本發(fā)明屬于病原物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條。

背景技術(shù)：

馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是侵染煙草的主要病毒之一。它引發(fā)的病毒病每年導(dǎo)致煙草產(chǎn)業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？焖佟?zhǔn)確地定性檢測(cè)相關(guān)病毒是生產(chǎn)上防控病害、減少損失的重要手段之一。

在科學(xué)研究中，植物病毒的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)法(癥狀類(lèi)型辨別、鑒別寄主等)、電鏡技術(shù)、血清學(xué)檢測(cè)法(酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等)和分子生物學(xué)檢測(cè)法(包括PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)等)等。分離病毒照電鏡雖然是診斷病毒的有效手段，其特異性強(qiáng)，但非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，不適合推廣使用。血清學(xué)檢測(cè)方法比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。免疫熒光、ELLSA等方法雖然具有微量、特異、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但需要比較完備的試驗(yàn)儀器和經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員來(lái)操作和判斷結(jié)果，檢測(cè)一批樣品整個(gè)流程需要4～8小時(shí)，對(duì)于基層工作場(chǎng)所很難做到。PCR及核酸探針的診斷更需要有特殊的儀器和藥品，技術(shù)含量很高，一般只適于實(shí)驗(yàn)室診斷或研究應(yīng)用，很難在基層推廣。因此，迫切需要建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、廉價(jià)并且適合于基層應(yīng)用的病毒診斷方法。

1971年膠體金作為標(biāo)記物開(kāi)始用于免疫組織化學(xué)。Faulk等應(yīng)用電鏡免疫膠體金染色法觀察沙門(mén)氏菌。許多學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)膠體金能穩(wěn)定迅速地吸附蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的生物活性無(wú)明顯改變。它可以作為探針進(jìn)行細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精確定位，也可以用于日常的免疫診斷，進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位。膠體金溶液是指分散相粒子直徑在l～150nm之間的金溶膠，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。免疫膠體金層析技術(shù)(Gold immunochromatography assay，GICA)作為一種新的免疫學(xué)檢測(cè)方法，是20世紀(jì)80年代在免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種新型獨(dú)特的診斷技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)、層析分析技術(shù)、單(多)克隆抗體技術(shù)和新材料技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染、操作簡(jiǎn)單和無(wú)需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代初到中期，膠體金標(biāo)記免疫層析診斷技術(shù)開(kāi)始進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用。利用這種技術(shù)開(kāi)發(fā)的膠體金快速檢測(cè)試紙條具有操作簡(jiǎn)便、快捷、可單份檢測(cè)、便于保存、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，可在現(xiàn)場(chǎng)(臨床)對(duì)目標(biāo)病原進(jìn)行初篩，節(jié)省大量的人力、物力。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這種技術(shù)除用于激素、傳染病病原的抗原和抗體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)的檢測(cè)外，還發(fā)展到了對(duì)毒品等小分子物質(zhì)的檢測(cè)。檢測(cè)的標(biāo)本類(lèi)型也涵蓋了血清、血漿、全血、尿、糞便及唾液等，顯示出了廣闊的前景和巨大的應(yīng)用價(jià)值。

目前，膠體金試紙條在國(guó)內(nèi)主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，植物病毒方面很少見(jiàn)到。在農(nóng)牧領(lǐng)域，較少有成熟的產(chǎn)品，更多的出現(xiàn)在相關(guān)的科研項(xiàng)目中。孫艷等(2011)應(yīng)用膠體金技術(shù)進(jìn)行了黃瓜細(xì)菌性角斑病(Pseudomona.s.syringae pv.Lachrymans)的快速檢測(cè)研究。國(guó)內(nèi)涉及到煙草病毒病檢測(cè)的商用膠體金試紙條非常少。國(guó)外的商品化試紙條非常昂貴，價(jià)格在50～60元人民幣/張，不適于生產(chǎn)上大批煙苗的檢測(cè)使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種廣東煙區(qū)PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條。核心技術(shù)是開(kāi)發(fā)針對(duì)煙草苗期主要病毒馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)的單重膠體金檢測(cè)試紙條，讓煙農(nóng)操作方便，診斷及時(shí)準(zhǔn)確。

本發(fā)明的目的是提供一株可以產(chǎn)生PVY特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-8。

本發(fā)明另一目的是提供一種PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條。

本發(fā)明的再一目的是提供所述PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一株產(chǎn)生PVY的特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12677，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

同時(shí)，由上述雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-8分泌產(chǎn)生的PVY特異單抗也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

另外，上述PVY特異抗體在制備PVY病毒檢測(cè)制劑或產(chǎn)品方面的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述PVY病毒是指廣東煙區(qū)的PVY病毒。

具體地，由上述PVY特異抗體制備的PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和背襯組成；所述樣品墊、膠體金墊和NC膜按照從左至右、從上至下的順序依次結(jié)合在背襯同一面上，膠體金墊和NC膜的端部重疊；所述吸水濾紙結(jié)合在NC膜的另一端；所述膠體金墊上包被有膠體金標(biāo)記的PVY特異抗體，所述NC膜上設(shè)置有檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和控制線(xiàn)(C線(xiàn))，且檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))位于膠體金墊和控制線(xiàn)(C線(xiàn))之間的位置；檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))上包被有PVY病毒的特異抗原；控制線(xiàn)(C線(xiàn))上包被有膠體金標(biāo)記的二抗。

上述PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條在PVY病毒的檢測(cè)方面，具有很好的應(yīng)用前景，尤其是針對(duì)廣東煙區(qū)的PVY病毒，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10^-2mg/mL。

本發(fā)明利用競(jìng)爭(zhēng)抑制法，成功構(gòu)建了PVY單重檢測(cè)試紙條。其基本原理如下：

膠體金標(biāo)記的PVY特異抗體吸附在結(jié)合墊(即膠體金墊)上，PVY病毒的特異抗原以條帶狀固定在硝酸纖維膜的測(cè)試線(xiàn)(T線(xiàn))處上，膠體金標(biāo)記的二抗固定在硝酸纖維膜的控制線(xiàn)(C線(xiàn))處。當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記特異試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)記抗體的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合。

當(dāng)待測(cè)樣本含有PVY病毒時(shí)，它與溶解在樣本墊上的膠體金標(biāo)記的特異抗體相互反應(yīng)；再移動(dòng)至固定的抗原區(qū)域時(shí)，已經(jīng)沒(méi)有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，T線(xiàn)處沒(méi)有紅棕色線(xiàn)條出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。游離的金標(biāo)抗體或者金標(biāo)抗體復(fù)合物流經(jīng)C處時(shí)，與該處的二抗結(jié)合出現(xiàn)紅棕色質(zhì)控帶。

當(dāng)待測(cè)樣本沒(méi)有PVY病毒時(shí)，它與溶解在結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記抗體不發(fā)生反應(yīng)；再移動(dòng)至固定的抗原區(qū)域時(shí)，有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，而被截留聚集在T線(xiàn)上，可通過(guò)肉眼觀察到紅棕色條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次針對(duì)植物病毒構(gòu)建了PVY單重病毒的檢測(cè)試紙條，創(chuàng)新性很強(qiáng)，開(kāi)發(fā)的PVY單重病毒快速檢測(cè)試紙條利用膠體金免疫層析技術(shù)，結(jié)合了色譜層析和免疫反應(yīng)的原理，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確地定性檢測(cè)病原的目的，可以在田間快速、大規(guī)模的檢測(cè)樣品，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。與ELISA方法相比，本發(fā)明的試紙條具有快速、靈敏、直觀、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、對(duì)人體無(wú)害、易于大量樣本的檢測(cè)等特點(diǎn)，讓煙農(nóng)操作方便，診斷及時(shí)準(zhǔn)確。

更重要的是，本發(fā)明的試紙條檢測(cè)的病毒的特異性很強(qiáng)，是專(zhuān)門(mén)針對(duì)廣東煙區(qū)的PVY的檢測(cè)。該試紙條采用的關(guān)鍵抗體是專(zhuān)門(mén)針對(duì)廣東煙區(qū)PVY的流行株系構(gòu)建得到，所制備的針對(duì)性的單克隆抗體靈敏度非常高，可以達(dá)到10^-2mg/mL，對(duì)廣東煙區(qū)PVY病毒的快速檢測(cè)具有重要的意義。

另外，本發(fā)明的整個(gè)產(chǎn)品體積小、攜帶方便，不需要儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單?？涩F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，在3～10min內(nèi)即可出結(jié)果；結(jié)果可由肉眼根據(jù)T線(xiàn)顏色的深淺進(jìn)行判斷，非常適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)初篩，在實(shí)際生產(chǎn)中很有應(yīng)用價(jià)值，具有強(qiáng)大的推廣應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為CP-P-GD連接到pET30a-GST載體的重組載體示意圖。

圖2為CP-P-GD蛋白小量表達(dá)檢測(cè)電泳圖；M：marker，1：目標(biāo)蛋白，2：未誘導(dǎo)對(duì)照。

圖3為CP-P-GD蛋白大量表達(dá)檢測(cè)電泳圖；M：marker，1：上清，2：沉淀。

圖4為CP-P-GD蛋白純化結(jié)果；M：marker，1：樣品稀釋100倍。

圖5為膠體金快速檢測(cè)試紙條的示意圖。

圖6為PVY單重病毒膠體快速金檢測(cè)試紙條檢測(cè)效果；(左邊為陰性樣本，右邊為陽(yáng)性樣本)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1廣東煙區(qū)PVY病毒株的分離

1、2012～2014年，從廣東省韶關(guān)市的南雄、始興、乳源、樂(lè)昌，清遠(yuǎn)市的連洲，梅州市的五華、蕉嶺、大埔和梅縣等9個(gè)地縣29個(gè)鎮(zhèn)，33個(gè)村的煙田里表現(xiàn)普通花葉病的煙草植株上進(jìn)行取樣。取樣點(diǎn)覆蓋廣東省的所有煙區(qū)。共72個(gè)樣品。將之分別進(jìn)行生物學(xué)和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)的分離、鑒定。

共分離得到49個(gè)PVY分離物，都已得到ELISA檢測(cè)驗(yàn)證。生物學(xué)鑒定結(jié)果表明：所采PVY分離物屬于普通株系。

2、對(duì)PVY病毒的全CP(coat protein))基因進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)，堿裂解法抽提質(zhì)粒后，進(jìn)行雙酶切鑒定，得到含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

測(cè)序得到的PVY CP基因?yàn)?96bp(序列如SEQ ID NO.3所示)，將之分別命名為CP-P-GD。

進(jìn)入NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)，用Blast工具將CP-P-GD序列分別與數(shù)據(jù)庫(kù)里的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

3、分析結(jié)果顯示：CP-P-GD序列與其他報(bào)道的PVY CP基因的序列的相似性為80.5％～95％。這說(shuō)明本研究獲得的在廣東煙區(qū)占主要優(yōu)勢(shì)地位的PVY分離物與普通的PVY株系存在一定差異。

實(shí)施例2制備CP基因原核表達(dá)特異蛋白

1、制備CP-P-GD原核表達(dá)蛋白，將CP-P-GD構(gòu)建到pET30a-GST載體上，轉(zhuǎn)化BL21菌株，進(jìn)行原核表達(dá)，純化表達(dá)蛋白。

相關(guān)信息匯總?cè)缦卤?所示。

表1

2、具體方法如下。

(1)目的基因序列：根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后序列，兩端加酶切位點(diǎn)EcoR I和Xho I。合成目的基因到pUC57載體。

(2)通過(guò)酶切、連接，將目的基因連接到pET30a-GST載體，構(gòu)建后的重組載體示意圖如附圖1所示。

基因片段酶切：43μl重組質(zhì)粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl 10×Buffer，37℃過(guò)夜反應(yīng)。(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，BPI)。

載體酶切：43μl載體(pET30a-GST)質(zhì)粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl 10×Buffer，37℃過(guò)夜反應(yīng)。(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，BPI)。

連接：1μl載體酶切片段，3μl基因酶切片段，1μl連接酶(BPI)，5μl 2×Rapid Buffer，混勻，室溫反應(yīng)30min。

(3)將重組載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞：

1)取出-80℃保存的100μl感受態(tài)細(xì)胞(BL21)，放在冰上緩慢解凍；

2)將感受態(tài)細(xì)胞加入1μl重組質(zhì)粒的管中，混勻，冰上放置30min；

3)42℃熱激90s；

4)冰浴2min后，加入800μl無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基；

5)37℃培養(yǎng)45min；

6)5000rpm離心3min，棄大部分上清，留約100-150μl，重懸菌體，選擇有相應(yīng)抗性的LB平板，涂板；

7)晾干，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。然后測(cè)序驗(yàn)證正確。

(4)小量表達(dá)檢測(cè)：

1)從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到1.5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)；

2)培養(yǎng)至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)誘導(dǎo)，37℃，200rpm培養(yǎng)2h；

3)取1ml誘導(dǎo)的菌液，12000rpm，離心1min，棄上清，沉淀用50-100μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入緩沖液的量視菌體量而定)；

4)加入與緩沖液等體積的2×loading buffer，100℃煮5min，電泳檢測(cè)(15％SDS-PAGE)。

結(jié)果如附圖2所示，有正確表達(dá)條帶。

(5)大量表達(dá)：

1)挑選驗(yàn)證正確的菌株，接5～10μl活化的菌液到5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)；

2)將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到500mL LB液體培養(yǎng)基混合，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)誘導(dǎo)4h；

3)大量收菌：用400ml大離心筒，6000rpm，離心5min，棄上清；

4)超聲破菌：沉淀用25ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超聲；

5)電泳確定表達(dá)形式：取100μl超聲(500W,90次，每次3s，間隔6s)后的菌懸液，12000rpm，離心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干凈后，沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，加入50μl 2×loading buffer，100℃煮5min，電泳檢測(cè)(15％SDS-PAGE)。

結(jié)果如附圖3所示，蛋白有表達(dá)，主要表達(dá)在沉淀中。

(6)蛋白質(zhì)純化(洗包涵體)：

1)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸超聲離心得到的沉淀，靜置10min；

2)12000rpm，離心10min，上清轉(zhuǎn)入另一管中保存；

3)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，靜置10min；

4)12000rpm，離心10min，棄上清；

5)重復(fù)3)、4)一次；

6)先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白；

7)12000rpm，離心10min，收集上清，取50μl電泳(15％SDS-PAGE)。

結(jié)果如附圖4所示，純化得到目的蛋白CP-P-GD。

實(shí)施例3構(gòu)建表達(dá)PVY病毒特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株

利用實(shí)施例2得到的CP基因原核表達(dá)特異蛋白，用表達(dá)蛋白免疫小鼠；進(jìn)行融合試驗(yàn)，得到產(chǎn)生PVY病毒的特異單抗的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

1、具體方法如表2所示。

表2

2、具體方法如下：

(1)免疫

1)用“PVY”，按60ug蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，編號(hào)為：1、2，3，4。

2)初免兩周后，皮下第一次加強(qiáng)免疫，免疫量為30ug蛋白/只。

3)第一次加強(qiáng)免疫兩周后，皮下第二次加強(qiáng)免疫，免疫量為30ug蛋白/只。

4)第二次加強(qiáng)免疫兩周后，皮下第三次加強(qiáng)免疫，免疫量為30ug蛋白/只。

5)第二次加強(qiáng)免疫一周后，眼眶取血，測(cè)血清效價(jià)。

(2)免疫效價(jià)檢測(cè)：

用“PVY”，2ug/ml，4℃包被過(guò)夜；2％牛奶，37℃封閉2h；血清從200倍開(kāi)始2倍梯度稀釋?zhuān)瞻讓?duì)照(blank)為PBS，陰性對(duì)照(negative)為陰性血清200倍稀釋。

表3免疫效價(jià)(效價(jià)為大于最大OD/2的最小OD讀數(shù)所對(duì)應(yīng)的稀釋度)

根據(jù)結(jié)果選取沖擊2號(hào)小鼠做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。融合前，用免疫原“PVY”50ug，腹腔沖擊免疫2號(hào)小鼠。

(2)細(xì)胞融合

取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，采用PEG法進(jìn)行融合。融合完細(xì)胞用半固體培養(yǎng)基(含HAT)進(jìn)行篩選培養(yǎng)。

1)實(shí)驗(yàn)器材：滅菌的手術(shù)器械(包括三把剪刀、三把鑷子、一個(gè)細(xì)胞篩、一個(gè)注射器的內(nèi)芯、一個(gè)平皿)，濕盒，2個(gè)500ml燒杯，2個(gè)50ml離心管，3個(gè)15ml離心管。

2)實(shí)驗(yàn)試劑：IMDM培養(yǎng)基；IMDM完全培養(yǎng)基(含15％血清)；2.2％甲基纖維素：廠(chǎng)家：SIGMA，貨號(hào)：M0262-100G；新生牛血清10ml；PEG1500：廠(chǎng)家：Roche，貨號(hào)：78364；HAT：廠(chǎng)家：Sigma，貨號(hào)：H0262-10VL；HT：廠(chǎng)家：Sigma，貨號(hào)：H0137-10VL。

3)融合實(shí)驗(yàn)步驟

a.將狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞輕柔的從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來(lái)，吸入到50ml離心管中。

b.小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75％的酒精中浸泡5min。

c.在平皿中倒入少量無(wú)血清的IMDM，將細(xì)胞篩及注射器內(nèi)芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細(xì)胞篩上。用注射器的內(nèi)芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細(xì)胞吸入到裝sp2/0的離心管中，離心1500rad/min，5min。

d.用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細(xì)胞到15ml離心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中備用。

e.將離心好的細(xì)胞，倒掉上清，用無(wú)血清的IMDM將細(xì)胞小心輕柔地吹勻，離心(1500rad/min，5min)。

f.將離心好的細(xì)胞上清盡量倒掉。拍打離心管底充分懸浮細(xì)胞，將離心管放入37℃溫水中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml的PEG，加完后，在溫水中靜置1min。然后2min內(nèi)緩慢加入2ml的無(wú)血清的IMDM，接著2min內(nèi)緩慢加入8ml無(wú)血清的IMDM。離心1000rad/min，5min。

g.倒掉上清，加入10ml的血清，小心的將細(xì)胞吹勻，倒入前面準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞。再加入25ml滅過(guò)菌的半固體培養(yǎng)基，充分混勻。然后均勻倒入30個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養(yǎng)。

(3)挑克隆

挑10板×93個(gè)細(xì)胞單克隆，培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(事先用胸腺細(xì)胞鋪板，100ul/孔)。

(4)單克隆細(xì)胞1篩

用“PVY”包板，對(duì)挑選的克隆采用ELISA方法，做第一次篩選，得到19株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

1)實(shí)驗(yàn)試劑：

包被液：碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6

PBS緩沖液pH7.4

封閉液：2％牛奶in PBS

洗液：PBS－T(0.05％吐溫，PBS)

顯色液:1％A液+10％B液(A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％H2O2in檸檬酸緩沖液)

終止液：2M硫酸

二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP

2)實(shí)驗(yàn)步驟

用包被液稀釋“PVY”，終濃度為2ug/ml，100ul/孔，4℃，過(guò)夜；后用洗液洗滌3次。

a.2％牛奶封閉液封閉，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗滌3次。

b.加入一抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清)、陰性對(duì)照(SP2/0培養(yǎng)上清)、空白對(duì)照(PBS)、陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性血清PBS 1000倍稀釋)，均為100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗滌3次。

c.加入PBS稀釋20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗滌3次。

d.顯色，顯色液100ul/孔，顯色時(shí)間為5min左右。

e.每孔加入50ul終止液終止。

f.雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。包括對(duì)免疫蛋白篩選呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株的數(shù)據(jù)、陽(yáng)性對(duì)照讀數(shù)、空白對(duì)照讀數(shù)以及陰性對(duì)照讀數(shù)。

根據(jù)結(jié)果篩選得到對(duì)免疫蛋白篩選呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株，共19株。

(5)單克隆細(xì)胞2篩

將19株陽(yáng)性的細(xì)胞株，用“PVY”及標(biāo)簽蛋白再次包板，采用ELISA方法，做第二次篩選，得到5株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

(6)將篩選出來(lái)的5株陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行亞類(lèi)鑒定，最后得到3株IgG類(lèi)型的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

1)實(shí)驗(yàn)試劑

包被抗體：(Southern Biotech)

封閉液：2％BSA+3％蔗糖in PBS；

顯色液:0.2ml A液+10ul 30％H₂O₂in 10ml B液(A液：15mg/ml ABTS in H2O；B液：檸檬酸緩沖液,pH4.0)

2)各型亞類(lèi)二抗：(Southern Biotech)實(shí)驗(yàn)步驟：

a.用100mM PBS(pH7.4)稀釋包被抗體至0.5ug/ml，每孔加0.1ml，4℃，過(guò)夜。

b.PBS-T洗2次，每孔加入200ul封閉液，370C孵育2h。

c.PBS-T洗3次；每孔加入100ul雜交瘤上清，370C孵育1h。

d.PBS-T洗3次；用封閉液1：10000(κ,λ)或1：20000(其它的)稀釋的HRP標(biāo)記的抗體0.1ml每孔，分別加入適當(dāng)?shù)目字校?70C孵育1h。

e.PBS-T洗3次；每孔加50ul底物溶液，10～20min內(nèi)于雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。

表4

最終得到19株產(chǎn)生PVY的特異單抗的雜交瘤細(xì)胞株，選取最好的一株培育保存，并命名為BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12677，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

實(shí)施例4制備PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條

1、實(shí)驗(yàn)材料

(1)膠體金顆粒：枸櫞酸鈉還原法制備(30nm)

(2)PVY病毒的特異性抗體

將實(shí)施例3的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株BALBc-15-8進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)，進(jìn)行Protein A過(guò)柱純化，得到PVY病毒的特異單克隆抗體。

(3)二抗：Goat-anti-Rabbit Ig G

特異抗體膠體金標(biāo)記的pH為8.2，膠體金標(biāo)記二抗的pH為9.0。

金標(biāo)抗體用BSA做穩(wěn)定劑。

2、儀器設(shè)備：

JY-EQ03連續(xù)式劃膜儀，JY-EQ02噴金機(jī)，JY-EQ01斬切式切刀，I JY-EQ05壓殼機(jī)。

3、耗材：

JY-D101DB-6底板，JY-X115H5072吸水紙，JY-BX101金標(biāo)墊，JY-JZ112fusion 3樣品墊，JY-C111A-11塑料卡。

4、試紙條的組裝

(1)如附圖5所示，將背襯(背襯)、樣品墊、吸水墊(吸水濾紙)、硝酸纖維素膜(NC膜)、金標(biāo)墊(膠體金墊)粘在一起，利用切條機(jī)將其切成4.5mm寬的試紙條，于4℃干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)試紙條組裝條件：

試紙條的組裝要求在室溫恒定干燥的環(huán)境下，濕度大或溫度過(guò)高會(huì)影響玻璃纖維、NC膜的性質(zhì)和二抗、包被抗體、金標(biāo)抗體的活性，進(jìn)而影響試紙條的層析速度及顯色反應(yīng)。各部分組裝時(shí)，要粘貼緊密不要?jiǎng)澋絅C膜，否則會(huì)影響出線(xiàn)效果。本試紙條在室溫25℃、濕度低于40％條件下進(jìn)行組裝。

5、本發(fā)明的PVY單重病毒檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)描述如下：

由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和背襯組成；所述樣品墊、膠體金墊和NC膜按照從左至右、從上至下的順序依次結(jié)合在背襯同一面上，膠體金墊和NC膜的端部重疊；所述吸水濾紙結(jié)合在NC膜的另一端；所述膠體金墊上包被有膠體金標(biāo)記的PVY特異抗體，所述NC膜上設(shè)置有檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和控制線(xiàn)(C線(xiàn))，且檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))位于膠體金墊和控制線(xiàn)(C線(xiàn))之間的位置；檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))上包被有PVY病毒的特異抗原；所述膠體金墊上的金標(biāo)抗體可以與檢測(cè)線(xiàn)上的抗原結(jié)合反應(yīng)并顯色；控制線(xiàn)(C線(xiàn))上包被有膠體金標(biāo)記的二抗。

該試紙條的檢測(cè)基本原理如下：

膠體金標(biāo)記的PVY特異抗體吸附在結(jié)合墊(即膠體金墊)上，PVY病毒的特異抗原以條帶狀固定在硝酸纖維膜的測(cè)試線(xiàn)(T線(xiàn))處上，膠體金標(biāo)記的二抗固定在硝酸纖維膜的控制線(xiàn)(C線(xiàn))處。當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記特異試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)記抗體的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合。

當(dāng)待測(cè)樣本含有PVY病毒時(shí)，它與溶解在樣本墊上的膠體金標(biāo)記的相應(yīng)病毒的特異抗體相互反應(yīng)；再移動(dòng)至固定的抗原區(qū)域時(shí)，已經(jīng)沒(méi)有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，T線(xiàn)處沒(méi)有紅棕色線(xiàn)條出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。游離的金標(biāo)抗體或者金標(biāo)抗體復(fù)合物流經(jīng)C處時(shí)，與該處的二抗結(jié)合出現(xiàn)紅棕色質(zhì)控帶。

當(dāng)待測(cè)樣本沒(méi)有PVY病毒時(shí)，它與溶解在結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記抗體不發(fā)生反應(yīng)；再移動(dòng)至固定的抗原區(qū)域時(shí)，有足夠的金標(biāo)抗體與固定的抗原反應(yīng)，而被截留聚集在T線(xiàn)上，可通過(guò)肉眼觀察到紅棕色條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

實(shí)施例5膠體金快速檢測(cè)試紙條的樣品檢測(cè)

1、取感染了PVY病毒的煙草，以及健康煙草的葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，各0.2g，加PBS緩沖液(pH8.0，0.01M)，進(jìn)行研磨，不要用自來(lái)水稀釋葉子。

各取50uL研磨液加到制備好的試紙條樣品墊上，五分鐘后判讀結(jié)果。

2、結(jié)果如附圖6所示。感病煙草樣本的試紙條C處質(zhì)檢帶出現(xiàn)明顯的紅棕色條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

健康煙草樣本的試紙條C處質(zhì)檢以及T處檢測(cè)帶帶出現(xiàn)明顯的2條紅棕色條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

結(jié)果顯示，本發(fā)明的PVY單重病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條對(duì)PVY病毒的檢測(cè)效果良好。

實(shí)施例6膠體金快速檢測(cè)試紙條的靈敏度檢測(cè)

1、將0.1g煙草病樣用0.01mol/L的PBS稀釋6個(gè)系列濃度，與樣品處理液等體積混合后，終濃度為10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4mg/mL，以PBS與樣品處理液等體積混合為陰性對(duì)照，測(cè)定試紙條靈敏度。

2、結(jié)果顯示，當(dāng)煙草病樣的濃度為10^-3mg/mL時(shí)，試紙條的檢測(cè)條帶模糊不清。因此，本發(fā)明試紙條的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10^-2mg/mL。