專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)岱取⒑Ｂ逡蚣傍f片快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是嗎啡、海洛因及鴉片快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。
吸毒成癮是全球性的社會(huì)公害，不僅危害社會(huì)的安定，而且危害人類(lèi)的健康。嗎啡、海洛因及鴉片等是主要毒品種類(lèi)，其在體內(nèi)代謝的終產(chǎn)物是小分子量的嗎啡，檢測(cè)尿液中的嗎啡含量可反映出體內(nèi)這些毒品的水平。通常是對(duì)尿液樣品進(jìn)行薄層色譜法和高壓液相色譜法分析檢測(cè)，這些檢測(cè)方法需要昂貴的檢測(cè)設(shè)備和較高的技術(shù)要求，并且需要一天以后出結(jié)果，花費(fèi)也較高，在實(shí)際應(yīng)用中存在許多困難，尤其是不能滿足現(xiàn)場(chǎng)篩檢的要求，且價(jià)格昂貴。然而在現(xiàn)實(shí)的反毒禁毒斗爭(zhēng)中，迫切需要一種特異、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)試劑，以便于查禁人員現(xiàn)場(chǎng)使用的快速準(zhǔn)確檢測(cè)出吸毒者體內(nèi)微量嗎啡，滿足現(xiàn)場(chǎng)篩檢的要求。
本發(fā)明的目的是提供一種能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出吸毒者體內(nèi)微量嗎啡的檢測(cè)試紙條及其制備方法。這種試紙條具有高度的特異性和靈敏，操作簡(jiǎn)便易學(xué)，短時(shí)間內(nèi)就能判讀結(jié)果。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的利用單克隆抗體技術(shù)及金標(biāo)免疫分析法研制出嗎啡、海洛因及鴉片快速檢測(cè)試紙條，它能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出吸毒者體內(nèi)的微量嗎啡，并有較高的特異性和靈敏度。
上述快速檢測(cè)試紙條的制備方法按以下步驟制得1)制備檢測(cè)用免疫原及抗原采用混合酸酐法制取嗎啡抗原；2)單克隆抗體的制備與篩選用合成的嗎啡抗原免疫小鼠，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞接種于甲基纖維素培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移克隆、篩選等步驟，最終獲得抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株；3)制備兔抗合成嗎啡抗原的免疫血清；4)制備膠體金標(biāo)記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，按比例與合成的嗎啡抗原的單克隆抗體混合進(jìn)行標(biāo)記；5)檢測(cè)試紙條的制備選擇適當(dāng)?shù)臐舛葘⒚庖哐蹇贵w和金標(biāo)記抗體分別固定于不同的載體上，經(jīng)粘合、切割等步聚制備成檢測(cè)試紙。
上述方法中采用混合酸酐將小分子量嗎啡與大分子載體連接制備嗎啡合成抗原。
上述方法中的檢測(cè)紙條的制備是將不同含量抗體以0.5-1.5μl/點(diǎn)打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于1-6％牛血清白蛋白內(nèi)37℃封閉1-3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗數(shù)次，室溫涼干，4℃密封保存；在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST20-50μl，加入抗嗎啡的單克隆抗體標(biāo)記的膠體金溶液20-60μl，室溫涼干，4℃密封保存，分別取大小適合的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和大小適合的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在大小適合的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
本發(fā)明的快速檢測(cè)試紙條具有高度的特異性和靈敏度，還具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，并且不用特殊儀器，費(fèi)用較低廉，操作簡(jiǎn)便易學(xué)，短時(shí)間內(nèi)就能判讀結(jié)果，可滿足現(xiàn)場(chǎng)篩檢的要求等特點(diǎn)?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，達(dá)到及時(shí)準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控癮君子的吸毒行為，有效地打擊毒品的犯罪活動(dòng)，這對(duì)人民的身體健康和社會(huì)的安定團(tuán)結(jié)都有重要意義，對(duì)社會(huì)的精神文明和物質(zhì)文明都是十分有益的。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，但不限于實(shí)施例。
實(shí)施例1、制備檢測(cè)用免疫原及抗原采用混合酸酐法將嗎啡與載體蛋白連接制備嗎啡合成抗原，使用苯鄰二甲酰胺將去甲嗎啡轉(zhuǎn)化成N-(4-溴丁基)衍生物，并使用1-環(huán)己基-3-(2-嗎啡代己基)-碳二亞胺-N-甲-對(duì)位-甲苯磺酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)CMEC),1-巳基-3-(二甲基氨丙基)-碳二亞胺化合物，將其結(jié)合到分子量為10,000或10,000以上的大分子載體上，如BSA,OVA,KLH,免疫球蛋白等生物大分子，PLL等多驟氨基酸，制備出嗎啡抗原。
2、單克隆抗體的制備與篩選1)免疫小鼠及制備脾淋巴細(xì)胞用合成的嗎啡抗原，加0/4mlPBS(PH7.4)與0.4ml完全弗氏佐劑充分混合，并將0.2ml所得乳化液注射到6齡雌性Bab/c小鼠皮下，初次免疫兩周后，再將0.2ml如上法制得的乳化液注入小鼠皮下，再過(guò)兩周后，同法制得乳化液0.5ml注入小鼠腹腔，又兩周后在小鼠尾靜脈注入0.2ml含上述抗原的PBS溶液，三天后從已免疫小鼠的體內(nèi)分離脾臟并擠壓將細(xì)胞分散，將如此得到的淋巴細(xì)胞懸浮于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液MEM中，離心洗滌兩次(1400rpm，6分鐘，37℃)，將淋巴細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)液中，即可獲得細(xì)胞融合的小鼠脾淋巴細(xì)胞；2)細(xì)胞融合收獲處于生長(zhǎng)期小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0懸浮于MEM中，并離心洗滌兩次(1400rpm,6分鐘，37℃)，然后將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)液中，即獲得細(xì)胞融合的小鼠骨髓瘤細(xì)胞；將3.56×108個(gè)述淋巴細(xì)胞和2.71×108個(gè)上述骨髓瘤細(xì)胞置于50ml離心管內(nèi)混合后離心(1400rpm,6分鐘，37℃)，去上清，緩慢加入40％PEG(MD1500)溶液反應(yīng)1分鐘，在旋轉(zhuǎn)離心管的同時(shí)緩慢加入MEM至10ml，離心(800rpm,6分鐘，37℃)，去上清，將細(xì)胞重新懸浮于140mlHAT培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)板上加樣后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5％二氧化碳，95％空氣，濕度100％)；3)雜交瘤細(xì)胞的篩選按上述方法培養(yǎng)2至4周后，用ELISA方法檢測(cè)已證實(shí)有細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)板中的培養(yǎng)物上清液中是否含有抗上述抗原的抗體，結(jié)果在960個(gè)培養(yǎng)板上的小井中有11個(gè)產(chǎn)生了抗體，在這些小井中加入上述抗原后，有8個(gè)能被抗原所抑制，進(jìn)而證實(shí)這8個(gè)培養(yǎng)小井中有產(chǎn)生上述抗原的雜交瘤細(xì)胞；4)雜交瘤細(xì)胞的克隆采用有限稀釋至培養(yǎng)小井的最終細(xì)胞濃度為10個(gè)/ml，從中篩選出1個(gè)細(xì)胞株。再接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml內(nèi)含1個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞株的再克隆，并對(duì)每個(gè)小井的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行抗體ELISA檢測(cè)；5)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體將在含有15％FCS的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的細(xì)胞株的培養(yǎng)細(xì)胞，移入不含F(xiàn)CS的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至幾乎所有細(xì)胞死亡，對(duì)其培養(yǎng)液進(jìn)行離心得到含的單克隆抗體的上清液，并對(duì)抗體進(jìn)行純化鑒定；6)在小鼠腹腔內(nèi)大量產(chǎn)生單克隆抗體分別將懸浮有2×106細(xì)胞株的PBS溶液0.5ml注入6周齡雌性Bab/c小鼠的腹腔內(nèi)，約一周后小鼠體重顯著增加，于注射細(xì)胞后的第7、9、11天用注射器收集腹水，離心得到腹水的上清液，并對(duì)腹水上清液進(jìn)行抗體含量檢測(cè)。
3、制備兔抗合成的嗎啡抗原的免疫血清；將含嗎啡合成抗原用生理鹽水混合稀釋至總量2ml，注射進(jìn)體重2kg左右的雄性大耳白兔腹腔，兩周后再次免疫一次，檢測(cè)兔血清針對(duì)此抗原的抗滴度后，采用頸動(dòng)脈放血收集血液，4℃存放過(guò)夜后分離血清凍存，對(duì)抗體進(jìn)行純化。
4、膠體金抗體的制備采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，取1％HauCl4(名稱(chēng))水溶液1ml，加重蒸餾水至100ml，迅速加入枸櫞酸三鈉水溶液2ml,5分鐘后出現(xiàn)橙紅色，制得的膠體金16nm，按1∶1比例與單克隆抗體溶液在磁性攪拌下混合，10分鐘后再加入50g/l牛血清白蛋白水溶液至終濃度為10g/l，用終濃度為0.05％PEG穩(wěn)定標(biāo)記后的膠體金顆粒，于4℃下1500r/min 1小時(shí)，濃縮純化離心兩次，沉淀物保存于原體積5％的保存液(0.01mol/l,PH7.2PBS溶液，含0.5mg/mlPEG溶液，含0.5mg/mlPEG和1/10000NaN3)中于4℃保存。
5、檢測(cè)試紙條的制備與使用將兔抗血清IgG等量混合后，用不同含量抗體以0.5μl/點(diǎn)打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于3％牛血清白蛋白內(nèi)37℃封閉2小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗3次，室溫涼干，4℃密保存；在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST(150mmol/l NaCl,25mmol/l Tris,PH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20μl，加入抗嗎啡的單克隆抗體標(biāo)記的膠體金溶液共50μl，室溫涼干，4℃密封保存；分別取0.5×2.5厘米大小的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和0.5×3厘米大小的空白硝酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在0.5×8厘米的硬紙片上，共中空白端為樣品加入端。
取可疑尿液作為樣品，浸濕試紙條的樣品端，陽(yáng)性者試紙條內(nèi)膠體金單抗區(qū)域呈紅色圓點(diǎn)，陰性者試紙條內(nèi)膠體金單抗區(qū)域則不出紅色圓點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種嗎啡、海洛因及鴉片快速檢測(cè)試紙條，其特征在于用單克隆抗體技術(shù)及金標(biāo)免疫分析法制備而成，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出吸毒者體內(nèi)的微量嗎啡，并有較高的特異性和靈敏度。
2.按權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于按以下步驟制得1)制備檢測(cè)用免疫原及抗原采用混合酸酐法制取嗎啡抗原；2)單克隆抗體的制備與篩選用合成的嗎啡抗原免疫小鼠，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞接種于甲基纖維素培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移克隆、篩選等步驟，最終獲得抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株；3)制備兔抗合成的嗎啡抗原的免疫血清；4)制備膠體金標(biāo)記抗體采用枸櫞酸三鈉法制備膠體金顆粒，按比例與合成的嗎啡抗原的單克隆抗體混合進(jìn)行標(biāo)記；5)檢測(cè)試紙條的制備選擇適當(dāng)?shù)臐舛葘⒚庖哐蹇贵w和金標(biāo)記抗體分別固定于不同的載體上，經(jīng)粘合、切割等步聚制備成檢測(cè)試紙。
3.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于采用混合酸酐將小分子量嗎啡與大分子載體連接制備嗎啡合成抗原。
4.按權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于檢測(cè)紙條的制備還可是將不同含量抗體以0.5-1.5μl/點(diǎn)打點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，超凈臺(tái)內(nèi)室溫風(fēng)干，將膜置于1-6％牛血清白蛋白內(nèi)37℃封閉1-3小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗數(shù)次，室溫涼干，4℃密封保存；在另一硝酸纖維素膜免疫條帶上加入TBST20-50μl，加入抗嗎啡的單克隆抗體標(biāo)記的膠體金溶液20-60μl，室溫涼干，4℃密封保存，分別取大小適合的上述兩種硝酸纖維素膜免疫條帶和大小適合的空白梢酸纖維素膜條帶，按空白、膠體金單抗和血清抗體的順序粘接在大小適合的硬紙片上，其中空白端為樣品加入端。
全文摘要
本發(fā)明是一種嗎啡、海洛因及鴉片快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。其特征在于用單克隆抗體技術(shù)及金標(biāo)免疫分析法制備而成,能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出吸毒者體內(nèi)的微量嗎啡,并有較高的特異性和靈敏度。本發(fā)明的快速檢測(cè)試紙條具有高度的特異性和靈敏度,還具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性好,并且不用特殊儀器,費(fèi)用較低廉,操作簡(jiǎn)便易學(xué),短時(shí)同內(nèi)就能判讀結(jié)果,可滿足現(xiàn)場(chǎng)篩檢的要求等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1307236SQ0011268
公開(kāi)日2001年8月8日 申請(qǐng)日期2000年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月2日
發(fā)明者謝伯林, 徐林, 楊上川, 郭仁, 彭小忠, 張翔 申請(qǐng)人:昆明廣博科技有限公司