抗體和檢測抗體采用如下方法篩選：
[0039] A、制備抗原并鑒定：收集病料（病人尿液）利用免疫親和層析技術(shù)從該樣品溶液 中分離純化過糖基化hCG-Η作為抗原；用N_glycanase(PNGase F)對抗原進(jìn)行去糖基化處 理，用PGC小柱收集酶切下來的糖鏈，采用液質(zhì)聯(lián)用方法對N-糖鏈進(jìn)行分析；同時對hCG進(jìn) 行同步處理作為正常糖基化的對照；
[0040] B、篩選不同用途的抗體并驗證：通過生物膜光干涉技術(shù)（BLI)從十幾種商品化的 單克隆抗體中篩選出3種抗體，其中抗體A(MCA-A)和抗體B(MCA-B)的親和力基本不受hCG 的N-糖基化影響，抗體C (MCA-C)與hCG-Η的結(jié)合力相比hCG明顯降低；因此以抗體A作為 捕獲抗體，抗體B和抗體C作為檢測抗體。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中抗體稀釋液每升組分如下：
[0042] NaCl 8. 00g、KH2PO4 0· 20g、Na2HPO4 · 12H20 2. 90g、KCl 0· 20g，少量超純水溶解， 定容至1000mL。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中樣品稀釋液每升組分如下：
[0044] NaCl 8. 00g、KH2PO4 0· 20g、Na2HPO4 · 12H20 2. 90g、KCl 0· 20g，少量超純水溶解， 定容至1000mL。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中洗滌液每升組分如下：
[0046] NaCl 8. 00g、KH2PO4 0· 20g、Na2HPO4 · 12H20 2. 90g、KCl 0· 20g，超純水溶解，加入 Tween-200. 50mL，定容至 lOOOmL，搖勻。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中底物溶液組分如下：
[0048] lmol/L二乙醇胺、0· 5mmol/L氯化鎂，調(diào)節(jié)pH值到9. 8,加入pNPP，使其終濃度為 lmg/mL〇
[0049] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中終止液組分如下：
[0050] 濃度為3mol/L的NaOH溶液。
[0051] 有益效果
[0052] 本發(fā)明制備了一種精確測定樣品中hCG的濃度并判斷其是否發(fā)生過糖基化的試 劑盒，不僅可以檢測hCG的濃度，而且還能區(qū)分hCG-H與正常hCG，大大提高了免疫診斷方法 的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率，對于實際樣品中過糖基化hCG的檢測具有極大的實用價值。
【附圖說明】
[0053] 圖 I hCG 和 hCG-Η 的 SDS-PAGE 電泳圖；
[0054] 圖2 hCG和hCG